中国医学科学院医学实验动物研究所，北京协和医学院比较医学中心；卫生部人类疾病比较医学重点实验室，
实验动物主要分为3类，即常规实验动物，自发突变实验动物和基因工程实验动物。实验动物模型对生命科学、医学等相关学科的发展具有重要的支撑作用。中国实验动物科学起步较晚，但随着国家科研经费投入的增加，中国逐步形成了自己的研发体系和实验动物资源，在特定领域有超过美日的趋势。本文概括介绍了国内外常见实验动物模型，旨在为促进中国实验动物学科的发展提供参考。关键词 实验动物；基因工程动物；疾病动物模型；人源化动物模型

 生命是“能够自我营养并独立生长和衰败的力量”，这是亚里士多德（Aristotle，公元前384—322）通过动物、植物的研究对生命的哲学概括。动物也成为古代先哲们探索生命奥秘的主要对象之一，盖伦（Galen，公元130—200）开创了动物解剖学和实验生理学，他将来源于动物的知识推广到对人体的认识，推动了医学的发展，并影响了整个中世纪。利用动物研究生命的本质并类推到人类，加深对人类自身的生、老、病、死等过程的理解和防控，这也是现代实验动物科学的核心价值和实验动物对人类的奉献。

   近代是“实验用动物”过渡到“实验动物”的时期。一些生命科学和医学史上里程碑式的研究成果，如路易·巴斯德（Louis Pasteur，1822—1895）利用犬对天花疫苗的研究，伊凡·彼德罗维奇·巴甫洛夫（Иван ПетровичПавлов，1849—1936）利用犬对神经反射的研究，托马斯·亨特·摩尔根（Thomas Hunt Morgan，1866—1945）利用果蝇对染色体的研究等，采用的都不是专门繁育的用于实验研究的动物，可以简单称之为实验用动物。

 直到20世纪50年代，科学界才意识到动物来源和品质（遗传背景和微生物背景）对科学实验的一致性十分重要，美国、英国、德国等纷纷建立了专门生产实验动物的中心或研究所，提供遗传背景和微生物背景得到一定控制的专门用于科学实验的动物，称为实验动物（laboratory

 从19世纪开始培育不同毛色的小鼠，科学家在不断积累实验动物的物种和品系。目前，全球实验动物已扩展到线虫、果蝇、蟾蜍、斑马鱼、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、犬、猪、猴等不同进化地位的物种。在大、小鼠等常用物种中，又培育出3000余种不同生理特点的品系。随着基因修饰技术的出现和不断发展，转基因、基因敲除大小鼠品系已经超过20000个，基因修饰兔、猪、犬、猴等也相继出现，成为开展生命现象研究、疾病机制研究、药物评价等不可或缺的研究资源[1-3]。

 美国是实验动物科学发展水平最高的国家，美国政府将实验动物列为生命科学、医药等研究领域的基础资源，每年由国会，或美国国立卫生研究院（NIH）拨款，进行实验动物资源的收集、培育和保存。美国保有全球实验动物资源的70%。英国、德国、法国等与美国形成了比较畅通的共享机制，形成了欧美实验动物资源共享板块，极大地促进了美欧的生命科学研究；日本也建立了相对独立的实验动物研究与保种体系，培育了一些特色实验动物品系，形成了自己的实验动物资源与欧美有比较畅通的共享机制；中国实验动物科学起步较晚，与美日共享渠道不是十分畅通，但随国家科研经费投入的增加，中国已逐步形成了自己的研发体系和实验动物资源，在特定领域有超过美日的趋势。

   实验动物可以概括地分为3类，即常规实验动物、自发突变实验动物和基因工程实验动物。

   和)，主要保存在南京大学和中国医学科学院医学实验动物研究所。科学家在心脑血管、代谢、神经系统研究方面可以选接基因编辑大鼠，并促进中国这方面的创新研究。

   通过诱导或基因改变使实验动物再现人类疾病的部分或全部的发生、发展过程的致病动物即人类疾病动物模型。人类疾病动物模型可分为遗传型和非遗传型两类。疾病动物模型是研究人类疾病机制、治疗、药物评价等不可或缺的条件。

   非遗传型疾病动物模型是通过常规实验动物的病原感染、手术、化学诱导或物理诱导等技术手段使实验动物发生疾病。遗传型疾病动物模型是自发突变、诱导突变或利用基因工程技术对基因组进行修饰，而引发特定疾病的一类实验动物，这类动物已经培育为稳定遗传的品系，可长期繁育。

   疾病动物模型种类繁多，由于人类疾病病因的复杂性，同一种疾病可能对应多种疾病模型，自发突变、诱导突变、基因工程疾病模型超过1000种，非遗传型疾病动物模型更多，几乎涵盖了主要的人类疾病类型。

 肺结核、病毒性肝炎、艾滋病、流感和一些新发再发传染病，例如手足口病、寨卡病毒病等是威胁人类健康的主要病种。重大传染病动物模型主要有3类，第1类是利用常规实验动物进行感染，例如，利用雪貂（呼吸道表达与人类相似的流感病毒受体）建立的流感动物模型[9]。利用大鼠、小鼠、豚鼠或恒河猴感染结核杆菌建立的结核模型，利用土拨鼠感染土拨鼠肝炎病毒建立乙肝模型等。第2类是病原修饰后感染常规实验动物，例如艾滋病，人类的艾滋病病毒（HIV）很难感染动物并发生病理表型，通过基因工程将猴免疫缺陷病毒（SIV）与HIV重组，形成一种既能感染恒河猴又具备部分HIV遗传信息的嵌合病毒，建立可以模拟艾滋病的猴模型[10-13]。第3类是转基因动物模型，将病毒的DNA插入到动物的基因组，使动物表达病毒，克服人类病毒不能感染动物的问题，比如1.3拷贝乙型肝炎病毒（HBV）转基因乙肝小鼠[14]。另外，病原受体人源化和细胞人源化传染病动物模型正在兴起。目前，中国主要的传染病模型有100多种（主要资源保存在医学科学院，医学实验动物研究所），中国传染病动物模型和基于动物模型的机制研究方面处于国际领先地位。

 肿瘤是造成病死的第二大疾病，肿瘤疾病模型主要用于肿瘤的发病机制研究、药物筛选、临床个性化治疗等领域。肿瘤动物模型可分为4类。第1类是长期培育而建立的肿瘤高发实验动物品系，例如，C3H/He小鼠，雌性在6月龄乳腺癌发病率可100%，是良好的研究乳腺癌的模型。第2类，是致癌剂诱导的肿瘤模型，例如，给大鼠饮用或注射甲基卞基亚硝氨（NMBzAz）可诱导大鼠食管癌模型，再现食管增生到癌变的病理过程。第3类是基因工程肿瘤模型，通过转基因高表达癌基因而致癌，或敲除抑癌基因而致癌，比H-ras 基因敲除小鼠并发多器官癌症。第4类是移植肿瘤模型，一种是将动物的肿瘤细胞移植在同品系动物的皮下或特定组织，形成皮下或原位的同种移植肿瘤，例如小鼠黑色素瘤抑制模型和小鼠乳腺癌抑制模型都是目前常用的同种移植肿瘤模型，另一种是将人类的肿瘤细胞移植到免疫缺陷的小鼠或大鼠皮下或特定组织，形成皮下或原位的异种移植肿瘤。中国采用的免疫缺陷小鼠主要是BALB/c-nu裸鼠（T，B细胞缺陷），裸鼠允许大部分人类肿瘤细胞生长可用于制备异种移植肿瘤模型，是目前应用最广泛的肿瘤模型。另一种比较常用的是非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠（T，B和NK细胞缺陷），也可用于制备大部分人类肿瘤的异种移植肿瘤模型，异种移植肿瘤模型是目前使用最广泛的肿瘤动物模型。

受体基因，即NSG小鼠，与NOD/SCID相比，患者的肿瘤组织更易在NSG小鼠体内生长从而形成移植瘤模型。该模型已用于对不同患者的化疗方案优化，即个性化治疗。

 心脑血管疾病是造成病死的第一大疾病，包括高血压、脑卒中、冠心病、动脉粥样硬化、肥厚性心肌病、扩张性心肌病等。心脑血管病模型主要分为诱导模型、手术模型、自发品系和基因工程模型等几类。常用的自发突变和转基因模型包括自发性高血压大鼠（SHR）、高血压易感基因和心肌病易感基因等转基因小鼠、大鼠、兔等上百个品系。诱导模型和手术模型在心脑血管病研究中应用十分普遍，常用动物包括大鼠、兔、小型猪等，例如高脂饲料诱导动脉粥样硬化兔模型、栓塞法制备脑卒中大鼠模型、冠状动脉结扎制备大鼠心肌缺血模型等。

   小型猪的心脑血管系统的解剖结构、器官大小、血管内皮特性与人类相似度比啮齿类更高，近年心脑血管病小型猪模型的开发受到更多研究者的重视。比如异丙肾上腺素和垂体后叶素诱导急性心肌缺血模型，阿霉素诱导心肌梗死模型和冠脉结扎急性心肌缺血模型等已经在心脑血管疾病研究和药物筛选中得到应用。

 以肥胖症和糖尿病为主的代谢病，不仅严重影响健康，肥胖还是心脑血管病、痴呆症等多种疾病的危险因子。代谢病动物模型主要包括饮食诱导模型、自发品系和基因工程模型等几类，目前常用的肥胖和糖尿病动物模型食物诱导、化学诱导或物理诱导方法10余种，一般采用大、小鼠和小型猪造模，如食物诱导大鼠、小型猪肥胖模型，化学或物理损伤下丘脑造成的无节制进食下丘脑性大鼠肥胖模型，链脲毒素（STZ）诱导1型糖尿病大鼠模型等。常用的自发突变模型和基因工程模型近20种，db/db和ob/ob肥胖和2型糖尿病小鼠品系，Zucker 2型糖尿病大鼠，瘦素受体敲除肥胖和2型糖尿病大鼠等，NOD1型糖尿病小鼠等。

 阿尔茨海默病（AD）和帕金森病（PD）是最主要的2种退行性神经病。PD动物模型主要是化学诱导神经元的毁损模型和转基因模型2类，主要以大鼠和非人灵长类造模，例如在大鼠或恒河猴的黑质或内侧前脑束定点注射6羟多巴胺（6-OHDA）或者1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）等，造成脑黑质多巴胺能神经元的渐进性死亡而形成PD 模型[15]。常用的转基因PD模型有人α-突触核蛋白A53T突变基因的转基因小鼠和大鼠。目前国际上也在开发人α突触核蛋白A53T突变基因的转基因猴模型。

等不同突变和几种基因联合的转基因大小鼠模型接近100种，中国最常用的是app 和ps1 双转基因小鼠模型，app、ps1、tau 三转基因小鼠模型。中国也开发出了app、ps1、tau 三转基因大鼠模型。AD的病因复杂，目前正在开发代谢和免疫相关的AD模型。猴和小型猪AD模型也是AD研究的热点之一。

   精神病是严重的心理障碍导致认知、情感、意志、动作行为等心理活动持久的异常。包括精神分裂症、偏执、自闭、抑郁等。人类情感活动复杂，用动物模型模拟精神病面临的困难较多，一方面是模型的制备困难，一方面是动物的情感活动分析困难。

 抑郁症已经成为文明社会的主要疾病，患病率高达5%。目前抑郁症模型的制备主要采用极端条件下使动物产生强烈的失望情绪而导致抑郁，比如，对大小鼠采取倾斜鼠笼、禁水禁食、热应激、昼夜颠倒，强迫游泳、悬尾、无预知的足底电刺激等，或切除嗅球等。研究者更倾向于使用非人灵长类制作抑郁模型，例如在一个恒河猴家族中，处于社会底层的个体会表现抑郁症。

 自闭症是影响儿童健康的主要精神病之一，发病率高达1%，表现为言语发育和交往障碍、兴趣狭窄和行为异常，部分伴有精神发育迟滞，目前主要采取训练干预，尚无有效治疗方法。中国科学家最近建立了国际第一种转基因猴自闭症模型[16]，将与自闭症相关的MECP2基因转入到猴的基因组，使MECP2在中枢神经高表达，转基因猴具有人类自闭症的临床表现。这一模型的建立可能对攻克自闭症具有重要意义。

   3 基因工程动物是阐述基因组功能的遗传资源

 随着人类基因组计划的完成，关于人类基因的研究进入后基因组或功能基因组时代，即深入了解基因功能和基因的相互作用。只有完全了解基因功能和基因的相互作用才能真正意义上了解基因组，解开生命的密码。功能基因的研究任务和工作量远大于基因组计划。了解基因功能的主要方法是对实验动物进行基因编辑，研究基因缺失与表型的关系，从而确定基因的功能，功能基因组研究需要系统、全面的基因工程动物模型作为研究资源。目前采用的实验动物主要是线虫、果蝇、斑马鱼和小鼠，也称模式动物。利用转基因、基因打靶、基因编辑等技术已经产生大量的基因工程动物，并且仍在快速的积累之中。尤其是CRISPR/cas9基因编辑技术的成熟，使基因工程动物模型制备的周期大大缩短，可以编辑的物种也扩展到大鼠、小型猪、犬、猴等实验动物。基因工程模型资源的积累将极大的促进功能基因组的研究，同时也将带动人类疾病动物、疾病机制、药物等领域的发展。

 实验动物与人类基因组、基因调控、细胞类型、器官结构与组成、疾病类型等方面是有一定差别的，如何提升动物模型与人类疾病的相似性是实验动物科学根本追求之一。近年实验动物研究的一个热点是实验动物人源化[17-18]，期望通过实验动物人源化在一定程度上提升动物模型与人类疾病的相似性。实验动物人源化的发展主要得益于基因编辑技术和干细胞培养技术的进步。实验动物人源化有2种方式。

 一种方式是基因人源化，将人类的抗体、病原受体、药物代谢基因等敲入到动物（主要是大小鼠）基因组中，代替动物原有的基因，使动物可以分泌人类抗体、可以感染人传染病病原、可以与人类有相似的药物代谢行为和毒理表型。用于人源化抗体生产、传染病模型制备、靶点药评价或药物安全评价等。另一种方式是细胞人源化，在免疫缺陷的动物中，例如NSG小鼠或严重免疫缺点大鼠，注射一定数量的人类细胞，或干细胞，使动物的组织有一定量的人类细胞，形成细胞人源化动物模型，比如血液组织人源化的小鼠可以感染HIV，肝组织人源化小鼠可以感染HBV等。尽管实验动物人源化仍处于研发阶段，但是已经展示了广泛的应用前景，会有更多的人源化模型涌现。

 中国实验动物科学起始于20世纪80年代，晚于西方科学发达国家100多年，但很快完成了主要由引进到研发的历程。中国在实验动物资源总量、质保体系、实验动物质量方面有很大的提高空间。现在中国实验动物年使用量接近2000万只，成为国际第二大实验动物生产和使用的国家。尤其是基因编辑技术引发的新一轮基因工程动物研究中，基因编辑大鼠、犬、猪、猴等模型的研制都是中国首先报道的，中国在基因编辑动物研究方面已经国际领先，实验动物模型对中国生命科学和医学的支撑作用将越来越大。

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Science特刊【神经退行性疾病】之三 | 阿尔兹海默症：遗传风险向机制和药物靶标的转化
Science特刊【神经退行性疾病】之一 | “睡得不好”导致的大脑类淋巴系统“故障”会引发痴呆；

截至目前，全世界痴呆症患者的数量已略超过癌症患者，并有望在未来几十年内进一步增加。然而，痴呆症是包括阿尔兹海默症（Alzheimer’s Disease, AD）在内的多种大脑疾病终末症状的术语，许多研究已将AD的定义与痴呆混为一谈，先前对AD发病机制和药物靶点的不恰当解释可能导致该领域长期以来存在争议。因此，在正确的病理背景下研究AD显得尤为重要。鉴于AD的高遗传力，研究遗传风险似乎是鉴定其分子机制的更可靠方法。但是，中心问题是是否仅存在一条通往揭示AD真相的唯一路线，还是存在多种致病性机制最终共同指向淀粉样斑块和神经纤维缠结的病理改变？
的综述，作者在这篇文章中通过分析AD遗传风险的不同形式，强调在正确的细胞类型和病理背景下研究基因变异的重要性，并提出缺乏对AD遗传变异机制的理解已成为寻找新药靶标的主要瓶颈。
遗传力（heritability），定义为由于遗传因素引起的表型变异的比例，可以用作基于人群的疾病风险度量。目前在AD中研究较为完善的风险遗传变异是编码淀粉样蛋白前体蛋白（amyloid precursor protein, APP）和早老素1和2（PSEN1 / 2）的完全外显突变。它们影响淀粉样蛋白β（amyloid β, Aβ）肽的加工，提示Aβ肽聚集是AD发病进程中的上游事件。然而APP和PSEN1 / 2突变只能解释这些早发性AD（<65岁）病例中的约10％，其余的遗传力可以通过编码SORL1，TREM2， ABCA7等基因中的稀有变体数目的增加，或者一些尚未鉴定的可能为隐性的突变来解释。
相比于早发性AD的高遗传力（0.92~1），在65岁后痴呆发作的一大批患者中遗传力仍较高，约在0.58至0.78之间，这在所有迟发性疾病类型当中，是很高的数字。然而这些AD患者的遗传结构远未完全阐明，载脂蛋白ε 4等位基因（APOE4）是目前唯一常见的高风险遗传变异。全基因组关联研究（GWAS）进一步鉴定出许多常见低风险遗传变异。如宽置信区间所示，与许多多基因疾病一样，AD的遗传力估计仍不准确。为了解决AD中的“错失的遗传力”，需要创建更大的GWAS数据集并开发新的数据分析方法（见图1）。
图1，AD的危险因素和遗传力
二、从遗传力到发病机制
将遗传信息转化为发病机制并非易事，例如AD致病突变破坏早老素的稳定性，从而导致长Aβ肽的过早释放这一研究成果就曾花费二十年。此外，关于AD的大多数可用遗传信息仍不准确，致病变异仅占GWAS已鉴定的基因座中的40％。解决这一转化难题的核心在于找出是哪些“中心”基因对疾病进程产生直接影响？不幸的是，超过70％的决定表型的变异都位于“外围”基因中，这类基因仅对核心基因产物的表达或翻译后修饰具有间接影响，对于定义驱动表型的分子机制并不是十分有用。由于存在很多这样的“外围”基因，它们仍占据遗传力的绝大部分。因此，AD中的大部分遗传信息可能仅间接指向疾病的关键生物学途径。
其中一组外围基因特别受到关注，这些基因可以编码如转录因子和染色质修饰剂，从而调节几种疾病核心基因的表达或功能。例如，AD风险基因座Spi-1原癌基因（Spi1）编码转录因子Pu.1，后者可以调控许多小胶质细胞基因，参与AD的炎症作用。而这样的主要调节基因通常处于强大的进化约束之下，因此在GWAS中不容易被发现。
研究人员可以尝试探索外围基因如何影响核心基因的表达，而先决条件是了解这些外围基因在哪些细胞中发挥作用，因此单细胞分析便显得至关重要。然而，这种反式表达数量性状基因座（transexpression quantitative trait loci, trans-eQTL）映射需要庞大的数据集，并且仅可用于外周血细胞。另一种可能性是关注对遗传力有重大影响的基因变异，APOE4是AD中的唯一示例。
三、APOE基因座的复杂性
APOE的三个主要同工型（ε2，ε3和ε4）由第4外显子内的两个单核苷酸多态性（SNP；rs429358和rs7412）来定义。其中，ε4等位基因使得罹患AD的风险增加了3倍，甚至于在ε4纯合子中增加14倍。相反，ε2等位基因可降低1.7倍的罹患AD的风险。此外，这种风险的易感性与性别和种族背景密切相关，例如女性比男性更易患病， ε4效应在非裔美国人和西班牙裔人口中要小得多，这些数据说明在研究AD的遗传力时多种族遗传研究的重要性.
APOE基因座非常复杂，跨度接近2 Mb，并涵盖70多个基因。尽管与ε2和ε4的APOE SNP的连锁不平衡程度较低，在这个巨型基因座中仍有许多其他SNPs与AD显著相关，这可能指向该基因座中的其他AD风险基因，且其中一些SNPs可能会影响APOE的表达。需要注意的是，理解这一点将具有巨大的价值，因为它阐明了该多功能蛋白的上调或下调在什么条件下会影响AD的致病风险。
尽管APOE与AD之间存在强相关性，仍不清楚其在脑部炎症中的作用。
已知APOE在胆固醇转运和脂质稳态中发挥不可替代的作用，此外，在Aβ的聚集，清除和细胞摄取，以及一些少为人所知的分子途径，例如突触数量和功能，血脑屏障完整性，TAU介导的神经变性中也发挥作用。但是，理清APOE的哪些作用与AD直接相关是很重要的，APOE缺陷在把不同细胞和组织类型中引起的效应不同提示APOE基因只是AD主要的外围调节基因，并非所有受影响的途径均与AD相关。因此，直接针对APOE来预防AD可能会产生多种附加影响，且此类治疗效果也需要格外仔细监测。
四、因果：高风险和保护性变体参与APP处理和小胶质细胞功能
等位基因系列中基因型-表型剂量反应的证据强有力支持了核心基因功能，在参与Aβ产生的基因观察到这种基因剂量效应，例如APP基因重复可导致AD。其隐性（A673V）和保护性（A673T）等位基因可以影响Aβ聚集的倾向，A673T还降低了APP的β-分泌酶处理。SORL1提供了与AD风险增加的另一个等位基因系列示例。SorlA通过将APP重定向到细胞膜和反高尔基体网络以及将Aβ重定向到神经元的溶酶体来降低Aβ的产生。
值得注意的是，人类小胶质细胞中SORL1的表达水平相较于小鼠而言高约20倍，从而有力地证明了SORL1缺乏对小胶质细胞功能的影响。常见和罕见的ABCA7变体提供了第三个等位基因系列。ABCA7可以促进磷脂流出细胞，其蛋白截短和错义突变均与AD相关。
此外，内含子18中的串联重复序列（范围从300个碱基对到10 kb以上）也与较高的AD风险相关。尚不清楚ABCA7功能丧失如何增加AD的风险，但在小鼠中确实会导致与巨噬细胞和小胶质细胞中Aβ吞噬功能受损有关的Aβ斑块负荷增加（见图2）。
除了影响Aβ加工的核心和主要调控基因外，有力的遗传学证据小胶质细胞中表达的基因中存在许多与AD风险相关的常见变体，例如TREM2，PLCG2和ABI3的开放阅读框中的罕见错义突变。值得注意的是，当直接比较一种Aβ模型和一种TAU模型时，可以发现当暴露于Aβ时，许多AD风险基因在小胶质细胞中表达上调，但在TAU中则不那么明显。在上述三种基因中，研究最为深入的为TREM2基因，TREM2是阴离子配体的受体。在AD小鼠模型中，Trem2对于小胶质细胞从稳态转移到活化状态以响应于淀粉样蛋白斑块是必要的。Trem2缺乏导致更多的斑块扩散，小胶质细胞向淀粉样斑块的募集减少，造成更严重的神经损伤。
TREM2的稀有Arg47→His（R47H）和更常见的R62H变体会改变其稳定性，并损害TREM2对APOE，ApoJ，低密度脂蛋白和Aβ的亲和力。由于R47H和R62H突变导致TREM2功能部分丧失，并且由于Trem2缺乏似乎加重了小鼠的淀粉样斑块病理，因此大多数药物开发工作都集中在增强TREM2功能上。但是需要认识到增强小胶质细胞活性可能是一把双刃剑，此外需要考虑，在多大程度上可以将小鼠的观察结果推论到人类的病理生理学上？与小鼠模型相比，人类中淀粉样斑块周围的细胞反应要复杂得多。
综上所述，AD的遗传学研究为在早发和迟发性疾病中起作用的以Aβ生成，聚集和清除为中心的主要途径提供了有力证据，也强烈暗示小胶质细胞对AD中淀粉样蛋白斑块的反应。假设这些反应是由患者的遗传风险所决定的，则可以预见到一些患者由于其有利的小胶质细胞而免受淀粉样蛋白斑块引起的损伤。该领域的主要问题是小胶质细胞对淀粉样斑块反应哪些方面是有益的而哪些是有害的？遗传风险如何影响这种平衡？考虑到AD中这种细微的细胞内阴阳反应，药物开发必须谨慎行事。
AD遗传风险的绝大部分是由基因组中的常见变异所解释，并被GWAS中的SNPs捕获。此类单一变体本身无法预测个人患AD的风险，但可以组合成多基因风险评分（polygenic risk score,PRS）。PRS是定义为个体携带的SNP风险等位基因数量的总和，以其对疾病风险的贡献（效应量）加权的“遗传评分”。目前，大多数研究人员在40个典型GWAS基因组基因座中使用由主要SNP计算的部分AD PRS。但是，更完整的PRS计算包括位点中与AD风险相关但未达到全基因组显着相关性阈值的其他SNP。使用完整的PRS进行AD的预测准确性很高，临床上接受者-操作者曲线下的面积（area under the receiver-operator curve, AUC）为75％，经病理证实的样品为84％。仅使用典型的GWAS基因座会使得分偏向APOE区域的效果，如果按照完整PRS的建议使用AD的所有遗传风险，则相关的小效应大小的SNPs最终将胜过仅有APOE基因座的效应大小。因此，在病理学证实的APOE3纯合子中，完整PRS的预测准确性很高。然而迄今为止，由于缺乏多民族的GWAS数据，PRS方法大部分仅在欧洲人群中进行了评估。
六、从多基因风险到疾病和药物靶向机制：细胞状态和疾病背景至关重要
针对由遗传证据支持的靶标开发的药物更有可能获得批准。但是，在AD领域，“因果”SNPs在许多情况下是未知的，将遗传学信息转化为药物的最重要限制因素是缺乏良好的AD模型。
评估非编码风险变体的功能影响是具有挑战性的，并且由一个特定的SNP是功能性的，还是仅与真正的功能性SNP处于连锁不平衡的问题出发。风险机制只会在与疾病相关的状况中表现出来，因此，在分析SNP的功能后果时，细胞类型和实验环境尤为重要。此外，在基因组的线性DNA序列表示中，SNP经常被分配给最接近的基因，然而，染色质具有复杂的三维结构，增强子或抑制子可对远离其位置的基因表达发挥作用。最近的工作表明，许多因果变异会影响对大脑区域，细胞类型和细胞状态高度特异性的增强子，需要注意的是，与AD相关的变异体主要是髓样和小胶质细胞增强子区域，而不是启动子区域。Nott等人在人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells, iPSC）中删除了BIN1增强子，该增强子携带有AD高风险变体rs6733839，然而当作者将这些细胞分化为小胶质细胞，星形胶质细胞和神经元时，BIN1的表达仅在小胶质细胞中受到影响。
AD领域确实很难产生能够重现疾病所有特征的良好模型，要模拟人类AD中存在的淀粉样蛋白斑块和缠结，就需要过表达人类TAU，PSEN和APP且都带有家族性AD或额颞变性突变的双甚至三重转基因小鼠，并且这些小鼠将在何种程度上诱导细胞表型以模仿人类的处境，仍是极具挑战性的问题。在对人类多基因疾病进行建模时，不能忽略六千五百万年的进化差异。关于人类特异性细胞生物学，有关人类iPSC的研究已经展开，包括体外3D和类器官培养等，然而每种方法都有其自身的优势和局限性（见图3）。
图3，AD研究中常用模型的优势和局限性
截至目前，在绘制AD的遗传图谱方面已经取得了巨大进展，然而“数量”永远不会取代“质量”，需要更深入的临床表型和生物标记物才能更好地解释基因变异在AD表型特定方面的作用。值得注意的是，在功能层面上，研究人员需要摆脱一种基因，一种功能，一种药物靶点的经典分子生物学范式。基因变异会影响特定遗传背景，特定细胞类型，特定细胞状态以及疾病特定阶段的基因功能。在计算机模拟中和简单的细胞生物学实验中，尽管高通量的方法非常诱人，但也可能非常误导人，并可能危及整个药物开发活动，对诸如AD等复杂的多因素疾病进行药物研发时需要对靶向机制有深入的了解。研究人员可以进一步利用先前完成的遗传学工作来生成更复杂，能更好重现AD发病机制的模型，这将为药物研发打开更多机会，加快从概念到临床的步伐。

一、动物模型和评价方法

（一）自发性或自然发生的模型

Wobbler大鼠是研究较多的一类自然发病ALS模型鼠，该模型出生3~4周后逐渐出现前肢无力，可长到成年，在1年左右死亡，其病变是常染色体突变隐性遗传导致脊髓神经元退行性改变，与ALS疾病的神经元受损和临床表现相似（Boillee等，2003）。已有证据表明Wobbler鼠的氧化应激增强，而抗氧化治疗可以延缓神经元变性并且改善肌肉组织营养。同人类ALS一样，Wobble鼠r也表现出星形胶质细胞的增多和神经元内一氧合酶及GAP-43的增多。因此，Wobbler大鼠模型因其神经元变性的特点，在神经元变性的发病机制尤其在抗氧化机制研究上有很大价值（Dave等，2003）。此外还有3种ALS小鼠模型和1种犬模型，但研究较少。

铝对神经元细胞具有慢性毒性作用，因此可用铝中毒复制ALS动物模型：反复多次将氯化铝注射在兔的枕大池中，可产生慢性神经毒性作用，可见腰脊的前角运动神经元胞体和树突水肿明显，神经微丝沉积，内质网断裂，出现大量的游离核糖体和类脂质物质，并有广泛的包涵体（Kihira等，1995）。BMAA也可产生神经毒作用，动物实验表现出ALS、帕金森样症状和行为异常，病理显示前角运动神经元的染色体溶解（Duncan，1991）。

已有研究发现ALS患者血清和脑脊液中的免疫球蛋白存在异常区域，一些学者研究免疫性运动神经元疾病模型，发现与ALS患者相似的行为学和病理学变化（Smith等，1993）。

转基因鼠可以作为研究家族性ALS的较理想模型，有两种基因型的动物模型：SOD-1基因型和NF基因型。

SOD-1基因被敲除的鼠不能表现相关症状，但是表达人超氧化物歧化酶1（hSOD-1）突变体的转基因鼠可以表现为ALS样临床症状直至死亡。已有超过110种的SOD1基因突变类型被发现，大多是点突变也有产生截短形式的SOD1和氨基酸的插入与丢失。最常用的ALS转基因模型是将表达人SOD1在第93个丙氨酸残基位点被甘氨酸替代的突变体基因转入小鼠后培育而成的转基因小鼠系。这类小鼠模型通常都在出生后3个月开始表现出ALS样的症状，接着在1~2个月死亡，而hSOD-1G93A基因低表达的转基因鼠发病时间会延缓，生存周期一般在8个月（Grieb，2004）。近年来已经建立这个基因的大鼠模型，是较理想ALS研究模型（Julien和Kriz，2006）。

神经元胞体及近端轴突的NF异常堆积可导致富含NF的粗大运动神经元退变（曾常春等，2004）。NF-L转基因小鼠肌肉呈神经原性萎缩，脊髓的运动神经元减少，神经元内充满了异常神经微丝，与ALS改变相似。过度表达NF-L的转基因鼠，表现为进行性步态异常、后肢异常屈曲，病理上大运动神经元和后神经节神经元的胞体和近端轴突中含有大量神经微丝聚集、线粒体功能异常（Robertson等，2002）。在过多表达hNF-H基因的小鼠中，检测到神经纤维的阈值减低，膜静息电位及传导速度均明显减低，动作电位的振幅偏小，动作电位的延续时间反而延长，与ALS疾病时神经表现具有一致性（Kriz等，2000）。

ALS患者特征性表现之一就是异常磷酸化的NF蓄积，因此过度表达神经微丝的动物模型亦常作为ALS的发病机制来研究（Kong和Xu，2000）。

虽然ALS动物模型多种多样，但没有一种动物模型能够完全模拟人类的运动神经元疾病特点。在ALS发病机制没有完全清楚的前提下，根据自身实验特点合理选择所需的ALS模型才能达到研究目的。

在许多药物在转基因动物实验中进行发病前早期干预治疗，而在人类ALS疾病仍然未找到相同时期的特异性标记；因此当动物模型开始表现出发病症状后给药并能多次重复得到的结果将会更可靠（Goodall和Morrison，2006）。

（）作用于谷氨酸系统，通过阻断突触后NMDA谷氨酸受体激活G蛋白依赖的抑制谷氨酸释放过程，抑制谷氨酸的释放。在SOD1突变小鼠的运动神经元培养中发现它阻断持续性钠离子通道（Urbani和Belluzzi，2000），消除运动神经元上过剩的Na⁺流。也激活多种类型的钾离子通道和抑制慢代谢型的电压依赖钾通道。这些效应导致在神经细胞更多的K^＋流而抑制谷氨酸的释放。它还可以使和第二信使相关的鸟嘌呤核苷酸环化酶失活而起起到神经保护作用（Kanai等，2006）。

抗惊厥类药Gabapentin也是一种抗兴奋毒性药，它同一样能够抑制谷氨酸释放而延缓神经元的变性坏死；它可能使更多谷氨酸代谢成γ型氨基丁酸，减少谷氨酸聚积（Gurney等，1996）。

还有许多关于抗谷氨酸类药物的研究，但结果不尽人意，比如抑制谷氨酸释放的Lamotrigine、谷氨酸受体抑制剂dextromethorphan、增强谷氨酸的氧化作用的支链氨基酸、还有Ca²⁺通道抑制剂等（Dib，2003）。

头孢曲松（头孢三嗉）能够通过诱导星型胶质细胞突触前膜上谷氨酸转运体的表达，增强星型胶质细胞对谷氨酸的转运摄取，在ALS转基因小鼠模型上证实头孢曲松能够保存动物模型握力、延缓体重减轻、延长生存期（Rothstein等，2005）。

E和硒联合，能延迟动物模型发病时间（Gurney等，1996）；Carboxyfullerenes可以同时延缓模型发病时间和生存期限（Dugan等，1997）；乙酰半胱氨酸不能延缓发病模型鼠时间，但可改善运动神经元功能和延长生存时间；丙酮酸盐抗氧化性治疗ALS模型鼠，能延长其生存时间（Park等，2007）；以及一氧化氮合酶抑制剂（Chou等，1996），司来吉兰（Selegiline）、DHA－脱氢表雄甾酮、OPC1477等也已用于ALS抗氧化治疗研究。

（三）针对线粒体功能和能量代谢药

线粒体损伤被认为是ALS重要的致病机理之一，形态学研究已经证明在散发型ALS患者的神经组织和非神经组织中均存在线粒体异常（Masui等，1985），如线粒体溶胀和线粒体空泡化。因此针对保护和稳定线粒体功能的药物成为治疗ALS研究点之一。已有研究证实单独应用肌酸即能延长ALS疾病进程（Klivenyi等，1999），而联合其它药物治疗ALS小鼠，则可以达到治疗累加效果（Zhang等2003）。

在ALS模型中，NMDA和非NMDA受体被持续激活，Ca²⁺大量进入细胞内，引起一系列变化导致神经元坏死和凋亡，部分神经营养因子可以拮抗兴奋性谷氨酸毒性，稳定细胞内Ca²⁺水平（Strong等，2008），包括脑源性神经营养因子（BDNF）、神经胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、睫状神经营养因子（CNTF）、血管内皮生长因子（VEGF）（Zheng等，2007）、扎利罗登（Xaliproden，SR57746A）（Meininger等，2004）、paliroden（SR57667B）和Colivelin等。

（五）胶质细胞调节因子

星形胶质细胞功能异常对ALS的致病作用越来越受关注。将突变SOD-1基因转染到星形胶质细胞，并与正常脊髓原代培养运动神经元或者胚胎小鼠干细胞来源的运动神经元共同培养，可以特异性杀死这些运动神经元，这一死亡过程是由可溶性毒性因子通过Bax依赖性机制触发。这提示星形胶质细胞在ALS患者发病过程中，对脊髓运动神经元特异性变性、死亡发挥着独特作用（Nagai等，2007）。动物实验证实COX-2拮抗剂可显著抑制ALS模型鼠脊髓前列腺素E2合成，并且延长其病程（Drachman等，2002），COX-2拮抗剂如塞来考昔（Celecoxib）正在做临床前研究（Shefner等，2007）。

细胞凋亡路径激活是ALS中运动神经元变性重要原因。很多种凋亡抑制剂被用于ALS研究（Kieran等，2007），试图阻断ALS中被激活的多条凋亡途径，如caspase-1途径、caspase-3途径、MAPK途径、p53相关凋亡途径等。米诺环素（Minocycline）（Kriz等，2002）、雷沙吉兰（Rasagiline）（Waibel等，2004）、热休克白诱导因子Armioclomol等都也已在动物实验证实有较好效果。

（一）神经营养因子或抗凋亡基因治疗

一些神经营养因子已经用于ALS转基因模型治疗，且已证实对神经元存活和功能具有积极作用，如IGF-1、VEGF、CNTF（Kaspar等，2003；Pun等，2006）。但是利用传统给药途径将这些蛋白送入体内基本无效（Suzuki和Svendsen，2008）。也有实验（Gill等，2003）利用导管将神经营养因子植入脑或脊髓，但是这种方法较为复杂，还有可能会对神经组织产生再次损伤。将编码生长因子的病毒注射入ALS模型鼠肌肉内，尽管递呈IGF-1和GDNF获得较好结果（图9-1），但毕竟在疾病发展中受损神经元已经和肌肉分离（图9-2），还有学者（Guillot等，2004）通过病毒将生长因子直接呈递到脊髓的运动神经元，这样在肌肉合成生长因子就不需通过逆向转运到达神经元，同时可提高脊髓对生长因子的摄取潜力从而可以有更多生长因子转运至运动皮层。但GDNF研究发现尽管在变性神经元周围富集很高的GDNF，而发病时间和病程并未延长，甚至效果不如在肌肉表达GDNF（Lepore等，2007）。

ALS重要特征之一就是运动神经元凋亡，对一种广泛应用的运动元神经元疾病的模型—进行性运动神经元病（progressive motor neuron disease，PMN），转入表达抗凋亡的Bcl-2或GDNF基因可预防运动元神经元的凋亡，但对动物的生存期没有影响（Azzouz等，2000）。将抗凋亡基因bcl-2转入ALS模型鼠结果有一定改善。近年来应用重组基因或蛋白技术研究治疗ALS模型的研究总结见表9-1。

（二）RNA抑制基因表达治疗

RNA干扰技术（RNAi）是通过破坏细胞源性的mRNA来阻止相应基因表达，保护细胞免受病毒和其它遗传因子影响（Wang等，2008）。在ALS发病机制中，突变SOD1蛋白是产生神经毒性的来源，因此抑制突变SOD1蛋白表达可能会成为ALS的治疗方式之一。Ralph等（Ralph等，2005）和Raoul等（Raoul等，2005）利用设计的一种慢病毒载体携带特异性抑制突变SOD1的RNAi，并将其注入ALS模型鼠肌肉或脊髓内，检测证实动物体内突变SOD1表达显著减少，脑干和脊髓中运动神经元的存活率明显提高。对动物运动功能检测发现模型鼠的运动能力显著改善，几乎所有ALS鼠发病时间均明显延缓约1倍以上，且生存时间最长可长达正常寿命的80%。

成年大鼠移植胚胎干细胞，移植细胞轴突可延伸至肌肉，并形成神经肌肉接头，发挥生理学作用，并部分恢复身体机能。

将人类NCPS细胞植入SOD1突变转基因大鼠模型中，发现NCPS可以在神经变性的环境中存活，并能有效抑制病变处神经元数量减少，改善机体运动机能，并延长生存周期。分子生物学实验证实，NCPS不能跨越移植区域，但可在移植区域调节拟胆碱标记物，并可分泌GDNF，起到保护濒死运动神经元的作用。

将骨髓细胞腹腔注射入SOD1突变转基因ALS模型小鼠中，能延长ALS鼠生存期、推迟发病时间2~3周。随后进一步证实，骨髓基质细胞移植能改善ALS鼠运动机能，将移植途径由腹腔注射改为静脉注射可更有效延长ALS鼠生存期。将人骨髓基质细胞（hBMSCs）移植入发病前模型小鼠中，移植10周后移植组行为学较对照组有明显改善。

将hUCB移植入发病前转基因ALS模型小鼠中可使可有效延长发病时间达22天，生存期延长21天。SOD1G93A基因突变的ALS小鼠的细胞最佳移植剂量为25×10⁶，较之其他剂量，此剂量的细胞可使移植细胞周围的营养因子生长达到最佳状态，ALS小鼠的生存期延长20%~25%，延缓疾病的发生达15%。

将人的嗅前体细胞（嗅干细胞）移植入发病前的SOD1G93A基因突变ALS模型小鼠的脊髓中。观察其行为学变化发现，植入嗅前体细胞的小鼠在转棒以及斜板实验中表现明显优于未移植组小鼠，运动机能有所好转，体重正常。而非移植组小鼠平均体重则减轻40%。从总体效果来看，移植组小鼠延缓发病时间达117天，平均寿命延长至170天。进一步组织学研究表明，移植细胞在小鼠体内可分化为神经元、神经元样细胞、中间神经元、神经胶质细胞、星形胶质细胞以及少突胶质细胞。分化的细胞可产生轴突，且轴突可进入外周神经，但并未在神经肌肉接头处发现分化细胞轴突。

cells，hNT）移植入SOD1^G93A基因突变ALS模型小鼠的L4~5脊髓前角中，发现移植组小鼠运动行为综合征发作时间延迟，整体运动功能状况有所改善，但并未延长小鼠生存期。发病后的模型小鼠椎管内单点注射hNT神经元虽可以延缓疾病进展但并不能延长其生存期，而对发病前小鼠进行细胞移植则可延长其生存期。在移植区域发现新生神经元，新生数目与植入细胞数目不成依赖关系。移植入模型小鼠体内的细胞纤维可向外周生长，其生长的最大限度为0.15~0.3mm，多数延伸至灰质，移植入的细胞未出现神经炎性。实验证实，塞尔托利氏细胞（sertoli cell）对ALS模型小鼠有明显神经保护作用。