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大鼠灌注固定取脑
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【求助】急求答案！！！请问 取脑组织之前 大家都是怎样灌流的，一定要灌流吗？？
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这个帖子发布于4年零152天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我是要取脑干的NTS 即 孤束核 出来， 咨询了一个老师说要先灌流。我知道有一种比较传统的方法就是 左心室注入生理盐水，右心耳打开 让液体放出，直至流出液体无血色。 我想问这个操作容易操作吗？ 注射时容不容易弄破心脏导致失败？ 有灌过的师姐师兄麻烦给详细指点一下。还有没有其他的更容易的灌流方法呢？还有个问题就是，因为我取出组织不是做免疫组化，是做western blot，这样的话灌流生理盐水之后需要灌 甲醛 吗？多谢！！急求！！
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我也是做孤束核的
就是心脏常规灌流
心底进针灌生理盐水
右心耳放血单做WB就只要生理盐水 不需要多聚甲醛灌了后直接取脑冰冻保存
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czzj12345 我也是做孤束核的
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右心耳放血单做WB就只要生理盐水 不需要多聚甲醛灌了后直接取脑冰冻保存谢谢你！！还有一个问题，老师说灌注后尽量把全脑和脊髓都完整地取出，取出来之后我要放在冰上吗，比如下面一个冰袋，冰袋上一个最小的培养皿，里面装生理盐水，然后再这样的环境下分离出来NTS 是吗？
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涵莅m 谢谢你！！还有一个问题，老师说灌注后尽量把全脑和脊髓都完整地取出，取出来之后我要放在冰上吗，比如 ...最好把全脑都取
不过大体下无法分离孤束核的吧
以闩为平面 切一段延髓就可以了
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czzj12345 最好把全脑都取
不过大体下无法分离孤束核的吧
以闩为平面 切一段延髓就可以了好的，谢谢啦！
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czzj12345 最好把全脑都取
不过大体下无法分离孤束核的吧
以闩为平面 切一段延髓就可以了不好意思，还想问一下 右心耳放血，具体是怎么样的，剪断什么 亦或是 其他什么操作？
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czzj12345 我也是做孤束核的
就是心脏常规灌流
心底进针灌生理盐水
右心耳放血单做WB就只要生理盐水 不需要多聚甲醛灌了后直接取脑冰冻保存你好，我就想取脑组织和肝组织
取完以后 直接提取DNA。这样的话
就应该不需要用多聚甲醛固定了吧 ？
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xiaoqichina 你好，我就想取脑组织和肝组织
取完以后 直接提取DNA。这样的话
就应该不需要用多聚甲醛固定了吧 ？直接生理盐水或者PBS灌注体循环即可
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高胆固醇血症血气及相关指标的变化与葛根素的作用
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高胆固醇血症血气及相关指标的变化与葛根素的作用中文摘要:高胆固醇血症（hypercholesterolemia, HC）是心血管疾病常见的独立危险因素。HC导致的血管内皮功能失调（vascular endothelial dysfunction, VEDF），在许多疾病尤其是心血管系统疾病的发生和发展中起重要作用，是动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）关键的病变环节之一。尽管对HC引致AS的研究已经比较深入，但HC引起VEDF的精确机制、HC对微循环的影响尤其是在早期阶段仍不清楚。因为HC和AS均系全身性疾病，所以其对微循环的影响可能有更为重要的病理生理学意义。然而，由于对该领域的研究为时尚短，加上实验和研究方法的限制，目前对HC影响微血管和微循环的报道资料很少。对HC的医学干预除了应用他汀类等调血脂、抗AS药物以外，尚缺乏其它更有效的医学干预手段。因此，深入阐明HC发生VEDF的机制与危害、探讨HC对微血管及微循环的影响并寻找医学干预新途径有重要的理论意义和临床价值。本研究通过检测血气分析指标，结合生化学和分子生物学的实验方法，探讨兔HC对微血管和微循环的影响，分析HC早期的损害机制，观察葛根素（puerarin, Pu）的干预作用。雄性新西兰白兔随机分为3组：正常对照（normal control, NC）、HC和高胆固醇血症加葛根素处理（hypercholesterolemia and puerarin, HP）组。兔高胆固醇饲料饲养3周造成HC模型，HP组按每天0.2g/kg体重的Pu剂量与高胆固醇饲料同时饲养。3周后检测的主要指标：血清总胆固醇（total cholesterol , TC）水平、动脉和静脉血在静注乙酰胆碱（acetylcholine, ACh）前后共4份血样的氧饱和度（saturation of oxygen, SO2）、氧含量以及氧容量等血气分析指标、ACh介导的离体主动脉环舒张功能和ACh静注后整体降压效应、肾血管通透性、脑组织一氧化氮合酶（nitric oxide synthase, NOS）活性及一氧化氮（nitric oxide, NO）含量、脑组织内皮源型NOS（endothelial nitric oxide synthase, eNOS）mRNA的RTPCR扩增水平以及脑组织超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）活力、丙二醛（malondiadehyde, MDA）含量等。造模结束后，NC组血清TC水平为0.64&0.17mmol/L，HC则高达29.51& 2.94mmol/L，HP组为25.45&3.90mmol/L，说明HC模型形成，Pu有一定的降低血清TC的作用（P&0.05）。血气分析结果显示，3组间动脉血血气指标无显著差异，在静注ACh前HC组静脉血SO2与NC组比较虽有所下降但差异无统计学显著意义，而在静注ACh后NC组和HP组静脉血SO2 和氧含量都显著降低（P&0.05），HC组则降低不明显，提示血液与组织间的氧气交换障碍。虽然在离体内皮完整的胸主动脉环舒张功能实验中，HC组ACh介导的内皮依赖性舒张功能下降未达到统计学显著性，但整体实验静注ACh后的降血压效应则明显减弱（P&0.05），表明HC兔此时主动脉尚未发生明显的内皮功能障碍，但全身的小血管、微血管已出现明显的内皮依赖性舒张功能障碍，故ACh降压效应减弱；Pu可显著增强ACh的降压效应（P&0.05）。肾血管通透性实验显示，HC组肾组织伊文思蓝（evans blue, EvB）染料渗出量比NC组显著增多（P&0.01），说明HC早期就可引起微循环血管炎症性改变，通透性显著增大；HP组EvB染料渗出量无明显增加，表明Pu对HC引起微循环通透性增加有抑制作用（P&0.05）。上述结果表明，在兔HC早期阶段，微循环可能由于血管内皮依赖性舒张功能下降、血管炎症性改变以及血液流变学异常导致氧气从血液向组织的弥散过程受阻，组织可能因摄氧减少发生慢性缺氧或间歇性缺氧，从而引起缺氧和氧化应激等损害，是引发HC早期病变的重要因素。Pu可能通过降血脂、扩张血管、以及改善组织血液灌注等途径产生保护作用。HC组脑组织中总一氧化氮合酶（totalnitric oxide synthase, TNOS）和诱导型NOS（inducible nitric oxide synthase, iNOS）活力都明显增强（P&0.05），RTPCR结果进一步证明eNOS的mRNA扩增水平也显著增加（P&0.05），但NO含量却明显减少（P&0.01）；同时脂质过氧化产物MDA含量增多（P&0.05）。这些结果表明HC早期可诱导NOS，出现NOS酶促生成NO过程脱偶联和氧化应激等现象。因此，根据实验结果和已有的资料推测，HC早期发生氧化应激并上调NOS的活性和表达，但产生的NO被大量的ROS氧化灭活，同时氧化应激也消耗了大量的四氢生物蝶呤（tetrahydrobiopterin, BH4），造成BH4缺乏，从而引起NOS作用发生脱偶联。NOS反应脱偶联和氧化应激同时存在，两者互相影响，形成恶性循环，可能是HC早期损害和VEDF发生的重要机制。Pu明显增加SOD的活力（P&0.05），使NO的含量显著增多（P&0.01），并抑制HC对NOS活性及表达的上调（P&0.05）。以上结果表明Pu具有明显的抗氧化功能，可防止HC引起的氧化应激等损害。综上所述，本实验发现HC早期存在血SO2及氧含量等指标异常，提示组织细胞慢性缺氧或间歇性缺氧；缺氧引起氧化应激，上调NOS活力及表达，导致NOS酶促NO生成过程脱偶联，氧化应激进一步加剧并形成恶性循环；Pu通过扩张血管和抗氧化等作用有效减轻或防止缺氧和氧化应激等损害。精确的机制还有待进一步研究。本成果为进一步阐明HC损害机制、寻找医学干预新靶点、拓宽Pu的临床新用途提供了依据。关键词：高胆固醇血症；缺氧；葛根素；氧化应激；一氧化氮合酶 高胆固醇血症血气及相关指标的变化与葛根素的作用1 前言高胆固醇血症（hypercholesterolemia, HC）是心血管疾病常见的独立危险因素，其对心血管系统的损害是连续的，涉及机制极为复杂。HC初期可引起血管内皮功能失调（vascular endothelial dysfunction, VEDF）、屏障作用削弱导致血脂在内皮下异常蓄积，特别是血中脂质成分被活性氧（reactive oxygen species, ROS）氧化生成氧化修饰的脂类如氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein, oxLDL）危害性更大。 oxLDL进入内皮下即可募集巨噬细胞，巨噬细胞识别并摄取吞噬oxLDL后成为泡沫细胞，分泌一系列细胞因子产生损害，最终发展为斑块和动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）[13]。虽然对HC从初期的VEDF发展到AS已进行了广泛深入的研究，对HC损害大血管及其机制积累了大量的资料，但仍有许多问题有待进一步探讨，尤其是HC早期发生VEDF的机制及其对微血管、微循环的损害目前报道的资料有限。对HC的医学干预除了应用他汀类等调血脂、抗AS药物以外，尚缺乏其它更为有效的医学干预手段。因此，深入阐明HC发生VEDF的机制与危害以及HC对微血管、微循环的影响、寻找医学干预新途径有重要的理论意义和临床价值。一般认为，HC引起VEDF是AS最早的关键病变环节，但HC引起VEDF的精确机制迄今仍未清楚，目前认为与氧化应激密切相关。血管内皮细胞具有复杂的功能，并有自我修复的能力。内皮细胞可通过自分泌和旁分泌产生一系列活性物质，参与调节和维持血液的正常循环。在内皮产生的各种活性物质中，一氧化氮（nitric oxide, NO）对于维持正常的血管内皮调节功能有不可替代的作用，主要包括舒张血管、抑制血管平滑肌增殖、抗血栓、稳定溶酶体膜和清除ROS作用等[4]。因此，VEDF与NO水平降低有密切关系，并将内皮依赖性血管舒张作为评价内皮功能的金标准[5]。NO由L精氨酸（Larginine, LArg）在一氧化氮合酶（nitric oxide synthase, NOS）的催化下产生。NOS酶促生成NO的过程需要四氢生物蝶呤（tetrahydrobiopterin, BH4）作为辅因子，BH4具有促进NO生成和接受电子防止产生氧自由基的作用[6]。HC时BH4生成减少、消耗增加从而引起BH4缺乏，使NOS酶促反应过程发生脱偶联，即LArg氧化生成的产物不是L胍氨酸和NO，而是生成超氧化物阴离子（superoxide, O2&ˉ）。O2&ˉ 能迅速与NO结合，消耗NO并生成毒性更强的过氧亚硝基化合物，后者又能迅速将BH4氧化，形成恶性循环[78]。有研究表明，HC能激活尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH）氧化酶，促进O2&ˉ的大量产生，从而引起或加重机体的氧化应激损伤[9]。此外，HC也可促进粘附分子如P选择素[10]、细胞间粘附因子（intercellular adhesion molecule1, ICAM1）的表达[11]，导致血液粘滞性增加、血细胞粘附聚集及血管组织炎症反应；促进血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）的表达[12]引起血管内皮细胞增生及微血管通透性增加等，这些均与VEDF有密切关系。因此，HC引致VEDF可能是多因素综合作用的结果。因为HC和AS均系全身性疾病，其对微循环的影响不可忽视。已有研究发现，HC时出现的氧化应激可引起微循环炎症性反应[13]、血液流变学改变[14]、微动脉对内源性血管舒张物质反应性减弱[15]及对血管收缩物质反应性增强[16]等。这些变化有可能造成血液与组织间的氧气交换障碍，导致组织和内皮细胞发生慢性或间歇性缺氧。近年来，缺氧引起内皮功能损伤已逐渐引起人们的重视。Nase等[17]通过动物组织灌流的实验方法观察急性缺氧时的血管调节机制，结果发现大鼠肠系膜血管周围氧分压降低能促使小静脉内皮释放NO增多，引起与小静脉伴行的小动脉扩张，从而增加组织的血液灌注。而Phillips等[18]实验证明，慢性间歇性缺氧可降低乙酰胆碱（acetylcholine, ACh）介导的NO的生成或释放，从而损伤大鼠大脑和骨骼肌动脉血管的舒张功能，降低机体对急性缺氧的代偿反应性。Rupin等[19]研究发现缺氧再充氧增加细胞浆内还原型辅酶Ⅱ氧化酶亚基p47phox.蛋白和内皮细胞选择素表达，可致氧自由基产生增加，引起多价不饱和脂肪酸过氧化产生细胞损伤和VEDF。因此，缺氧可能是HC引起VEDF及其它损害的重要因素。近有报道, 在HC早期血管外膜为血管自身供血的血管滋养管的内皮功能失调，可引起冠状动脉壁的供氧不足而产生损害，与AS密切相关[2021]。然而，由于对该领域的研究为时尚短，加上研究方法的限制，目前对HC影响微血管和微循环的报道资料很少；对HC早期是否存在组织细胞缺氧以及缺氧与HC早期损害之间的关系仍不清楚。葛根素（puerarin, Pu）是从豆科植物野葛或甘葛藤的干燥根中提取的一个异黄酮类化合物单体。Pu能改善由于oxLDL、羟自由基及高压力培养人脐静脉内皮细胞造成的NO分泌减少及血管紧张素转换酶活性升高等，起到保护血管内皮细胞的作用[22]；在高脂血症的研究中发现，Pu具有降低脂质含量、改善血液粘滞度等血液流变学指标[2324]、促进血管扩张[25]以及抗氧化[26]作用等；目前临床亦广泛将其应用于防治心脑血管系统的疾病[27]。虽然目前对Pu的扩张血管、抗氧化、清除氧自由基等作用和临床应用有了一定的了解，但对其确切的作用及作用机制仍有待进一步研究，以便促进中药现代化，使中药发挥更大的作用。本课题通过检测血氧饱和度（saturation of oxygen, SO2）、氧含量以及氧容量等血气分析指标，结合生化学和分子生物学的实验方法，探讨兔HC对微血管和微循环的影响，分析HC早期是否存在缺氧以及缺氧相关的损害机制，并观察Pu的干预作用。2 实验材料2.1 实验动物
雄性新西兰白兔23只，体重1.8~2.3 kg，购自上海市松江区松联市实验动物场，合格证号：SCXK（沪）。2.2 药物和试剂 Pu为西安山川生物技术有限公司产品，含量达99.51％，按照中国药典（2000年版）2002年增补本检验通过，批号：；胆固醇、胆酸钠为中国医药集团上海化学试剂公司产品；NOS活力、NO含量测定试剂盒为南京建成生物工程公司产品；考马斯亮兰G250、肾上腺素（adrenalin, AD）为Fluka公司产品；牛血清白蛋白（BSA）为上海丽珠东风生物技术有限公司产品；苯肾上腺素（phenephrine, Phe）为中国医药工业公司上海第十制药厂产品；Trizol TM为上海生工生物工程公司产品；PCR逆转录试剂盒、基因Marker为MBI产品；Taq DNA 聚合酶、琼脂糖、焦磷酸二乙酯（DEPC）为上海博亚生物技术有限公司产品；戊巴比妥钠为上海化学试剂采购供应站经销，新华化工厂分装；肝素钠为上海第一生化药业有限公司产品；溴化乙啶（EB）为华美生物工程公司产品；其它生化试剂：乙醇、氯仿、磷酸、CaCl2、甘油、冰乙酸、NaCl、MgCl2等溶媒试剂均为分析纯。2.3 PCR引物
依据GenBank登录的兔eNOS mRNA（GI:）全长序列，采用OMIGA软件，自行设计针对全长编码序列两端的引物，并委托上海博亚公司合成。其引物序列为： P1（上游引物）序列为5'AGGCCTCCTGTGAGACTTTC3'，P2（下游引物）序列为5'AAGGAGTCGAGGACTGGATG3'，预期扩增片段大小为512bp。内标&actin序列为：P1（上游引物）序列为 5'CATGTACGTGGCCATCCAG3'，P2（下游引物）序列为5'GGCAGCTCGTAGCTCTTCTC3'，预期扩增片段大小为336bp。2.4 主要试剂配制（1）0.5mg/ml BSA溶液：精密称取BSA 0.05g，加0.9%NaCl溶解并定容至100ml，4℃保存。（2）0.1mg/ml考马斯亮兰G250溶液：精密称取考马斯亮兰G250 0.02g，溶于10ml无水乙醇中，加入20ml 85%的H3PO4，加蒸馏水定容至200ml，过滤，收集滤液即得，避光、低温保存。（3）AD溶液50mmol/L AD贮存液：精密称取AD（M=183.21）0.2290g加0.1mol/L HCl溶解并定容至25ml，20℃避光保存；1mmol/L AD使用液：吸取50mmol/L的AD贮存液1ml加蒸馏水定容至50ml，4℃避光保存。（4）pH 10.0碳酸盐缓冲液称取Na2CO3（M=105.99）0.53g加蒸馏水溶解并定容至50ml，即配成0.1mol/L Na2CO3溶液；称取NaHCO3（M=84.01）0.42g加蒸馏水溶解并定容至50ml，即配成0.1mol/L NaHCO3溶液；将上述Na2CO3 和NaHCO3溶液混合，以0.1mol/L Na2CO3溶液调节PH至10.0即可。（5）10%十二烷基硫酸钠（SDS）溶液：称取SDS 1g，用适量蒸馏水加热条件下溶解并定容至10ml。（6）0.75%硫代巴比妥酸（TBA）溶液：称取TBA 0.375g，用适量蒸馏水加热条件下溶解并定容至50ml。（7）磷酸盐缓冲液（PBS）1mol/L K2HPO4贮存液：称取K2HPO4&3H2O 22.822g加蒸馏水稀释并定容至100ml；1mol/L KH2PO4贮存液：称取KH2PO4 3.402g加蒸馏水稀释并定容至25ml；0.1mol/L PBS使用液：将上述1mol/L K2HPO4贮存液80.2ml与KH2PO4贮存液19.8ml混合并加蒸馏水稀释至1000ml。（8）PSS液10&PSS贮存液：称取NaCl 69.5g、KCl 3.5g、KH2PO4 1.6g、MgSO4&7H2O 2.9g，分析天平称EDTA 0.076g溶于&900ml蒸馏水中；称取CaCl2 2.8g溶于&100ml蒸馏水中；上述两个溶液混合搅拌均匀后定容至1000ml，室温下密闭保存。PSS使用液：按配制1000ml使用液计算，取10&PSS贮存液100ml，加入NaHCO3 2.1g、葡萄糖2.4g溶解并加蒸馏水定容至1000ml，调pH 7.40。（9）0.1mol/L ACh贮存液：精密称取溴化乙酰胆碱0.226g加蒸馏水溶解并定容至10ml，20℃保存；临用前取适量按梯度法稀释使用。（10）3&102mol/L Phe溶液：吸取1% Phe注射剂（10mg/1ml）1ml加蒸馏水0.63ml混匀，4℃保存。（11）抗凝剂1000u/ml (1%)肝素钠溶液：吸取肝素钠注射剂（规格：2ml、12500u）4ml加生理盐水定容至25ml，用于兔体内抗凝；10u/ml肝素钠溶液：取1000u/ml肝素钠溶液加生理盐水稀释100倍，用于体外抗凝。（12）2％戊巴比妥钠溶液（麻醉剂）：称取戊巴比妥钠2g加生理盐水溶解大部分后转移至100ml容量瓶中，加入数滴3mol/L NaOH溶液剧烈震荡使全部溶解，再加生理盐水定容即得。（13）1％伊文思蓝（evans blue, EvB）溶液：称取EvB 1g加入1000u/ml肝素钠10ml，再加生理盐水溶解并定容至100ml。（14）盐酸（HCl）溶液4mol/L HCl溶液：吸取浓HCl（36％～38%）8.5ml加蒸馏水定容至25ml，避光保存；0.1mol/L HCl溶液：吸取4mol/L HCl溶液2.5ml加蒸馏水定容至100ml，避光保存。（15）5mg/ml EB：称取5mg EB，溶于1ml蒸馏水中，4℃保存。（16）10&Tris硼酸电泳缓冲液（TBE）：称取5.4g三羟甲基氨基甲烷、2.75g 硼酸及2ml 0.5mol/L EDTA，加蒸馏水至50ml，充分溶解后室温保存。（17）6&电泳上样缓冲液：称取溴酚蓝0.125g、蔗糖20g，溶于50ml蒸馏水，充分混匀，置于棕色试剂瓶，4℃保存。2.5 主要仪器紫外分光光度计：DU650，Beckman公司高速冷冻离心机：J2HS，Beckman公司 台式高速离心机：TGL16G，上海安亭科学仪器厂手掌离心机：LX100，江苏其林贝尔仪器制造有限公司电子天平：METTLER AE24080℃低温冰箱：MDF382E，SANYO公司全自动血气分析仪：Rapidlap865，Bayer公司全自动生化分析仪（human试剂盒）：AU2700，Olympus公司 可调速式高速分散器：GF1，江苏其林贝尔仪器制造有限公司PCR扩增仪：9700，Applied Biosystems公司 凝胶成像系统：FluorS，BIORAD公司微量核酸蛋白定量仪：RS232C，Eppendorf 公司 紫外透射分析仪：ZFA1，上海长明光学电子仪器厂 电泳仪：BS432，北京市电化仪器厂 电泳槽：DYY3，北京市六一仪器厂3 实验方法3.1 实验方案和血清总胆固醇含量测定 23只兔按体重随机分为正常对照（normal control, NC）组（6只）、HC组（8只）、高胆固醇血症模型+葛根素（hypercholesterolemia and puerarin, HP）组（9只）3组。NC组喂饲常规饲料；HC组每天喂饲高胆固醇饲料40g/kg体重，其中含胆固醇1.5％、胆酸钠0.15％、白糖2％、猪油0.5％及常规饲料95.85％，待摄入完毕后补充常规饲料；HP组在喂饲与HC组相同的高胆固醇饲料基础上加入Pu 0.2g/kg体重。3组间其它实验条件相同。连续饲养3周后，各组兔采血分离血清用Human试剂盒经全自动生化分析仪检测血清总胆固醇（total serum cholesterol, TC）含量，剔除HC和HP组血清TC过低（离均差≧2倍标准差）者，合格者按实验设计检测各项指标。3.2 动脉血压和动、静脉血氧含量、氧容量及SO2测定 动物经戊巴比妥钠（40mg/kg，i.v.）麻醉，分离颈总动脉及颈外静脉并插管。在缓慢匀速静注ACh 10&g/kg前后分别采集静脉和动脉血，用Rapidlap865全自动血气分析仪检测SO2、氧含量以及氧容量等血气分析指标，同时颈总动脉插管直接测定血压并记录。每次血气分析测定前对血气分析仪进行质控，测定前开启机器进行预热到运行稳定，即连续测定同一样本前后三次数据误差应在&5％，再进样检测。3.3 EvB渗出实验[28]3.3.1 EvB标准曲线的制作吸取1%EvB 0.02ml加甲酰胺定容至10ml，制成20&g/ml EvB溶液，以上述溶液为标准夜，取0、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4及12.8&g/ml 8个浓度作标准曲线，如下表：试管号20&g/ml EvB体积（ml）00.10.20.40.81.63.26.8甲酰胺至（ml）1010EvB浓度（&g/ml）00.20.40.81.63.26.412.8吸光度（A）00.00.50.152以0管为空白对照，于620nm处检测吸光度值A620，用Excel计算并得出直线回归方程为y=0.0423x－0.0052，相关系数r＝0.9999。3.3.2 肾组织EvB渗出量检测为避免EvB对其他检测指标的干扰，兔麻醉状态下放血，迅速剖取所需标本后，立即自胸主动脉下端插管恒压生理盐水灌流。至静脉端流出无色液体时，以1% EvB溶液50mg/kg体重（EvB溶于生理盐水中，每毫升含肝素100u）恒压灌注，30s后再灌注生理盐水50ml冲洗血管内残留染料，取双侧肾脏，20℃保存待测。测定时按4ml/g组织加入甲酰胺，加盖置于50℃水浴中温育48h，浸出液于620nm处检测吸光度。EvB含量根据标准曲线计算，以&g/g组织表示。3组平行操作，以EvB浸出量的多少反映肾血管通透性。3.4 主动脉环内皮依赖性舒张实验[29]动物放血后立即将剪取胸主动脉浸泡于4℃的PSS液中，清洗并小心剥离结缔组织，将主动脉剪成长约3mm的动脉环，实验前可将其浸泡在4℃的PSS液中并在12h内完成该张力实验，以避免血管活性改变引起的误差。在浴槽中充入PSS液并开启恒温水浴使温度控制在37℃，通入95%O25%CO2混合气体至少5分钟后，将血管环小心悬挂于浴槽底部并调整好装置的方向和稳定性，开启生理记录仪。改变血管环张力至5g张力处平衡90min，期间每隔30min换PSS液一次。整个实验过程保持操作轻柔、敏捷、准确，防止损伤血管内皮，记录血管环张力变化过程中不能碰触血管及描记系统，排除各种干扰因素，保证实验数据准确可靠。实验时首先调节浴槽中PSS液体积为10ml，加入0.1ml 3&104mol/L Phe使血管预收缩，待收缩至坪值，记录此张力作为收缩幅度的100%，然后按累积法从低浓度向高浓度依次加入ACh使其终浓度为107、3&107、106、3&106、105、3&105mol/L，记录张力的改变，每加一个浓度记录张力至坪值后再加另一浓度。结果以梯度浓度ACh引起的血管绝对张力的改变（g）表示，并绘制梯度浓度ACh引起血管舒张反应的量效关系曲线。3.5 考马斯亮兰G250蛋白质定量测定法标准曲线的建立 考马斯亮兰G250的颜色变化是H+浓度的函数，G250与蛋白质分子中的NH3+ 经静电作用结合可使G250在595nm处的吸光度增加，蓝色加深，其中蛋白质的浓度与吸光度的变化基本呈线性关系。因此，可利用此反应检测样品中蛋白质的含量。以BSA为标准，取0、100、150、200、250、300、350、400&g/ml 8个浓度作标准曲线，如下表：试管号0.5mg/ml BSA体积（ml）生理盐水至(ml)1010BSA浓度（&g/ml）吸光度（A）00.60.60.340各管分别吸取0.1ml加5ml考马斯亮兰G250混匀，静置5min使其充分反应。以0管为空白，于595nm处检测各管溶液的吸光度。根据标准液中BSA含量与其对应的吸光度值A595，用Excel计算并得出直线回归方程为y=0.3，相关系数r＝0.9965。3.6 脑组织NO含量及NOS活力测定动物放血处死后立即开颅，取脑组织并置于20℃条件下保存。检测前脑组织用生理盐水经高速分散器（8400rpm,60s）制成10％匀浆，检测过程严格按照南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明书操作。NO在550nm处检测吸光度，结果以&mol/g蛋白表示；NOS在530nm处检测吸光度，以每&g组织每分钟生成1nmol NO为一个酶活力单位U/&g，结果以 U/mg组织表示。3.7 肾上腺素（adrenalin, AD）自氧化法检测脑组织超氧化物岐化酶（superoxide dismutase, SOD）活力[30,31]AD在酸性溶液中很稳定，但在pH超过8.5以后其自氧化性能随着pH增加而增强，产物为肾上腺素红，在300～320nm处有较强吸收峰。AD的自氧化过程产生O2&ˉ且自氧化速率与O2&ˉ的浓度正相关，在SOD存在的条件下，O2&ˉ发生歧化反应生成H2O2及O2，从而使O2&ˉ浓度降低，肾上腺素自氧化速率减慢。因此，可通过肾上腺素比色间接反映SOD的活力。脑组织用PBS（pH7.4）制成2.5%匀浆（冰浴下，玻璃匀浆器制备），18 000&g，4℃离心30min，取上清液0.1mL组成以下反应体系，对照管以蒸馏水代替上清液。另取脑组织匀浆上清液0.1ml用于蛋白定量。试剂空白管对照管样品管碳酸盐缓冲液2.6ml2.6ml2.6ml蒸馏水0.4ml0.1ml&肾上腺素&0.3ml0.3mlSOD提取液&&0.1ml30℃水浴3.5min，取出后各管立即加入4mol/L盐酸0.1ml终止反应，4min时于301nm处测定A值。以下列公式计算结果：（A对照&A样品）/ A对照 反应液体积（=3ml）SOD（U/ml）= & & 样品稀释倍数50% SOD提取液体积（=0.1ml）SOD（U/ml）SOD（U/mg）= 蛋白定量（mg/ml）3.8 硫代巴比妥酸法检测脑组织丙二醛（malondiadehyde, MDA）含量[32,33]过氧化脂质降解产物中的MDA可与硫代巴比妥酸（TBA）缩合，形成红色产物，此红色物质在532nm处有极大吸收峰，可用分光光度计进行定量测定。脑组织以PBS（pH7.4）经高速分散器（8400rpm,60s）制备10%匀浆，常温离心3000rpm，30min，取上清0.2ml加入以下反应体系。试剂空白管测定管上清液&0.2ml10% SDS0.1mol/L HCl0.75%TBA加蒸馏水至0.1ml混匀，静置20min2ml1ml4ml0.1ml2ml1ml4ml颠倒混匀，将离心管加塞置于沸水浴中加热40min，冷却；各管加入正丁醇4ml，旋涡震荡2min，离心3000rpm，15min；取出离心管，将上层（正丁醇层）吸出，于532nm处检测吸光度。按照下列公式计算MDA含量。MDA的摩尔消光系数：1.56&105 L&mol1&cm1根据A=ELC得出C（mol/L）＝A / 1.56&105 L&mol1&cm1C（mol/L）&4 &106C（nmol/g）＝组织匀浆浓度（0.02 g/ml）3.9 聚合酶链式反应（PCR）检测脑组织内皮源型NOS（endothelial nitric oxide synthase, eNOS）的表达水平[34]3.9.1 一步法提取总RNA（1）裂解：组织从80℃冰箱取出后，立即称取100mg并置于玻璃匀浆器中，加入1.0ml Trizol TM试剂，在冰浴下制备匀浆。（2）分离：用1ml针筒，26G号针头抽吸匀浆液两次以剪切基因组DNA，然后直接从针筒中将样品转移到无菌1.5ml离心管中，加入200&l氯仿，剧烈振荡混匀30秒，4℃ 12,000rpm离心5min，离心结束后小心取出离心管，这时液体已分层，RNA溶解在无色的上层中。（3）RNA沉淀：小心吸取上清液转移到RNasefree 1.5ml离心管中（不要吸取任何中间层物质，否则会出现染色体DNA污染），加入等体积的异戊醇，颠倒混匀，室温下放置5min，4℃ 12,000rpm离心5min，此时可见RNA沉淀像凝胶样贴于管壁或底部。（4）RNA洗涤：小心移去上清，用70%酒精洗涤（颠倒混匀）两次，每次700&l，4℃ 12,000rpm离心2min。（5）RNA溶解：尽可能彻底地吸走上清，将RNA沉淀放置5min进行干燥，加入50&l DEPCH2O溶解RNA，80℃保存备用。（6）RNA的分析和定量：琼脂糖凝胶（浓度为1.2％）电泳确定RNA的完整性和污染情况，测定样品在260/280nm处吸收光密度，以比值在1.82.0之间视为抽提的RNA纯度很高。3.9.2 反转录PCR（1）在冰浴条件下，将1&g总RNA、1&l Oligo（dT）18 primer（0.5&g/&l）及EDPCH2O加入1.5ml离心管中使得总体积为12&l，轻柔混匀并放置5s。70℃水浴5min后，迅速置冰上冷却1min，此时DNA双链打开形成单链。（2）在上述离心管中加入如下试剂：5&反转录缓冲液 4&l，RNA酶抑制剂（20u/&l）1&l，dNTP（10mM）2&l，轻柔混匀，37℃温育5min。加入1&l鼠白血病病毒（MMLV）逆转录酶（200u/&l），混匀后，42℃温育60min进行反转录，70℃加热10min灭活MMLV逆转录酶以终止反应，冰浴5min。此时cDNA第一链合成完毕，并可在20℃条件下保持稳定。3.9.3 目的基因的PCR扩增取一个PCR反应管将以下成分加入管中：10&PCR缓冲液（无Mg2+）2.5&l，MgCl2（25mM）1.5&l，dNTP（2.5mM）2&l，cDNA模板1&g，引物1、2各1&l，Taq聚合酶 0.2&l，并加EDPC水补充体积至25&l。混匀，离心，放入PCR仪进行扩增，反应条件为：94℃&5min（预变性），94℃&60s（变性），46℃&60s（退火），72℃&90s（延伸），共38个循环；最后一次循环于72℃&10min，4℃&&。3.9.4 PCR产物的电泳分析取1.8g 琼脂糖放入250ml锥形瓶中，加入100ml 1&TBE液，摇匀，加热至胶融化。待胶冷却至约60℃，按0.5&g/ml胶的浓度加入EB，混匀。趁热将凝胶倒入槽内，厚度为35mm，待胶凝固后，将梳子垂直拔起。向电泳槽内倒入适量1&TBE液，以没过胶面2mm为宜，避免产生气泡。取产物溶液与上样缓冲液以5:1体积混匀，小心加入上样孔中。100V电泳0.5h后，取出凝胶在紫外灯下直接观察电泳带及其位置，并与基因Marker比较以确定该扩增产物是否与预期产物一致。3.9.5 凝胶成像及数据处理将凝胶放入凝胶成像仪成像，输出的数字化图象可为电泳结果提供依据。扫描图像得出OD值。以内参为标准，比较各组数值的大小。3.10 统计学处理实验数据以&x & s表示；显著性检验采用SPSS 13.0 软件进行，2组间比较用t检验，多组间比较用F检验；以P＜0.05作为差异具有显著性；统计图采用SigmaPlot 8.0软件绘制。4 结果4.1 血清TC水平的变化 高胆固醇饲养3周后，HC组血清TC水平显著升高（P&0.01），表明HC造模成功；HP组血清TC水平也明显升高（P&0.01），但与HC组相比，Pu具有一定的降低血清TC水平的作用（P&0.05，表1)。表 1. 血清TC含量及肾毛细血管通透性的变化Table 1. Changes in serum TC and renal capillary permeability组别n血清TC （mmol/L） 肾毛细血管EvB渗出量（&g/g）NC 60.64 & 0.178.7 & 0.5HC 6 29.51 & 2.94* *12.3 & 1.1* *HP 6 25.45 & 3.90* * #9.3 & 0.7* # #与NC组相比 *P&0.05, **P&0.01；与HC组相比 # #P&0.014.2 肾毛细血管通透性的改变 与NC组相比，HC组兔的肾血管EvB的渗透量显著增多，说明其通透性显著增大（P&0.01），Pu可明显抑制HC导致的血管通透性增大（P&0.01，表1）。4.3 静注ACh后血氧含量、氧容量及SO2 的改变 HC组动脉血氧含量、氧容量及SO2在静注ACh前后均未发生明显改变。静注ACh后静脉血NC组的氧含量及SO2明显下降（P&0.05）；而HC组下降的幅度明显偏小，HP组与正常组相似。在动脉血SO2相似的前提下，静脉血的SO2下降的程度可间接反映组织摄取氧气的状况，因而这一结果表明HC初期可能影响血氧向组织的弥散过程，而Pu具有一定的改善作用（P&0.05，表2）。表 2. 血氧含量、氧容量及SO2的变化Table 2. Changes in blood oxygen content, oxygen capability and SO2 组别氧含量(ml/100ml) 动脉血氧容量(ml/100ml)n=3SO2(％)氧含量(ml/100ml)静脉血氧容量(ml/100ml)n=6SO2(％)NCACh前16.3&1.316.8&1.499.6&0.39.6&3.217.6&2.153.2&12.8ACh后16.7&0.716.6&0.799.3&0.66.5&1.3*16.4&1.939.0&4.6*HCACh前17.1&0.517.3&0.399.5&0.39.2&2.117.6&1.051.5&10.6ACh后17.1&0.217.2&0.299.1&0.58.0&2.017.2&1.445.4&8.4HPACh前16.6&0.916.5&0.798.8&1.69.2&1.416.9&1.053.9&8.7ACh后16.3&1.016.2&1.098.9&1.77.2&1.3*16.5&1.142.7&5.6*与ACh前相比，*P&0.054.4 静注ACh对动脉血压的影响 缓慢恒速静注ACh 10&g/kg，记录血压变化，结果以静注10&g/kg ACh引起血压降低量（mmHg）作为整体动物对ACh反应性的指标。结果显示，HC组兔静注ACh后的降血压效应显著降低（P&0.05），HP组的降血压效应更明显（P&0.05），但其降压效应与正常兔相比无显著性差异（图1）。 4.5 血管环对ACh舒张功能的变化 HC可导致ACh对离体血管环的舒张作用降低，但无统计学显著性，HP组血管ACh介导的舒张作用与NC组相似（图2）。 图 1. 静注ACh引起的降血压效应 n=6. 与NC组相比 *P&0.05, 与HC组相比 # P&0.05Fig 1. Decrease in blood pressure by ACh i.v. 图2. ACh引起的胸主动脉环内皮依赖性舒张反应（n=6）Fig 2. AChinduced endotheliumdependent relaxation of thoracic aortic ring. 4.6 脑组织NOS活力及NO含量的变化 与NC组相比，HC组兔脑组织总NOS（TNOS）及诱导型NOS（iNOS）活力均显著提高（P&0.05），NO生成量显著减少（P&0.01），Pu可改善TNOS 及iNOS活力（P&0.05），显著提高NO水平（P&0.01，表3）。表 3. 脑组织NOS活力及NO含量的变化 Table 3. Changes in NOS activity and NO content in cerebral tissue组别nTNOS活力（U/mg）iNOS活力（U/mg）NO含量（&mol/g蛋白）NC619.0&1.45.4&0.90.62&0.14HC621.0&1.6* 6.8&0.9*0.33&0.08* *HP619.2&1.8# 6.0&0.9#0.52&0.11# #与NC组相比，*P&0.05, **P&0.01；与HC组相比，# P&0.05, # # P&0.014.7 脑组织SOD活力及MDA含量的改变与NC组相比，HC组SOD活力略有升高，MDA含量显著增加（P&0.05），说明机体发生氧化应激，Pu可降低MDA含量（P&0.05），显著提高SOD活力（P&0.01，表4）。表4. 脑组织SOD活力及MDA含量的改变Table 4. Changes in SOD activity and MDA content in cerebral tissue组别nSOD活力（U/mg蛋白）MDA含量（nmol/g）NC620.66&5..10HC623.30&3.59 154.82&17.17*HP6 31.84&6.65* # 128.05&11.42#与NC组相比，*P&0.05；与HC组相比，# P&0.054.8 PCR法检测脑组织eNOS mRNA的水平RTPCR检测结果显示，HC组兔脑组织eNOS mRNA的水平比NC组显著提高（P&0.05），表明eNOS表达增加； Pu对此有显著的抑制作用（P&0.05，图3、4）。bp M 1 2 3图3. RTPCR扩增eNOS产物的电泳图（M: 100bp DNA 1: NC组，2：HC组，3：HP组）Fig 3. The electrophoretogram of eNOS RTPCR products 图4. 脑组织eNOS mRNA的RTPCR扩增结果n=5，与NC组相比，*P&0.05；与HC组相比，# P&0.05.Fig 4. Result of RTPCR of eNOS mRNA in cerebral tissue 5 讨论5.1 HC模型制作的成功是保证实验达到预期目的的前提 兔在喂饲高胆固醇饲料3周后形成HC，血清TC水平高达29.51mmol/L，大约是NC组（0.64 mmol/L）的46倍，Pu有一定的降低血清TC的作用。由于有些兔不喜爱摄食高胆固醇饲料，摄食过程中会失落一些高胆固醇饲料，以至于产生HC模型血清TC水平相差过大等问题。为了防止这类问题的发生，我们在高胆固醇饲料配方中减少猪油的含量，加工的饲料颗粒较小，防止摄食时被叼出失落；喂饲方法上减少每次添加量，增加添加次数，先喂完高胆固醇饲料，再添加常规饲料；HC和HP组适当增加动物数量，以便淘汰不合格的模型，从而保证了模型制作的成功与一致，为实验顺利完成打下了扎实的基础。5.2 研究结果和主要创新点 本研究同时观察每只兔动、静脉血在静脉注射ACh前后共4份血样的血气分析指标的变化，结合生化学和分子生物学的实验方法，探讨兔HC模型微循环气体交换状况，获得一些令人感兴趣的发现和结果。血气分析结果显示，3组间动脉血血气指标无显著差异，在静注ACh前HC组静脉血SO2与NC组比较虽有所下降但差异无统计学显著意义，而NC组和HP组在静注ACh后静脉血SO2 和氧含量都显著降低（P&0.05），HC组则降低不明显。在离体内皮完整的胸主动脉环舒张功能实验中，虽然HC组ACh介导的内皮依赖性舒张功能下降未达到统计学显著性，但在整体实验中，静注ACh后的降血压效应则明显减弱（P&0.05），表明HC兔此时主动脉尚未发生明显的内皮功能障碍，但全身的小血管、微血管已出现内皮依赖性舒张功能障碍，故ACh降压效应减弱。肾血管通透性实验也显示，HC组肾组织EvB染料渗出量比NC组显著增多（P&0.01），HP组EvB染料渗出量无明显增加，说明HC早期就可引起微循环血管炎症性改变，通透性显著增大，Pu可明显抑制通透性的增大（P&0.05）。上述结果表明，在兔HC早期阶段，微循环可能由于血液流变学和血管炎症性的改变以及血管内皮依赖性舒张功能下降而导致氧气从血液向组织的弥散过程阻碍，组织因摄氧减少发生慢性缺氧或间歇性缺氧，从而引起缺氧和氧化应激等损害，是引发HC早期病变的重要因素。Pu可能通过降血脂和扩张血管、改善组织血液灌注等途径产生保护作用。HC组脑组织中TNOS和iNOS活力都明显增强（P&0.05），RTPCR扩增结果进一步证明eNOS的表达水平也显著增加（P&0.05），但NO含量却明显减少（P&0.01）；同时脂质过氧化产物MDA的含量增多（P&0.05）。这些结果表明HC引起氧化应激，ROS产物增加，NO大量被氧化灭活，加上缺氧，从而诱导NOS的表达和活力提高，而ROS引起的氧化反应过程可消耗大量的BH4，引起BH4缺乏，造成NOS酶促生成NO的过程脱偶联，NO生成减少，O2&ˉ大量产生，氧化应激进一步加剧，形成恶性循环。Pu明显增加SOD的活力（P&0.05），缓解氧化应激，使NO的含量显著增多（P&0.01）；Pu还能抑制HC对NOS活性及表达的上调作用（P&0.05）。以上结果说明Pu具有明显的抗氧化功能，可防止HC引起氧化应激等损害。本课题在实验方法上主要创新点在于合理应用ACh引起内皮依赖性血管舒张反应，对每只兔同时观察动、静脉血在静脉注射ACh前后共4份血样的血气分析指标变化和ACh的降血压效应，虽然不是直接观察微循环和微血管的变化，但却能非常特异地反映出微循环的氧气交换和微血管的舒张功能状况。从而发现HC早期微血管和微循环首先出现明显的血管内皮依赖性舒张功能障碍和可能引起缺氧的血气指标改变，提示缺氧损害可能是HC致AS及其它损害的重要的病理生理学改变。实验所获得的HC脑组织中NOS活性和表达水平都明显增加、NO水平却显著下降和MDA水平明显升高等结果表明，HC早期能引起氧化应激，且与缺氧损害密切相关。Pu对HC早期损害有明显的保护作用。这些结果对阐明HC损害及其机制、寻找HC干预新途径、丰富Pu药理理论及拓宽临床用途都有积极意义。5.3 研究成果阐明的主要问题5.3.1 高胆固醇血症早期引起缺氧及其机制 血气分析结果显示，3组动脉血各项血气分析指标包括SO2、氧容量以及氧含量在静注ACh前后均无明显差异，但NC组静脉血SO2及氧含量在静注ACh后显著降低，而HC组下降不明显。动脉血SO2和氧含量能反映肺循环过程中氧气的交换状况，HC组动脉血血气指标未发生明显变化，说明此时HC对肺微循环血管影响不大。在动脉血气分析指标相似和其他条件一致的前提下静脉血SO2和氧含量下降的程度可反映组织从血中摄取氧气的多少。NC组和HP组在静注ACh后，SO2和氧含量明显降低，这提示ACh介导的内皮依赖性血管舒张作用对促进组织微循环的氧气交换有重要作用，能增加组织氧摄取量，故静脉血SO2明显下降[35]。这一发现揭示了ACh介导的血管内皮依赖性舒张功能的生理学意义，即在特定的生理状态下如夜间胆碱能神经系统张力占优势时，使血管保持适当的舒张状态，保证组织有效的血液灌注，防止组织缺氧。而HC组静注ACh后静脉血SO2和氧含量降低不明显，说明HC可能引起组织和内皮细胞发生慢性缺氧或在夜间等胆碱能神经系统张力相对增强期间出现缺氧，从而引起各种损害。有研究报道，正常大鼠骨骼肌收缩时小动脉舒张以促进血管迅速充血，增加氧气向组织的输送；而自发性高血压大鼠由于微循环血管数目减少，微循环血管表面积减小，红细胞粘滞度增大从而阻碍氧气从毛细血管向组织的扩散，造成骨骼肌收缩后低氧分压时间延长，恢复变慢[36]。HC也存在这种可能引起组织细胞缺氧的相似情形。我们的结果表明HC组离体主动脉环对ACh介导的舒张反应虽有降低，但未达统计学显著性，而整体对ACh静注引起的降血压效应HC组则明显减弱。尽管静注ACh后的全身效应比较复杂，但其较小剂量的降血压效应主要是由于小血管、微血管舒张所致，所以这一结果表明HC兔此时主动脉可能尚未发生明显的内皮损伤，但全身的小血管、微血管已出现明显的内皮依赖性舒张功能障碍。这一结果与最近文献[37]报道的HC时微血管和微循环首先出现炎症性改变，而后才累及大动脉的病变发生顺序相吻合。HC引起的AS是一种炎症性病变的观点已逐渐被人们所接受[38]，HC组肾组织EvB染料渗出量比NC组显著增多，说明HC早期就可引起肾微循环血管炎症性反应，通透性增大。临床研究也证明HC存在微小血管内皮依赖性舒张功能障碍、血中胆固醇含量增加、血液粘滞度增大和血管炎症性渗出等改变[39]。因此，HC引起缺氧的机制与微血管和微循环血管炎症改变、内皮依赖性舒张功能障碍以及血液流变学异常等因素密切相关。这些变化可能妨碍氧气交换过程，导致组织不能充分摄取氧，引起缺氧损害。 5.3.2 缺氧与HC引起氧化应激及VEDF的关系本研究结果表明，HC组脑组织脂质过氧化产物MDA含量明显升高，说明HC引起氧化应激，产生脂质过氧化损害。大量研究表明，氧化应激是HC引发VEDF的重要机制。氧化应激是指体内ROS物质的增多同时NO生物利用度的降低，导致机体出现的一种过度的氧化反应状态[40]。HC可激活NADPH氧化酶造成O2&ˉ 大量产生[9]。O2&ˉ 有细胞毒性作用、可灭活NO、引致脂质过氧化生成oxLDL，促进AS的发生与发展[41]。O2&ˉ也可通过介导HC时白细胞与内皮细胞的粘附，促进微循环炎症性反应的发生[42]。NO有舒张血管、抗AS、防止血栓形成和炎症反应等作用。因此，HC引起O2&ˉ 大量产生，必然导致ROS与NO的失衡，造成VEDF和各种损害。此外，HC还可促进P选择素[10]、ICAM1的表达[11]，导致血液粘滞性增加和血细胞粘附聚集及炎症反应，上调VEGF的表达[12]，从而引起微血管通透性增加和血管内皮细胞增生等[43]。本实验发现，HC兔脑组织TNOS、iNOS的活力及eNOS的表达均显著增加，而NO含量却显著降低，这种NOS增强但NO反而减少的矛盾其实并不奇怪。有研究表明，内皮细胞具有氧感受器的功能，在完整的小肠微循环中氧气水平的轻微下降即可刺激内皮源性NO释放引起微小血管扩张，增加微循环血流以满足氧的需求[17]。急性缺氧可上调内皮NO的释放引起血管舒张，但慢性或慢性间歇性缺氧可致内皮依赖性血管舒张功能障碍，引起急性缺氧上调NO释放的机制失效；但给予NO供体如硝普钠则显示正常的舒张功能，这说明缺氧可导致内皮源性NO的产生和释放减少[18]。已知HC时BH4的缺乏可使NOS酶促反应过程发生脱偶联，从而造成ROS的大量堆积，氧化应激损伤进一步增强。临床上通过补充BH4的替代治疗，可显著促进NO生成、减少氧自由基产生而有效改善血管内皮功能[44]。新近有研究表明，急性缺氧可上调eNOS的活力[45]。因此，根据我们的结果有理由推断HC早期引起组织和内皮细胞缺氧，缺氧在产生氧化应激等损害的同时上调NOS的活性和表达，但产生的NO被大量的ROS氧化灭活，引起NOS作用发生脱偶联，出现O2&ˉ 大量产生，NO生成减少并被氧化灭活，是HC早期损害和VEDF发生的重要机制。我们的结果还表明微血管和微循环发生VEDF比主动脉早，但现有资料尚有不能阐明缺氧与VEDF发生的因果关系。因此，进一步研究缺氧与VEDF的关系非常必要5.3.3 葛根素能有效防止或减轻HC早期的损害实验结果表明Pu能有效防止或减轻HC所引起的各项检测指标的异常。HP组在静注ACh后降血压效应明显，静脉血SO2及氧含量均显著性降低，对ACh介导的主动脉环内皮依赖性舒张功能有一定的改善作用，对HC引起的肾组织血管通透性增加有抑制作用，说明Pu可扩张血管，改善微循环氧气的扩散，防止缺氧和炎症反应的发生。这些结果与报道的ACh扩张血管、降低微循环通透性以及改善血液流变学[2324,46]结果一致。本研究显示，HC兔脑组织SOD活力略有提高，氧化产物MDA含量明显升高，说明机体处于氧化应激状态。正常情况下，O2&ˉ 增多能诱导SOD的活性，SOD即时催化O2&ˉ 使之生成过氧化氢，并最终分解为氧气和水。Pu可显著提高SOD活力，明显降低MDA含量，提示其是SOD有效的诱导剂，且可能与O2&ˉ 的诱导作用产生协同效应，从而发挥较强的清除氧自由基和抗氧化作用，减轻氧化应激损害。本研究发现Pu具有显著抑制HC引起的NOS活性增强和eNOS的过度表达的作用，并增加NO的生成，这可能由于其具有改善血管内皮依赖性舒张功能等作用，能防止发生或减轻缺氧状态，从而阻抑缺氧对NOS活性和表达的上调。确切的机制还有待进一步研究。5.4 本实验的不足和值得进一步研究的问题 由于实验条件和时间的限制，我们未能直接测定组织氧分压以确定HC是否引起组织和内皮细胞缺氧以及缺氧的程度。血气分析SO2、氧含量及氧容量等指标的变化只能间接反映组织是否存在缺氧。由于本课题工作量大，为了按时保质保量完成实验，本次研究设计只安排了NC、HC和HP 3组，因而限制了实验所能获取的信息量。人类生存离不开氧气，缺氧损害的病理生理学意义极为重要。缺氧可导致缺氧诱导因子（hypoxiainducible factor, HIF）的表达，后者主要在转录水平上调节一系列能使细胞和组织适应低氧条件的重要基因的表达。HIF的发现对阐明缺氧损害有重要作用。因此，HC初期是否存在缺氧、缺氧与VEDF及HC早期病理生理的关系、HC时HIF的表达状态及其意义以及Pu的干预作用和作用机制，等等。这些问题都值得进一步研究。5.5 结论 实验结果显示，HC早期出现部分血气分析指标异常，静脉注射ACh的降血压效应降低，肾血管通透性增大，脑组织NOS活力和表达上调，MDA水平升高，而NO水平降低；Pu对这些异常指标有不同程度的改善作用并明显增强SOD的活性。提示HC早期组织细胞可能存在慢性或间歇性缺氧，从而产生缺氧和氧化应激等损害。Pu能通过扩张血管和抗氧化等作用缓解缺氧和氧化应激，有效防止或减轻HC早期损害。小 结（1）本研究采用高胆固醇饲料饲养兔3周，成功建立了血清TC升高比较一致的HC模型，通过分析静注ACh前后动脉和静脉血共四份血样的SO2、氧含量以及氧容量的变化，同时检测相应的生化学和分子生物学指标，获得了一些令人感兴趣的结果。（2）血气分析结果显示，3组间动脉血血气指标无显著差异，在静注ACh后NC组和HP组静脉血SO2 和氧含量都显著降低，而HC组则降低不明显，提示HC初期组织从血液摄取氧气的能力下降，机体出现慢性缺氧或间歇性缺氧。（3）在离体主动脉环内皮依赖性舒张功能障碍尚不明显的情况下，机体对静注ACh引起的降血压效应显著削弱，说明HC初期微循环先于大血管出现明显的内皮依赖性舒张功能障碍；HC初期肾血管EvB渗出量增加，说明肾血管出现通透性增大等炎症性反应。这些改变可能是导致机体发生缺氧的重要原因。（4）HC组脑组织NOS活力和表达均显著增加，NO含量明显减少，同时MDA含量增多，这些结果说明HC初期存在氧化应激而引起组织损害，上调NOS活力及表达；同时提示脑组织存在NOS酶促NO生成过程脱偶联，结果引起ROS大量产生，NO被氧化灭活，氧化应激进一步加剧并形成恶性循环。这些改变可能与缺氧有关，是HC初期损伤的重要机制。（5）Pu主要通过降血脂、抗氧化、改善ACh内皮依赖性血管舒张功能、降低微循环血管通透性、降低过强的NOS活性及表达、提高NO含量等作用，有效减轻或防止缺氧和氧化应激等损害。本研究对HC初期微循环改变和损害机制以及Pu保护作用作了初步的探讨，HC初期是否引起缺氧及其与HC损害的关系有待进一步的研究。参考文献1. 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