体外细胞毒性检测需要去哪里做？

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2022-05-27 13:50 标签： 检测细胞毒性的常用方法

　　本实验方案描述纳米粒子对于猪的近端肾小管细胞（LLC-PK1）的细胞毒性检测。本文采用的是乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）释放法[1, 2]。

LDH）细胞毒性检测试剂盒[3]。LDH是一种细胞裂解时释放到细胞质的胞质酶。因此，LDH法可以检测膜的完整性。LDH法测定的原理：（1）乳酸脱氢酶氧化乳酸盐为丙酮酸盐；（2）丙酮酸盐与四氮唑盐（2-(p-iodophenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium chloride, INT）反应形成的甲臜；（3）用分光光度法检测水溶的性甲臜染料[4-6]。也可根据样品来源不同，按照参考文献[7]检测。

　　以下列出的产品供应商仅以提供产品信息为目的，可以有同类产品的其他供货商所替代。

　　离心机（带有96-孔板适配器）、冰箱（4℃和-20℃）、细胞培养箱（37℃，5%CO2，95%湿度）、生物安全柜（可处理生物相关材料）、倒置荧光显微镜、血细胞计数器（细胞计数仪）、涡轮混匀仪、酶标仪、平板振荡器。

　　LLC-PK1（猪的近端肾小管细胞系）

　　3.3 热灭活FBS：在2-8℃解冻一瓶FBS，热灭活前恢复至室温。放入56℃水浴中30min，并且每隔5min混匀一次。根据每次实验的用量（~50mL），分装后保存在-20℃。每次使用前，在2-8℃解冻。剩余FBS可在2-8℃保存一个月。

　　3.6 LDH相关溶液的配制：（1）将1瓶催化剂溶于1mL蒸馏水中，10min，涡旋混匀（在4℃可保存几周）。（2）反应液：根据检测样品的数量，100μL/孔，将上述催化剂溶液和染料按照1:45的比例配置，建议现配现用。（在4℃可保存几周）。（3）LDH标液：将一定量的LDH标液溶于AM中，终浓度为0.05U/mL。

4.样品制备：纳米粒子样品溶液的配制

　　4.1 将待测样品完全溶解在AM中，浓度为1x终浓度。如果被检测的银纳米粒子的最高工作浓度为1mg/mL，那么需要检测浓度按照1:5的稀释比例，依次稀释至0.2mg/mL、0.04mg/mL和0.008mg/mL。每一个浓度的纳米粒子应该被分析3次，每次两个重复（n=6）。

　　4.2 选择合适的纳米粒子溶液的浓度时，必须考虑以下几个问题：纳米粒子在某种生物相容性缓冲液中的溶解度、生理条件下的pH值（6-8）、纳米粒子的可用性及稳定性。如果1mg/mL的最高工作浓度不适合，需要对此浓度进行调整，一定要在适合的浓度下分析样品。

　　4.3 预实验（确认纳米粒子对于LDH活性是否产生影响）

　　4.3.1 样品组选择3个浓度（低、中、高）进行预实验，对照组为AM。每个样品组或对照组设置3个平行孔。

　　4.3.2 在所有的孔中加入100μL M199完全培养基。按表1，在相应的孔中加入50μL LDH标液（0.05U/mL）、50μL不同浓度的样品溶液（4x终浓度）或AM，使得每孔的总体积为200μL。

　　4.3.3 混合后直接用于检测，或培养不同的时间（24h、48h）后再检测。检测前，将100μL上清液转移至另一块96孔板中，每个孔加入100μL反应液混合，震荡混匀后，室温避光反应30min。

　　4.3.5 比较B-A与D-C两个差值，根据T-test结果，判断样品是否会干扰LDH检测，在后续正式实验中，避免使用有影响的样品浓度。

　　5.1 培养细胞2天后，细胞密度达到80-90%。收集细胞，用台盼蓝进行细胞计数。如果活细胞比例达到90%以上，可以继续后面的实验。

　　5.3 按处理时间不同准备2个24孔板（分别为24和48小时），按照图1每孔加入500μL细胞悬液，每个样品或对照徐对应两个重复孔。（每组设1个无细胞对照孔，此时为空）

　图1 24孔板加样图。样品1-4为不同浓度的样品溶液。APAP的终浓度为25mM。Triton-X-100的终浓度为1%

　　5.4 培养板在细胞培养箱中，37℃，5%CO2，培养24小时。

　　5.5 去掉上清，然后按照图1，样品组每孔再加入400μL纳米粒子溶液（4.1中配制）。阳性对照组每孔加入400μL APAP溶液（3.5中配制）。阴性对照组每孔加入400μL AM。最大释放组每孔加入400μL 1%Triton（3.4中配制）分别在细胞培养箱中（37℃，5%CO2）孵育24或48小时。

　　5.6 将每孔中的上清液全部（360μL）转移至1.5mL EP管中，室温离心20min，转速大于16000xg。

　　5.7 将上清转移至96孔板中，每管上清分别对应三个平行孔，每孔加100μL。（图2）

　　5.8 每孔加入100μL反应液（见3.6.2）。震荡混匀后，室温避光反应30min。

　　5.9 在酶标仪上读取490nm和680nm（参考波长）处的吸光度，两个吸光度的差值为该孔的测量值（OD）。

　　6.2 LDH释放百分比 LDH%=（样品释放OD-自然释放均值OD）/（最大释放均值OD-自然释放均值）×100%

　　OD=含有细胞的测量值-相应无细胞对照测量值均值

　　自然释放：细胞+400μL AM

　　自然释放对照：400μL AM

　　样品释放：细胞+400μL待测样品或阳性对照（APAP）

　　样品释放对照：400μL待测样品或阳性对照（APAP）

　　7.1 对于APAP阳性对照组，48小时的细胞活力应小于75%，释放的总LDH%应大于15%。

　　7.2 阳性对照以及样品的CV%应小于50%。

　　7.3 需同时满足7.1和7.2的标准，检测可认为成功。否则，需重新进行检测。

　　APAP：对乙酰氨基酚

　　LDH：乳酸脱氢酶

　　PBS：磷酸缓冲盐溶液

[7]YY/T ,医疗器械生物学评价 纳米材料：体外细胞毒性实验（MTT试验和LDH试验）。

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