从柏翠云身上提取免疫细胞的过程中，受捐的姐姐在一旁守护着她。 韩飞 摄
　　在电影《姐姐的守护者》里，安娜从出生就为白血病姐姐提供脐带干细胞，每当姐姐癌症复发，安娜就不断地提供血液细胞以延续姐姐生命。而在南京，也有这么一位“姐姐的守护者”，她的名字叫做柏翠云，今年49岁。从13年前姐姐患白血病，她一次又一次为血癌反复发作的姐姐提供造血干细胞和淋巴细胞，创造了生命奇迹。　　实录：妹妹为姐姐提取免疫细胞　　昨天，记者在北京解放军307医院采访了为姐姐捐献免疫细胞的柏翠云。日，由于姐姐的癌细胞又发生扩散，姐妹俩再次来到了307医院。在医院里，记者全程记录了柏翠云为姐姐治病的过程。　　早晨8:30，柏大姐把妹妹的体检报告交给医生，各项指标均合格。柏翠云熟练地躺在分离器旁的床上，伸出两只胳膊，眯着眼睛等护士打开机器，待针扎入血管后，又不停地握、松手中的一个红色皮球，保持血液畅通。对于这个过程，柏翠云告诉记者：“我做了十来次，每次躺上来还是害怕，不敢看血。”十分钟后，感到不舒服的柏翠云请护士帮自己补钙。　　两小时后，50毫升包含免疫细胞的血浆提取完毕。柏翠云被抽出的免疫细胞会被送到培养室，一周后，这些免疫细胞数量将变成原来的若干倍，用8天时间分四次输入到姐姐的体内。结束抽血，记者跟随柏翠云姐妹来到出租屋，虽然姐姐平时不能出院，但这一次她“请假”出来看望妹妹。　　13年前　　捐髓前有反应不敢说 怕护士不让她捐了　　2001年6月，38岁的南京职工柏大姐被查出罹患急性粒细胞白血病，当时唯一能救命的方法就是找到配对骨髓做移植。柏女士告诉记者，那时候普通人对骨髓移植有很多误解，但36岁的妹妹柏翠云自愿为姐姐捐骨髓。　　不仅捐髓，她还负责照顾姐姐　　检查配型的结果如她所愿，姐俩匹配指数高达99.9%。这本是一件好事，然而，她的决定却遭到了婆婆的反对。当时，柏翠云的儿子刚满11岁，正是小学升初中的关键时期，而她的老公身体不好，需要人照顾。柏翠云是家里唯一有劳动能力的人，靠着每天送报纸养活一家人。然而，他们并没有动摇柏翠云救姐姐的决心，丈夫也支持她到北京救姐姐。2001年8月，柏翠云只身一人踏上了去北京的火车。　　柏翠云来到北京307医院。经过化疗、放疗，柏大姐的身体极为脆弱，而大姐的丈夫是一名警察，临时接到任务赶回南京，照顾和拯救姐姐的重担就落到了柏翠云身上。此时柏翠云和姐姐一同住院，在接受刺激因子注射、把姐姐需要的救命造血干细胞从骨髓里逼出来的同时，她还要照顾姐姐的生活。　　打动员剂后出现反应，她仍坚持　　由于干细胞通过关节软骨析出到血液中，刚开始的两天，柏翠云只觉得胳膊肘和膝盖麻麻的，到了第三天，她开始失眠，身体的每个关节放佛都有虫子在钻，无论是坐、卧还是走路，都难受极了。然而，善良的柏翠云却告诉记者：“当时不懂，也不敢告诉医生自己的感觉，更不敢让护士发现我难受，害怕一说出来，他们就不让我捐了。”直到后来，她才知道这些是打针后的正常反应。　　一个星期的刺激因子注射让柏翠云的血液中造血干细胞数量达到了要求。真正的捐献开始了。　　姐姐由AB型血，变成和她一样的O型　　第一天漫长的五个小时提取任务终于熬完了，柏翠云被护士架着躺倒在病床上。而在无菌病房里，柏大姐已经第一时间输入了妹妹的造血干细胞。这样的提取第二天又进行了一次，柏翠云的造血细胞被一点一点地注入到柏大姐的体内，她的免疫系统也在一点点地恢复。终于，30天后，医生宣布骨髓移植成功。　　走出了无菌病房的柏大姐重获新生，她原来的血型是AB型，如今已经成功变成了和妹妹一样的O型血。姐妹俩实现了真正的血脉相连。完成造血干细胞捐献休息不到一天，柏翠云便匆匆回到南京照顾孩子。　　13年来　　她把血癌复发的姐姐 一次次从死亡线拉回　　2001年春节前夕，柏大姐终于回到南京。不过医生的交代一直让柏翠云担心，白血病病情反复，一旦复发无药可救。从此，住得和姐姐不远的柏翠云又肩负起照顾姐姐的重任。　　复发时捐髓不管用，但有了免疫治疗　　每天上午，柏翠云帮姐姐送孩子上学后，顺便买菜做饭，整理家务；下午，则继续送报或者打其他零工。2005年以后，柏翠云丈夫癫痫越发严重，她又辞去打零工的活照顾起丈夫，直到丈夫3年后去世。然而，2009年国庆节前，柏翠云帮姐姐洗澡时，发现了姐姐胸部有淤青，而淤青就是肿瘤，柏大姐的血癌复发了，周身细胞中癌细胞达86%。　　柏翠云和姐夫一起把姐姐带到了307医院，希望再给姐姐实施骨髓移植手术，但医生却说，一生只能换一次，再换就没用了。巧合的是，此时307医院刚刚获总后卫生部批准，可以为患者进行免疫治疗实验。　　她成了姐姐提取“免疫细胞”的储备库　　于是，医生给出了另一个艰难的治疗方案，家属可以选择尝试为柏大姐做免疫细胞治疗。但代价是，妹妹可能会成为姐姐的提血库。姐姐每次发病，都要从妹妹的血中提取免疫细胞，输入到姐姐体内去杀死癌细胞。这也意味着，只要姐姐活一天，妹妹随时都要做好供应免疫细胞的准备。面对这个生存的机会，心疼妹妹的柏大姐劝妹妹不要答应，但一心想救姐姐的柏翠云却笑着说：“捐献细胞如同献血一样，没有伤害，你放心。”　　就这样，在柏大姐癌症反反复复发作的5年中，柏翠云10次为姐姐捐献免疫细胞。让柏翠云印象最深，也是姐姐最危险的一次是2009年，刚刚接受完第一次免疫治疗的姐姐回到南京，不到两个月癌细胞全面爆发，身体的许多地方出现了恶性肿块。对生存绝望的姐姐不想受罪，也不想连累妹妹，拒绝再次治疗。但坚强的妹妹硬是把姐姐拉到了北京医院。　　隔着无菌室的玻璃为姐姐加油鼓劲　　姐姐住在无菌病房，而自己则租住在医院附近的一个破旧的小单间。每天早晨5点多钟，她就起床给姐姐熬制汤粥，送到病房里去，然后隔着玻璃给姐姐加油鼓劲。探视完毕，赶紧跑到菜场给姐姐买最新鲜的蔬菜准备午饭。一天三次送饭风雨无阻。　　直到2013年以后，姐姐的癌细胞才慢慢得到控制，乐观的妹妹成为姐姐生命之源。　　捐髓妹妹：　　大家总觉得大姐离不开我 其实我也离不开她　　从2001年查出白血病到现在，姐姐靠着妹妹的十次捐献，已经活了13年。13年来，不管姐姐怎样拒绝治疗，如何劝妹妹不要再捐，柏翠云总有办法把姐姐拖回医院。她告诉记者：“我从没觉得自己委屈，姐姐的命比什么都重要。现在孩子长大了，丈夫也走了，我已习惯在姐姐身边照顾她、救她。大家总觉得是大姐离不开我，其实我也离不开她了。”　　受捐姐姐：　　自从换了妹妹的细胞 家人都说我性格越来越像她　　听到妹妹的一番心里话，柏大姐已经抑制不住泪水，却还笑着说：“自从换了你的细胞，家人都说我性格越来越像你了。我保证这次做完再坚持8年、18年不复发。”姐妹俩的深情感动了记者，也感动了柏大姐的主治医生王丹红。她告诉记者：“白血病是最厉害的癌症之一，她有这样的妹妹真是太幸运了。她反复复发已挺了13年，在医学上，也算是奇迹了。相信创造奇迹时间还会越来越长。或许就是亲情的力量吧。”　　幸运的柏大姐两次赶上新技术　　柏大姐的幸运不仅在于有一个愿意为她付出全部的妹妹，还因为她两次赶上我国骨髓移植和癌症治疗有了新方法。　　1、外周血干细胞移植　　据解放军307医院细胞与基因治疗中心实验师张婧介绍，目前治疗白血病的有效方法是骨髓移植。而骨髓中真正有用的是干细胞。因此，通过使用一种被称为刺激因子的药物，将人体中藏在骨髓里98%的干细胞释放到人体外周血液中。利用分离器，直接从血液中采集所需足量的干细胞，移植给患者。这种方法捐献者不必承受直接抽取骨髓的痛苦，采血量少但质量高，对人体也没有什么伤害。　　2、提取培养免疫细胞　　全军造血干细胞研究所副所长王丹红告诉记者，目前细胞免疫治疗已经被公认为21世纪肿瘤综合治疗模式中最活跃、最有发展前途的一种治疗手段。上世纪70年代，国外科学家发现了一种可以杀死人体内有害细胞的特殊细胞―树突状细胞，也叫免疫细胞。这种细胞能主动对人体内癌细胞发动攻击。　　简单来说，医生可以从患者自身或者符合条件的捐献者血液中提取采集出这种免疫细胞，然后在实验室中进行培养、复制，再输入到癌症患者血液中，让这些有益的免疫细胞主动攻击患者身上的癌细胞，让患者做到带癌生存甚至治愈。　　作者：韩飞关注今日：9 | 主题：381643
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我总结的细胞中提取核蛋白步骤
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这个帖子发布于12年零150天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
从25cm2细胞瓶中提取步骤：1、PBS洗2次。2、胰酶消化细胞，加4度培养液5ml中止反应。3、3000rpm 离心5min（4度），去上清。4、加入裂解液1.5ml，剧烈涡旋。5、冰加异丙醇，搅拌成糊状，离心管放入冻结，然后37度融化，反复3次。6、100度煮沸5min。7、15000rpm离心10min。8、吸上清于新管，进行电泳。或者－80度冻存。裂解液：60mM Tris-HCL(PH7.2)
PMSF和巯基乙醇有毒，所以没有用，影响应该不大。保持低温操作，可以不用加蛋白酶降解抑制剂。我看到有人加了10％甘油，不知道起什么作用。
不知道邀请谁？试试他们
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不知这是哪里的配方？是用于核蛋白的提取的吗？细胞裂解后只是低温操作而没有蛋白酶抑制剂应该是不可以的，是否是因为系统里早早加入了有机溶剂的原因？请提供该方法的出处。
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可是师姐告我由于：（1）、低温操作（2）、裂解操作时间短，所以不需要加入蛋白酶抑制剂。这是我自己总结细胞中提取核蛋白步骤，请指正。
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看起来如果可行更象是全细胞裂解，原因是胞质蛋白在系统中象是没有除去。
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yes,the nuclear proteins still are
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请问主任：我的目的是将细胞核内的P53蛋白提取出来，这个步骤是否还需要修改？我马上要做，请指教。
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不敢当。但我觉得这个步骤好象是提全细胞裂解液的，也就是不分细胞质蛋白和核蛋白。当然这个方子也完全可以提出蛋白来，不过不是核里的。P53 是活化后进核的吗？我不太了解，总之根据不同的实验目的，核蛋白可以用全细胞裂解液，也可以单提胞质和胞核。这个方子觉得有个缺点，好象没有中间留样品测蛋白浓度的一步。不过WB 里也可以用beta-actin 来 normalize，不一定要测浓度定量。
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icesugar75 edited on
有谁知道细胞色素c的检测方法， 不用蛋白印迹，检测裂解细胞的含量
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多谢主任（xddu是我的马甲）！p53基因是抑癌基因。我用脂质体介导入细胞内，然后染毒，观察P53蛋白表达水平。p53基因在细胞核内稳定表达，所以我要提取核蛋白。有的裂解液还有巯基乙醇和10％甘油。
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:):) 看出来了看一下资料版的全细胞裂解液吧，如果要定量可以用那里的方法。
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不知道是不是真的，我也急着做核蛋白的WB，真的能做得出来？
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xddu wrote:我看到有人加了10％甘油，不知道起什么作用。 甘油有稳定蛋白的作用
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请教组织中提取核蛋白的方法
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我是应用梁国栋编的 最新分子生物学实验技术 （细胞的方法）请告知组织提取核蛋白的方法 万分感谢！！！
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我用的是这种方法：提取效率还是可以的：Buffer A：
HEPES (pH 7.9)
10mMBuffer C:
HEPES pH 7.9
25%,v/v用前加入0.5ul 1M的DTT，2ul 100mM的PMSF以及在每ml Buffer中加入10ul 蛋白酶抑制剂。100 mM PMSF：174.2mg PMSF+10ml 水步骤为：1．
用冷D-PBS洗两次细胞2．
刮除细胞入1ml D-PBS中3．
离心细胞3000rpm，5分钟4．
用400ul Buffer A重悬细胞，并上肿胀细胞10分钟，vortex10秒5．
1000rpm离心10秒，弃上清6．
12000rpm离心5分钟，弃上清7．
重悬细胞在50-100ul Buffer C中，置于冰上20分钟8．
12000rpm离心5分钟，转移上清于另一EP管中9．
定蛋白，分装于-70℃保存0.5M EDTA1M 碳酸钠：3.277g+ 20ml H2OBuffer A: HEPES (pH 7.9)
0.15ml1M KCl
100mlBuffer B
HEPES (pH 7.9)
(10mM) EDTA
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细胞裂解后只是低温操作而没有蛋白酶抑制剂应该是不可以的，其中的变性步骤使蛋白酶失活，因此只要变性之前的那些步骤所需的时间不长，应该不会有什么大问题。我们实验室做western blotting的使用的蛋白酶抑制剂是EDTA和PMSF，提的蛋白放置个把月也可以用。我的实验中提的蛋白需要尽量防止蛋白质变性，因此用的蛋白酶抑制剂除了EDTA和PMSF还有leupeptin、pepstatin A。即使是这样，这些蛋白还得提了马上做后续的实验，我试过，把提的蛋白一部分马上用，另外一部分保存在4℃的冰箱里第二天再用，马上用的得到了较好的结果，第二天用的就不好了。
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Buffer 中MgCl2 起什么作用？
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谢谢指教！！！！
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mtpu Buffer 中MgCl2 起什么作用？MgCl2 的主要作用是保护细胞核的完整性，但浓度过高会造成核的聚集。
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我们实验室的经验是必须加蛋白酶抑制剂，但是有人不加是因为已经提前加到裂解缓冲液中了，还有提取胞核蛋白的话可以使用胞浆胞核抽提蛋白试剂盒
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请问 buffer c中的甘油占总体积的25%么 也就是说如果是100ml液体 buffer c应为25ml？？？
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可以考虑使用专门提取核蛋白的试剂盒。
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中帜-吴 edited on
我觉得还是用试剂盒的比较方便，效果应该也不错的！
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试剂盒国产的哪家好用啊 ？
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关于丁香园3年流产6次，因为夫妻基因太相似
提取丈夫淋巴细胞给太太，终于怀上了|生长发育|精子_凤凰资讯
3年流产6次，因为夫妻基因太相似
提取丈夫淋巴细胞给太太，终于怀上了
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侯莉莉主任说，针对秦女士这种患者，可采用淋巴细胞主动免疫疗法，提取其丈夫或健康无关的第三个体血液里淋巴细胞，注射入妻子皮下，刺激其产生封闭抗体，阻止同种免疫型复发性流产的再发生，从而起到保护胎儿的作用。通过提取秦女士丈夫血液中的淋巴细胞，在秦女士前臂内侧作多点皮内注射，刺激其免疫系统，秦女士已经怀孕6个多月，胎儿发育良好。流产次数越多的患者，体内封闭抗体缺乏的可能性越大。因此专家建议，反复自然流产患者有必要进行封闭抗体检测。
原标题：3年流产6次，因为夫妻基因太相似
提取丈夫淋巴细胞给太太，终于怀上了婚后想要孩子，但是就像中了邪恶的魔咒，南京的秦女士一旦怀上孩子就迅速流产，三年内流产六次，每次都是在12周之前，约84天左右，经过诊断为复发性流产。始终保不住孩子，这让全家人痛苦不已。经过南京市妇幼保健院的诊断，怀疑和夫妻HLA基因相似有关，这导致母体不能产生一种保护胚胎的封闭抗体。
通讯员 孔晓明扬子晚报全媒体记者 于丹丹三年流产六次，夫妻精神崩溃秦女士的丈夫说，三年前刚结婚那会儿，老婆就怀孕了，当时全家都高兴。但是没过多久，老婆就见红，肚子疼然后流产了。“起先我们以为是没注意，肯定磕到碰到肚子了，但是接下来，怀一次流一次。”随后，夫妻俩进行了一系列的身体检查，但是奇怪的是，检查结果一切正常：男方的精子、染色体、女方的宫腔、妇科内分泌等都无异样。听人说，怀孕前期是危险期，需要静卧，于是秦女士干脆辞职，躺在床上，但还是无济于事，一怀孕还是流产。婚后的三年，夫妻也陷入了精神高度紧张状态。秦女士的丈夫说，为了保住孩子，他们忙着查找各种不育资料，他不仅戒了烟，也远远躲着二手烟；怕食品不够安全，都不给老婆吃带添加剂的食品，连腌制品油炸品都不敢碰。夫妻基因太相似,妈妈会产生抗体排斥胎儿南京市妇幼保健院中医不孕不育门诊侯莉莉主任介绍，复发性流产是指妊娠28周之前连续发生三次或三次以上自然流产（包括生化妊娠、胚停、完全流产等），发病率1%～2%。复发性流产病因相当复杂，主要病因包括遗传因素、解剖因素、内分泌因素、免疫因素。“其中免疫因素包括主动免疫缺陷，”侯主任说，正常情况下，有妊娠史的妇女体内存在一种保护胎儿的抗体——封闭抗体。准妈妈怀孕后，绝大多数体内会产生一种封闭抗体，能保护胎儿正常生长发育。而80%～90%的免疫性自然流产的女性，就是因为体内缺乏这种抗体，由于封闭抗体的缺乏，怀孕后母体对胚胎不能保护而遭排斥，导致早期自然流产。为什么有的准妈妈产生不了封闭抗体呢？其中有一种原因，是和夫妻HLA基因相似有关，这一概率在复发性流产的女性中占到10%-40%。侯莉莉主任说，针对秦女士这种患者，可采用淋巴细胞主动免疫疗法，提取其丈夫或健康无关的第三个体血液里淋巴细胞，注射入妻子皮下，刺激其产生封闭抗体，阻止同种免疫型复发性流产的再发生，从而起到保护胎儿的作用。通过提取秦女士丈夫血液中的淋巴细胞，在秦女士前臂内侧作多点皮内注射，刺激其免疫系统，秦女士已经怀孕6个多月，胎儿发育良好。流产次数越多的患者，体内封闭抗体缺乏的可能性越大。因此专家建议，反复自然流产患者有必要进行封闭抗体检测。■相关阅读流产是件伤“心”事事实上不仅堕胎会有损健康，自然流产同样很危险，会增大心脏病的风险。2010年前后，海德堡的德国癌症研究中心就在一项研究中指出，复发性流产将使女性在以后的生活中患心血管疾病的几率增大，这项研究结果后来发表在Heart杂志上。研究者对2500名参与者进行了长达10年的追踪调查，每两到三年请他们填写一份问卷调查。参与调查的人群中有11500名女性曾经怀过孕，其中25%的人至少发生过一次自然流产，18%的人至少做过一次人工流产，另外有2%的人曾经历过死产。而10年间，这2876人中有82人心肌梗死，112人中风。研究指出，每一次死产使心肌梗死的几率增加2.65倍，而复发性流产（流产3次以上）则使该几率增加到9倍。复发性流产会让女性更容易发胖；而那些曾经死产的女性则身体更虚弱且更容易患糖尿病、高血脂和高血压，这些都是引发心脏病或中风的危险因素。雌激素的福利女人一生中如有一次完整的孕育过程就能增加十年的免疫力，主要是针对乳腺癌、卵巢癌等妇科肿瘤。怀孕还可能推迟更年期，减少痛经，简直可以称为妇科外用处方。这些都是因为怀孕使雌激素分泌能有更长的一段时间维持在较高水平上。而不生育或妊娠中断会减少这些福利。果壳
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