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多波长覆盖融合指纹图谱评价不同产地川芎药材差异性
优质期刊推荐川芎道地药材的形成模式、商品规格及其行业标准的研究--《成都中医药大学》2012年博士论文
川芎道地药材的形成模式、商品规格及其行业标准的研究
【摘要】：中药材商品规格划分为历代中药材质量评价实践经验的总结,是中药材质量的综合体现。因其简便易行,快速有效,在市场流通、保证临床安全用药方面发挥了重要作用。现行的部颁《76种药材商品规格标准》为1984年颁布,主要以外观质量及性状特征为主,难以体现药材的综合质量。本研究以著名川产道地药材川芎为研究对象,从感官品质、理化品质、化学成分分析、生物评价等多角度对其商品药材规格划分的科学内涵进行了系统研究,并在此基础上对其商品规格评价指标体系进行重建和提高,制订了川芎药材商品规格行业标准(草案)。主要研究结果如下：
1.文献研究和市场、产地调查
首次对川芎道地药材的形成模式、商品规格进行了梳理和考证。厘定川芎道地药材的形成模式为道地产区独特的生态环境与独有的栽培种植技术相结合的双因素关联决定型；川芎历史上曾出现以产地定规格、以采收期定规格、以产地加工方式定规格、以炮制方法定规格等多种商品规格划分方式,现在执行部颁《76种药材商品规格标准》(1984年版),主要以重量划分为3个等级；对川芎药材商品现状进行了调查,结果表明：川芎药材自种植、流通及临床使用全过程均使用统货；川芎药材种植区正在发生迁移,传统最核心的主产地都江堰川芎种植面积逐年减少,其主产区的位置已为彭州取代,近年眉山市彭山县大量种植川芎,已形成一定的规模。
2.川芎道地药材商品规格评价方法和指标体系的研究
2.1感官评价指标研究
2.1.1川芎传统经验鉴别主征的筛选首次采用“德尔菲法”,对川芎传统鉴别经验进行了整理与规范。结果表明,中部围粗、重量、气、形状4项指标是川芎传统经验鉴别的主征,在川芎商品规格标准中应突出上述判别主征,减少细节或次要信息对经验评价的干扰,可以提高判断准确度和重现性。通过对专家权威程度评判、个人重现性和专家群体重现性分析,表明川芎感官评价经验是客观的、可靠的。专家群体在中部围粗、重量和形状3项指标总体重现性较好,表明易于掌握；气味的和谐系数为0.349,表明该主征不易掌握。
2.1.2电子鼻在川芎药材气味评价中的应用研究
“德尔菲法”研究表明,“气”是川芎传统性状鉴别的重要指标,但因主观性较强,难以重现,不易掌握。本研究首次采用电子鼻对不同产地、等级川芎气味进行了识别研究,结果表明：都江堰、彭州、新都3个传统主产地川芎药材顶空气试样数据接近,而与新产地彭山区别较大；同一产地不同等级川芎药材顶空气试样数据相互接近至重叠,但与等外品苓珠子区别明显。
2.2常规理化检测指标研究
本研究对不同产地、等级的川芎样品中水分、总灰分、酸不溶性灰分、重金属及砷盐、农药残留、醇溶性浸出物进行了测定。结果表明：以现有标准划分川芎商品等级之间无显著性差异,而虫蛀品在总灰分、酸不溶性灰分、醇溶性浸出物等指标上显著降低。川芎中农药残留情况较好,各送检样品均未检出六六六、五氯硝基苯、滴滴涕；但按照《药用植物及其制剂外经贸绿色行业标准》规定,4个产地及药材市场的川芎药材重金属标,其中以铜、镉超标的情况较为严重,砷、汞含量符合限定标准。
2.3化学评价指标研究
2.3.1主要化学成分比较研究
采用紫外分光光度法和荧光分光光度法测定了各药材样品中总酚酸、多糖、总荧光物含量及粉末样品荧光强度,采用高效液相色谱法测定了阿魏酸、藁苯内酯、洋川芎内酯A、欧当归内酯A的含量。结果表明：以现有标准划分的不同等级川芎样品间各成分含量无显著性差异；虫蛀川芎总酚酸含量与正品川芎接近,焦枯品总酚酸含量高于正品川芎,其余各成分含量虫蛀品、焦枯品均显著降低；作为川芎不同栽培品系的红川芎样品,除多糖含量稍低于川芎样品外,其余成分含量与川芎样品一致；藁苯样品在所测化学成分含量上与川芎样品有较大差异,川芎样品中藁本内酯比洋川芎内酯A含量大于2.5倍,而藁本样品中洋川芎内酯A含量约为藁本内酯的2倍；新产地彭山产川芎样品的总酚、藁本内酯、洋川芎内酯A、总荧光物含量明显高于其他产地川芎样品,其余成分含量与其他接近。各样品粉末荧光强度与藁本内酯含量和总荧光物含量相关性分析结果表明：川芎药材的荧光强度与藁本内酯含量和总荧光物含量均呈正相关的直线相关关系,相关系数分别为0.838、0.940,为通过快速测定川芎样品中的荧光强度,快速预测川芎内在品质提供了依据。
2.3.2指纹图谱比较研究
采用顶空固相微萃取/GC-MS技术对各批样品的挥发性成分进行了比较分析,结果表明：新产地彭山产川芎样品中萜类挥发性物质相对含量较其他产区高,苯酞内物质相对含量较低,这可能是彭山川芎在“气味”上区别于其他传统道地产区川芎的内在原因；虫蛀后,川芎各种挥发性成分含量均显著降低,但成分种类及相对含量与正常川芎一致,虫蛀样品与正常样品相似度均0.7；川芎烤焦后挥发性成分种类和相对含量均发生一定变化,烤焦样品与正常样品相似度均0.9；红川芎样品含有挥发性成分种类与川芎样品基本一致,两者相似度均0.9。藁本样品含有挥发性成分与川芎相比存在异同,藁本样品与川芎样品相似度均0.9,表明两者挥发性成分存在较大差异。
建立了川芎药材HPLC指纹图谱,共标定14个共有峰。从各样品图谱与川芎对照指纹图谱比较可知：虫蛀后川芎中阿魏酸、阿魏酸松柏酯等成分含量降低,而化学成分种类基本无变化,虫蛀品与川芎对照指纹图谱相似度0.9；烤焦后川芎除阿魏酸、阿魏酸松柏酯等化学成分含量降低外、还有新成分产生,焦枯品与川芎对照指纹图谱相似度0.7；红川芎样品化学成分种类、含量与川芎基本一致,与川芎对照指纹图谱的相似度为0.958；而藁本样品与川芎对照指纹谱的相似度为0.608,表明二者在化学成分上差异较大。
GC-MS、HPLC指纹图谱相似度评价,不同产地、不同商品规格川芎色谱指纹图谱相似度均0.9,表明以现有标准划分的不同等级川芎样品间化学成分整体比较无显著性差异。
2.4生物评价指标的研究
本研究根据川芎活血行气、祛风止痛的功效,选取了抗凝血活性和抗缩宫素致大子宫平滑肌痉挛的活性进行了测定。以低分子量肝素为对照,以凝血时间对数值为反应值,建立了川芎抗凝血活性的生物检定法；以硫酸镁为对照,采用大鼠离体子宫法,以给药前及给药后子宫的平均肌张力为指标,建立了川芎抗缩宫素致大子宫平滑肌痉挛的活性的生物检定法；并对各药材样品进行了测定。结果表明：川芎水煎液具有体外延长对兔血凝时间的生物活性,川芎醇提液具有对抗缩宫素致大鼠离体子宫平滑肌痉挛的生物活性,但不同产地、不同等级之间活性无显著差异；藁本样品抗凝活性和解痉活性均低于正品川芎；红川芎样品抗凝活性高于川芎,而解痉活性低于川芎；虫蛀品和焦枯品解痉活性较正常川芎明显降低,而抗凝活性虫蛀品与正常川芎无显著性差异、焦枯品其活性约为同产地其他样品的2倍。
2.5各指标体系相关性研究
采用SPSS软件,对川芎生物活性与化学组分分析测定结果进行了相关分析。结果表明：总酚酸含量、欧当归内酯A含量与川芎抗凝血活性呈正相关的直线相关关系,P0.01,具有极显著意义,提示总酚酸、欧当归内酯A可能是川芎抗凝血的主要有效成分。藁本内酯含量、总荧光物含量和川芎抗缩宫素所致大鼠离体子宫平滑肌痉挛活性呈正相关的直线相关关系,P0.05,均具有显著意义,提示川芎中起解痉作用的主要有效成分是以藁本内酯为代表的苯酞类成分。
3.川芎道地药材商品规格行业标准(草案)的制订
从以上各指标研究结果表明,目前主要以药材重量划分等级的川芎商品规格标准与川芎内在质量无显著相关性,但川芎药材有其商品属性,在商品规格标准中应考虑其外观性状、内在有效成分含量和生物活性等诸因素,综合评价川芎药材质量。本文结合《中国药典》2010年版(一部)和《76种药材商品规格标准》中现有川芎标准,初步制订了川芎道地药材商品规格行业标准(草案),商品规格项下增设统货规格,新增总酚酸、多糖、藁本内酯含量测定项,对于保证川芎临床用药安全、有效具有重要作用,同时对其他药材品种商品规格研究具有示范性意义；对于提升和完善我国中药材标准体系有促进意义。
【关键词】：
【学位授予单位】：成都中医药大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2012【分类号】：R282【目录】：
中文摘要3-7Abstract7-181. 前言18-212. 文献研究与商品调查21-31 2.1 川芎道地药材形成模式的梳理与考证21-26
2.1.1 从芎藭到川芎药名的演变21
2.1.2 川芎产地演变与道地产区的形成21-22
2.1.3 川芎道地药材形成模式的分析与探讨22-26
2.1.3.1 生态环境的影响22-24
2.1.3.2 独特的栽培技术24-25
2.1.3.3 社会与经济因素的影响25-26
2.1.4 小结26 2.2 川芎药材商品规格形成模式的梳理26-28 2.3 川芎药材商品调查28-31
2.3.1 调查对象与调查范围28-29
2.3.2 调查结果与分析29-30
2.3.3 小结30-313. 实验研究31-112 3.1 仪器与材料31-33 3.2 基于“德尔菲法”专家评分的川芎药材传统鉴别经验的整理与规范33-37
3.2.1 研究方法33-34
3.2.1.1 专家遴选33
3.2.1.2 咨询问卷的拟定33-34
3.2.1.3 两次“德尔菲法”评审34
3.2.2 统计学处理方法34-35
3.2.2.1 专家权威程度评判34-35
3.2.2.2 川芎感官评价的指标筛选35
3.2.2.3 专家个人的重现率(Rs)35
3.2.2.4 专家群体的重现率35
3.2.3 结果35-37
3.2.3.1 川芎感官评价的核心指标筛选35-36
3.2.3.2 专家权威程度与个人重现性36
3.2.3.3 药材感官评价经验在专家群体内的重现性36-37
3.2.4 小结37 3.3 电子鼻在川芎药材评价中的应用研究37-43
3.3.1 仪器与材料见3.1项下38
3.3.2 实验方法38-43
3.3.2.1 样品准备和检测参数38
3.3.2.2 传感器信号分析38
3.3.2.3 统计学分析38-39
3.3.2.4 结果与分析39-43
3.3.3 小结43 3.4 常规理化检测指标研究43-47
3.4.1 仪器与材料44
3.4.2 水分含量测定44
3.4.3 总灰分、酸不溶性灰分含量测定44-45
3.4.4 醇溶性浸出物含量测定45-46
3.4.5 农残、重金属及砷盐等检测46-47
3.4.6 小结47 3.5 化学品质指标研究47-75
3.5.1 仪器与材料见3.1项下47
3.5.2 阿魏酸含量测定47-50
3.5.3 总酚含量测定50-52
3.5.4 多糖含量测定52-55
3.5.5 川芎中苯酞类成分的含量测定55-66
3.5.5.1 藁本内酯含量测定55-57
3.5.5.2 洋川芎内酯A含量测定57-61
3.5.5.3 欧当归内酯A含量测定61-66
3.5.6 川芎中总荧光物质含量测定66-72
3.5.7 川芎固体粉末中荧光强度测定72-74
3.5.8 小结74-75 3.6 药材化学指纹图谱比较研究75-95
3.6.1 川芎挥发性成分的GC-MS指纹图谱的研究75-84
3.6.2 川芎HPLC指纹图谱的研究84-94
3.6.3 小结94-95 3.7 生物品质指标的研究95-106
3.7.1 仪器与材料96
3.7.2 基于抗凝血活性检测的川芎质量生物测定96-100
3.7.3 基于对抗缩宫素所致大鼠子宫平滑肌收缩痉挛活性检测的川芎质量生物活性测定100-105
3.7.4 小结105-106 3.8 各指标体系相关性研究106-108
3.8.1 化学成分与生物效价相关性分析106-107
3.8.1.1 抗凝血活性与川芎中化学成分含量相关性分析106-107
3.8.1.2 抗缩宫素所致大鼠离体子宫平滑肌痉挛活性川芎中化学成分含量相关性分析107
3.8.2 化学指纹图谱与生物效价的关联分析107-108
3.8.2.1 抗凝血活性与川芎中化学成分含量相关性分析107-108
3.8.2.2 抗缩宫素所致大鼠离体子宫平滑肌痉挛活性川芎HPLC指纹谱相关性分析108 3.9 川芎道地药材商品规格行业标准(草案)的制订108-112
3.9.1 指标优化选择108-109
3.9.2 川芎道地药材商品规格行业标准(草案)109-1124. 结论与讨论112-115参考文献115-117致谢117-118在校期间公开发表的学术论文、专著及科研成果118-119
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