PTK7在食管鳞状细胞癌中的表达及临床意义--《南方医科大学》2012年硕士论文
PTK7在食管鳞状细胞癌中的表达及临床意义
【摘要】：目的与背景：
1、食管癌是人类常见的恶性肿瘤之一,Ahmed in Jemal等的报告显示,2008年全球新发癌症病例1270万中食管癌高居全球恶性肿瘤发病率的第8位,死亡率第6位；在发展中国家男女发病率约有26.6万和13.8万人,分别排在第5位和第8位,死亡率却男性高达22.3万,女性死于食管癌有11.6万,分别排在第4位和第7位。我国食管癌发病率为13/10万,尤其以太行山周边的河北、河南及山西广东的部分地区为高发地区。以往的研究发现,食管癌是遗传因素和环境因素综合作用的结果,对食管癌高发区的流行病学研究表明,食管癌发病具有一定的家族聚集性,在我国华北食管鳞状细胞癌高发区的人群中,存在着一个符合孟德尔隐性遗传规律主基因或主基因群,与该地区人群的食管鳞状细胞癌易感性有关；对环境因素的研究表明,诱发食管癌的危险因素包括饮食习惯、营养因素、微量元素和癌前病变等多方面作用。亚硝胺类化合物是公认的强致癌物,酸菜、腌制和发霉食物均含有亚硝胺类化合物和真菌毒素。食管癌包括鳞状细胞癌和腺癌,在我国食管癌以鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma, SCC)为主,也有部分腺癌(adenocarcinoma, ADC)。人类食管癌是多步骤进展性的过程,食管上皮恶变的过程包括不典型增生、原位癌和晚期浸润癌。由于食管的特殊解剖部位,食管癌的早期诊断比较困难,通常患者出现症状后才就诊。因此,食管癌的治疗效果较差,其发病率接近死亡率。若在食管癌发生的早期发现病变并加以治疗,可大为提高生存率。所以研究关键基因在这一过程关键步骤中的表达改变不仅有助于理解食管癌癌变机理而且对食管癌的预防、早期诊断和治疗有重要的意义。随着分子生物学的发展,特别是近二十年来,人们对食管癌发病机制的认识得到了突飞猛进的发展,由过去单一的物理致癌、化学致癌、突变致癌学说上升到多步骤、多因素、多基因变异累积的综合致癌理论。分子生物学研究表明,肿瘤的发生、发展是多阶段、多基因参与、多种调控的过程,涉及一系列病理生理反应,包括细胞的异常增殖、黏附、运动、细胞外基质降解,血管生成等。目前已经开展很多关于食管癌形态学和临床病理特征的相关研究,但是到目前为止仍然没有找到一种具有临床实用价值的预测因子。如能很好的判断预后,对筛选高危病人及帮助制定个体化治疗方案大有裨益。
2、酪氨酸蛋白激酶(protein tyrosine kinase, PTK)是一类催化ATP上γ-磷酸转移到蛋白酪氨酸残基上的激酶,能催化多种底物蛋白质酪氨酸残基磷酸化,在细胞生长、增殖、分化中具有重要作用。迄今发现的蛋白酪氨酸激酶中多数是属于致癌RNA病毒的癌基因产物,也可由脊椎动物的原癌基因产生。根据PTK是否存在于细胞膜受体可将其分成非受体型和膜受体型。非受体型以Src基因产物为代表,此外还有Yes、Fyn、Lck、Fgr、Lyn、Fps/Fes及Abl等。除后两者外,其余非受体型蛋白酪氨酸激酶Src家族分子量约为60kDa的蛋白质,它们之间除了N末端80个氨基酸组成不同外,其作部分都非常相似。膜受体型：根据它们的结构不同,受体型酪氨酸激酶可以分为9种类型,其中较常见的有4种类型,包括表皮生长因子受体(EGFR)家族、胰岛素受体家族、PDGF/MCSF/SCF受体家族、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)家族。酪氨酸蛋白激酶-7(PTK7)是一种催化活性的受体酪氨酸激酶(RTK),它也被称为结肠癌激酶4(CCK4),是一个比较新,研究甚少的RTK家族的成员。它包含7个免疫球蛋白样环胞外域,跨膜结构域和催化活性的酪氨酸激酶域。PTK7在许多共同的人类恶性肿瘤中出现高表达,包括结肠癌,肺癌,胃癌和急性髓细胞白血病。目前已知PTK7作为PTK7/0tk的一个多功能的共同受体,参与Wnt、Semaphorin/Plexin和血管内皮生长因子所介导的信号传导通路中起到分子开关功能。众所周知Wnt信号通路是广泛存在于多细胞真核生物中的一条高度保守的信号通路,在胚胎发育过程中起到重要作用,而且与许多人类肿瘤的发生发展也具有密切关系。在Wnt信号途径之间的选择是由Fz的共同受体的存在。LRP6的激活经典Wnt通路,而PTK7和ROR激活非经典Wnt通路,PTK7有利于β-catenin的稳定性和转录活性,从而促进肿瘤的生长。而且在Semaphorin/Plexin和血管内皮生长因子(VEGF)信号通路起重要作用；PTK7/Otk参与Semaphorin/Plexin和血管内皮生长因子信号通路的共同受体功能。在PTK7参与下,PlexinAl与血管内皮生长因子-2形成一个可以抑制或刺激细胞迁移起调节作用；PTK7/血管内皮生长因子一1可以促进肿瘤血管内皮细胞迁移和血管形成。Shin WS利用能溶解PTK7的sPTK7中和内源性PTK7,从而抑制血管内皮生长因子(VEGF)诱导管形成、迁移,实验证明PTK7对血管形成,迁移和血管内皮细胞的入侵,而且在血管生成中起着重要的作用。wnt信号通路及Semaphorin/Plexin因子及血管内皮生长因子所介导的传导通路均参与了食管鳞状细胞癌的发生发展、侵袭、转移。所以食管鳞状细胞癌的表达可能与以上三条信息传导通路有关。
本研究应用PTK7(protein tyrosine kinase7)蛋白在食管鳞状细胞癌、癌旁组织中表达及与食管鳞状细胞癌的发展、侵袭、淋巴结转移的关系,PTK7表达与临床之间的关系,分析其在食管鳞癌中的诊断价值及预后变化。
材料与方法：
1、对象的选择、组织样本的采集与资料的收集,选取广东省揭阳市人民医院肿瘤中心从2003年1月份至2006年12月份的成年食管鳞状细胞癌手术患者作为研究对象,进行电话随访416例,并收集病人的性别、年龄、家族史、淋巴结转移、病理类型、肿瘤位置、肿瘤大小、病理分级、浸润深度以及临床分期等方面的资料,用于统计分析和研究。符合研究条件的患者食管癌原发灶80例及其匹配的正常食管组织标本(经病理学鉴定)63例。其中男性59例,女性21例,年龄41-78岁,全部患者术前均未经过放化疗。并取其病理标本。
2、PTK7蛋白水平的测定采用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结(streptavidin-perosidase, SP)法检测其中PTK7蛋白的表达,标本取材后以10%福尔马林固定,制作蜡块并切片3张,分别行HE染色复查诊断和组织学分级、免疫组织化学染色检测PTK7蛋白的表达。细胞浆和/或细胞核中出现棕黄色颗粒的细胞为阳性细胞。随机观察1000个癌细胞,PTK7染色结果的判断标准：细胞质内出现弥漫分布的棕黄色颗粒为阳性,按染色强度和阳性细胞数,计数阳性细胞染色程度及阳性细胞百分比,综合评分来判定阳性和阴性。
3、生存分析2003年1月份至2006年12月份期间,对研究对象进行随访。患者手术治疗作为生存的起始事件,随访时间作为观察的终止时刻,以死亡作为终点事件,终点事件与起始事件之间的时间间隔定义为患者的生存时间。
4、统计学分析运用SPSS.13.0统计软件进行数据分析处理,采用x2检验分析PTK7的表达、PTK7与食管鳞癌患者年龄、性别、肿瘤分化程度和浸润深度、有无淋巴结转移等临床病理因素的关系。P0.05为有统计学意义,采用Kaplan-meier生存曲线分析及两组生存时间的比较采用log-rank检验,了解PTK7表达与生存率的关系,P0.05为有统计学意义。
1、80例食管鳞状细胞癌组织中45例PTK7的表达阳性,63例癌旁组织(包括正常组织细胞及不典型细胞增生)均无PTK7表达,经x2检验,PTK7表达有统计学意义(P0.001)PTK7的阳性产物主要定位于癌组织中靠近细胞膜的胞浆部分表达明显,少数也可见于细胞膜,呈棕黄色颗粒。
2、食管鳞状细胞癌组织中PTK7的蛋白表达与临床参数包括患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤的分化程度、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、临床分期等进行分析,经x2检验,均无统计学意义(P0.05)。
3、食管癌组织中PTK7蛋白表达在80例食管鳞癌患者进行生存分析,其中阳性45例,阴性35例。进行60个月的生存分析,两者之间差异不明显,无统计学意义(P0.05)。当设定肿瘤组织PTK7蛋白表达综合免疫组化评分≥5分时为阳性,5分为阴性,阳性14例,阴性66例,阳性者5年生存率稍微下降(χ2=3.350P=0.060)。
结论：PTK-7表达与食管鳞癌有一定的关系,而食管癌旁不典型增生及正常鳞状上皮均无表达；食管鳞状细胞癌组织中PTK7的蛋白表达与临床参数包括患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤的分化程度、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、临床分期均无相关性；对PTK7蛋白表达的食管鳞状细胞癌患者进行生存分析。两者之间差异不明显,无统计学意义；但当肿瘤组织PTK7蛋白表达综合免疫组化评分≥5分与低于5分进行比较分析,5年生存率稍微下降。有助于综合判断食管鳞癌的相关性和临床预后。
【关键词】：【学位授予单位】：南方医科大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2012【分类号】：R735.1【目录】：
摘要3-8ABSTRACT8-16前言16-211 材料与方法21-27 1.1 材料21-24 1.2 实验方法24-26 1.3 免疫组织化学结果判断标准26 1.4 统计学处理26-272 结果27-39 2.1 食管解状细胞癌患者的临床资料27-31 2.2 结果31-393 讨论39-434 结论43-44参考文献44-48致谢48-50统计学证明50-51
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京公网安备74号食管鳞状细胞癌易感基因定位研究--《郑州大学》2011年博士论文
食管鳞状细胞癌易感基因定位研究
【摘要】：1研究背景和目的
食管癌是世界上最常见的六大恶性肿瘤之一,显著的地域性分布差异和家族聚集现象提示环境和遗传因素在食管癌发生中均起重要作用。既往研究表明遗传改变在食管癌变过程中有重要意义,但由于缺乏在大规模人群研究中识别遗传改变的高通量技术,有关食管癌变的分子机制尚不明确。
全基因组关联分析(genome-wide association study, GWAS)是一种高通量的生物芯片技术,被公认为是识别复杂疾病易感基因的一项技术突破。目前,GWAS在寻找结肠癌、胰腺癌等恶性肿瘤高风险单核苷酸多态性(single nucleiotide polymorphism, SNP)上已取得迅猛进展,但基于病例-对照设计的中国食管癌的GWAS研究罕见报道。
本研究旨在通过大样本的病例-对照研究,分析中国人群ESCC的遗传倾向(家族史)特征,采用GWAS技术筛选易感SNP位点和基因,并分析其与吸烟、饮酒、BMI和ESCC发生的相关性。
2材料及方法
2.1食管癌遗传倾向(家族史)研究
2.1.1研究对象
采用病例-对照研究方法。病例组调查ESCC患者39833例(男24498例,女15335例),全部经病理学确诊；对照组调查健康个体9242例(男6083例,女3159例),均经胃镜检查排除早期ESCC和其它上消化道肿瘤。吸烟、饮酒、身高和体重资料齐全的ESCC患者4229例(男2316例,女1913例),健康对照4133例(男1947例,女2186例)。病例资料来自全国ESCC高、低发区45家医院,对照组资料源于上述医院胃镜室。
2.1.2研究方法
流行病学调查采用问卷调查方式,内容包括：家族史、吸烟、饮酒、身高和体重等信息,所有信息录入EXCEL软件,SPSS 17.0统计软件处理,组间比较采用卡方检验,检验标准取α=0.05。
2.2全基因组关联分析(GWAS)
2.2.1研究对象
进入GWAS研究共21496例。其中初筛2810例(病例组1077例,对照组1733例),验证18686例(病例组7673例,对照组11013例),均为中国汉族人。采集每位患者及正常对照3-5ml外周静脉血,-20℃储存。
2.2.2研究方法
用德国QIAGEN基因组DNA提取试剂盒提取血液样本基因组DNA,准确测定每份待标化样本DNA的浓度,用于初筛的DNA浓度保持在50ng/μ1,OD值在1.8-2.0之间,用于验证的DNA浓度保持在15ng-20ng/ul,OD值在1.7-2.0之间。初筛选用Illumina Human 610-Quad芯片，验证选择Sequenom iPLEX芯片。
计算样本得率、SNP得率、最小等位基因频率(minor allele frequency,MAF)、哈迪·温伯格(Hardy-W HWE)(?)平衡律。对质控后的数据用Plink1.03软件分析并输出结果,用Cochran-Armitage趋势检验计算P值、优势比(Odds ratio,OR)和95%可信区间(95%confidence interval,95%CI)。吸烟、饮酒、BMI亚组分析使用SPSS 17.0统计软件处理,进行卡方检验、Logistic回归分析,检验标准取α=0.05。
2.3免疫组织化学研究
138例ESCC手术切除标本中来自高发区43例、低发区95例,家族史阳性41例、阴性97例；131例癌前病变和59例正常对照组织取自138例手术切除标本。免疫组织化学实验采用本实验室已建立的卵白素-生物素-辣根过氧化氢酶复合物(ABC)方法。SPSS17.0统计软件处理,组间比较采用卡方检验,检验标准取α=0.05。
3.1 ESCC家族史调查结果
高发区ESCC患者FH+比例明显高于低发区(34%vs21%),且男性和女性结果一致(分别为34%vs24%；33%vs22%)(P＜0.001)。
吸烟、饮酒者全部为男性,女性均否认吸烟和饮洒。吸烟、饮酒者FH+比例在病例组和对照组均无差异(P＞0.05)。I级BMI在病例组所占比例显著多于对照组(27%vs6%,P＜0.001),Ⅱ级BMI在病例组所占比例和对照组相似(63%vs63%,P＞0.05),而Ⅲ级和Ⅳ级BMI在病例组所占比例显著低于对照组(11%vs30%,P＜0.001)。病例组FH+者Ⅰ级、Ⅱ级BMI所占比例与FH-者均无差异,病例组FH+者Ⅲ级和Ⅳ级BMI所占比例低于FH-者(8%vs12%,P＜0.001)。高发区和低发区病例组各级别BMI所占比例均无统计学差异(P＞0.05)。
3.2全基因组关联分析结果
通过初筛分析,筛选出18个有价值的SNPs (single nucleotide polymorphisms),在18686例样本(7673例病例和11013例对照)中,进行了高通量的验证。2个SNPs显示出了独立的关联证据：10q23上的rs2274223(P=7.46E-56,OR=1.43,95%CI=1.37-1.49)(?)(?)20p13上的rs(P=1.21E-11,OR=0.86,95%CI=0.82-0.90)。分析了目标SNP和其相关区域重组和链锁不平衡类型之后,2个SNPs分别定位于10q23的PLCE1基因和20p13的C20orf54基因上
PLCE1基因多态性rs2274223位点在吸烟/不吸烟、饮酒/不饮酒、各级BM1人群中都与ESCC有关。但经Breslow-Day异质性检验,发现吸烟、饮酒、Ⅱ级和Ⅲ+Ⅳ级BMI对rs2274223位点的效应无明显影响(吸烟/不吸烟：P异质性=0.37；饮酒/不饮酒：P异质性=0.27；Ⅱ级和Ⅲ+Ⅳ级BMI：P异质性=0.14)。在Ⅰ级BMI人群中经卡方检验发现等位基因分布均具有显著差异(P＜0.05),单因素Logistic回归分析表明,AG、GG基因型与ESCC显著相关(P＜0.05),在调整年龄、性别、高低发区、家族史等因素后无显著相关性(P＞0.05)。
C20orf54基因多态性位点rs在吸烟/不吸烟、饮酒/不饮酒、及Ⅰ级/Ⅲ+Ⅳ级BMI人群中经卡方检验发现等位基因分布均无显著差异(P＞0.05),在Ⅱ级BMI人群中卡方检验发现等位基因分布有显著差异(P＜0.05),经单因素Logistic回归分析表明,TC、CC基因型与ESCC显著相关(P＜0.05),调整年龄、性别、高低发区、家族史等因素后无显著相关性(P＞0.05)。
3.3免疫组织化学染色结果
随食管癌变过程的发展,即正常→癌前病变→浸润癌各级组织中PLCE1蛋白阳性表达率逐渐升高,分别为41%、82%、83%,有显著的统计学差异(P＜0.05)。PLCE1蛋白表达与家族史及高低发区均无相关性(P＞0.05)。
4.1本研究在国际上首次发现了与中国人群ESCC发病显著相关的2个重要易感位点rs2274223、rs,并分别定位于10q23的PLCE1基因和20p13的C20orf54基因上
4.2携带PLCE1基因多态性位点rs2274223 AG、GG基因型比携带AA型的中国人群发生ESCC的风险增高,G等位基因增加ESCC患病风险(P=7.46E-56,OR=1.43,95%=1.37-1.49),携带C20orf54 T等位基因降低ESCC患病风险(P=1.21 E-11,OR=0.86,95%=0.82-0.90)。
4.3 rs2274223在吸烟/不吸烟、饮酒/不饮酒、及各级BMI人群中都与ESCC有相关性；但吸烟、饮酒、BMI对rs2274223的效应无明显影响。rs在吸烟/不吸烟、饮酒/不饮酒、及各级BMI人群中未观察到与ESCC的相关性。
4.4免疫组织化学研究提示：PLCE1蛋白表达变化在食管癌变过程中起重要作用。
4.5大样本量家族史调查发现：ESCC肿瘤遗传易感性明显,高发区FH+患者可能具有更高的肿瘤遗传易感性。在中国,吸烟、饮酒与ESCC发生无明显关联,体重过低者可能增加ESCC风险。
【关键词】：
【学位授予单位】：郑州大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2011【分类号】：R735.1【目录】：
Abstract8-19
1 论文第一部分 食管鳞状细胞癌遗传倾向(家族史)的病例-对照研究19-40
1.1 研究背景19-21
1.2 材料与方法21-24
1.2.1 研究对象21
1.2.2 ESCC肿瘤家族史阳性/阴性标准21-22
1.2.3 ESCC高、低发区划分22
1.2.4 吸烟、饮酒分级标准22
1.2.5 体重指数的计算及分级22
1.2.6 调查数据来源22
1.2.7 流行病学调查22-23
1.2.8 质量控制23-24
1.2.9 调查相关信息的电子计算机录入24
1.2.10 统计学分析24
1.3 结果24-29
1.3.1 病例组和健康对照组肿瘤家族史特征24-26
1.3.2 吸烟人群肿瘤家族史特征26
1.3.3 饮酒人群肿瘤家族史特征26-27
1.3.4 体重指数和ESCC关系分析27-29
1.3.4.1 ESCC患者与健康对照组人群各级体重指数特征27
1.3.4.2 肿瘤家族史阳性/阴性ESCC患者各级体重指数特征27-28
1.3.4.3 不同性别ESCC患者各级体重指数特征28-29
1.3.4.4 高、低发区ESCC患者各级体重指数特征29
1.4 讨论29-34
1.5 小结34-35
1.6 参考文献35-40
2 论文第二部分 中国人食管鳞状细胞癌易感基因的全基因组关联分析研究40-75
2.1 研究背景40-42
2.2 材料及方法42-54
2.2.1 研究对象42
2.2.2 入组标准42-43
2.2.3 实验试剂43-44
2.2.4 实验仪器44-46
2.2.5 分析软件和电子数据库查询信息46
2.2.6 实验方法和步骤46-54
2.2.6.1 基因组DNA制备46-48
2.2.6.2 基因分型48-53
2.2.6.3 统计学分析53-54
2.3 结果54-63
2.3.1 初筛结果54
2.3.2 验证结果54
2.3.3 基因定位54-55
2.3.4 基因功能55
2.3.5 吸烟、饮酒、BMI亚组分层分析55-63
2.3.5.1 吸烟/不吸烟亚组基因多态性分析55-57
2.3.5.2 饮酒/不饮酒亚组基因多态性分析57-60
2.3.5.3 不同BMI亚组基因多态性分析60-63
2.4 讨论63-67
2.5 小结67-68
2.6 参考文献68-75
3 论文第三部分 PLCE1 基因功能的初步研究——免疫组织化学染色75-82
3.1 研究背景75
3.2 材料和方法75-77
3.2.1 研究对象75-76
3.2.2 试剂76
3.2.3 实验方法76-77
3.2.4 对照77
3.2.5 免疫组化阳性分级标准77
3.2.6 统计学方法77
3.3 结果77-78
3.3.1 食管癌变不同阶段组织中PLCE1蛋白的表达结果77-78
3.3.2 PLCE1蛋白表达与家族史的关系78
3.3.3 PLCE1蛋白表达与高、低发区的关系78
3.4 讨论78-80
3.5 小结80-81
3.6 参考文献81-82
综述182-106
参考文献95-106
综述2106-135
参考文献121-135
致谢135-136
附录136-149
个人简历149
博士研究生学习期间发表的文章及参加的国际会议149-150
博士研究生学习期间参加的科研项目150
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【参考文献】
中国期刊全文数据库
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