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酵母双杂交技术作为发现和研究在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，在近几年来得到了广泛运用。酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。因此，它在许多的研究领域中有着广泛的应用。本文就酵母双杂交的技术平台和应用加以介绍。
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蛋白质组学研究方法：抗体芯片
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蛋白质组，蛋白质组学及研究技术路线
基因组(genome)包含的遗传信息经转录产生mRNA，一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的mRNA称为转录子组(transcriptome)。很显然，不同细胞在不同生理或病理状态下转录子组包含的mRNA的种类不尽相同。mRNA经翻译产生蛋白质，一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的蛋白质称为蛋白质组(proteome)。同理，不同细胞在不同生理或病理状态下所表达的蛋白质的种类也不尽相同。蛋白质是基因功能的实施者，因此对蛋白质结构，定位和蛋白质-蛋白质相互作用的研究将为阐明生命现象的本质提供直接的基础。
　　生命科学是实验科学，因此生命科学的发展极大地依赖于实验技术的发展。以DNA序列分析技术为核心的基因组研究技术推动了基因组研究的日新月异，而以基因芯片技术为代表的基因表达研究技术为科学家了解基因表达规律立下汗马功劳。在蛋白质组研究中，二维电泳和质谱技术的黄金组合又为科学家掌握蛋白质表达规律再铸辉煌。蛋白质组学(proteomics)就是指研究蛋白质组的技术及这些研究得到的结果。
　　蛋白质组学的研究试图比较细胞在不同生理或病理条件下蛋白质表达的异同，对相关蛋白质进行分类和鉴定。更重要的是蛋白质组学的研究要分析蛋白质间相互作用和蛋白质的功能。
　　蛋白质组学的研究内容包括：
　　1.蛋白质鉴定：可以利用一维电泳和二维电泳并结合Western等技术，利用蛋白质芯片和抗体芯片及免疫共沉淀等技术对蛋白质进行鉴定研究。
　　2.翻译后修饰：很多mRNA表达产生的蛋白质要经历翻译后修饰如磷酸化，糖基化，酶原激活等。翻译后修饰是蛋白质调节功能的重要方式，因此对蛋白质翻译后修饰的研究对阐明蛋白质的功能具有重要作用。
　　3.蛋白质功能确定：如分析酶活性和确定酶底物，细胞因子的生物分析/配基-受体结合分析。可以利用基因敲除和反义技术分析基因表达产物-蛋白质的功能。另外对蛋白质表达出来后在细胞内的定位研究也在一定程度上有助于蛋白质功能的了解。Clontech的荧光蛋白表达系统就是研究蛋白质在细胞内定位的一个很好的工具。
　　4.对人类而言，蛋白质组学的研究最终要服务于人类的健康，主要指促进分子医学的发展。如寻找药物的靶分子。很多药物本身就是蛋白质，而很多药物的靶分子也是蛋白质。药物也可以干预蛋白质-蛋白质相互作用。
　　在基础医学和疾病机理研究中，了解人不同发育、生长期和不同生理、病理条件下及不同细胞类型的基因表达的特点具有特别重要的意义。这些研究可能找到直接与特定生理或病理状态相关的分子，进一步为设计作用于特定靶分子的药物奠定基础。
　　不同发育、生长期和不同生理、病理条件下不同的细胞类型的基因表达是不一致的，因此对蛋白质表达的研究应该精确到细胞甚至亚细胞水平。可以利用免疫组织化学技术达到这个目的，但该技术的致命缺点是通量低。LCM技术可以精确地从组织切片中取出研究者感兴趣的细胞类型，因此LCM技术实际上是一种原位技术。取出的细胞用于蛋白质样品的制备，结合抗体芯片或二维电泳-质谱的技术路线，可以对蛋白质的表达进行原位的高通量的研究。很多研究采用匀浆组织制备蛋白质样品的技术路线，其研究结论值得怀疑，因为组织匀浆后不同细胞类型的蛋白质混杂在一起，最后得到的研究数据根本无法解释蛋白质在每类细胞中的表达情况。虽然培养细胞可以得到单一类型细胞，但体外培养的细胞很难模拟体内细胞的环境，因此这样研究得出的结论也很难用于解释在体实际情况。因此在研究中首先应该将不同细胞类型分离，分离出来的不同类型细胞可以用于基因表达研究，包括mRNA和蛋白质的表达。
　　LCM技术获得的细胞可以用于蛋白质样品的制备。可以根据需要制备总蛋白，或膜蛋白，或核蛋白等，也可以富集糖蛋白，或通过去除白蛋白来减少蛋白质类型的复杂程度。相关试剂盒均有厂商提供。
　　蛋白质样品中的不同类型的蛋白质可以通过二维电泳进行分离。二维电泳可以将不同种类的蛋白质按照等电点和分子量差异进行高分辨率的分离。成功的二维电泳可以将种蛋白质进行分离。电泳后对胶进行高灵敏度的染色如银染和荧光染色。如果是比较两种样品之间蛋白质表达的异同，可以在同样条件下分别制备二者的蛋白质样品，然后在同样条件下进行二维电泳，染色后比较两块胶。也可以将二者的蛋白质样品分别用不同的荧光染料标记，然后两种蛋白质样品在一块胶上进行二维电泳的分离，最后通过荧光扫描技术分析结果。
　　胶染色后可以利用凝胶图象分析系统成像，然后通过分析软件对蛋白质点进行定量分析，并且对感兴趣的蛋白质点进行定位。通过专门的蛋白质点切割系统，可以将蛋白质点所在的胶区域进行精确切割。接着对胶中蛋白质进行酶切消化，酶切后的消化物经脱盐/浓缩处理后就可以通过点样系统将蛋白质点样到特定的材料的表面（MALDI-TOF）。最后这些蛋白质就可以在质谱系统中进行分析，从而得到蛋白质的定性数据;这些数据可以用于构建数据库或和已有的数据库进行比较分析。实际上像人类的血浆，尿液，脑脊液，乳腺，心脏，膀胱癌和磷状细胞癌及多种病原微生物的蛋白质样品的二维电泳数据库已经建立起来，研究者可以登录www.expasy.ch/www/tools.html等网站进行查询，并和自己的同类研究进行对比分析。
　　Genomic Solution可以为研究者提供除质谱外的所有蛋白质组学研究工具，包括二维电泳系统，成像系统及分析软件，胶切割系统，蛋白质消化浓缩工作站，点样工作站等；同时还可以提供相关试剂和消耗品。
　　LCM-二维电泳-质谱的技术路线是典型的一条蛋白质组学研究的技术路线，除此以外，LCM-抗体芯片也是一条重要的蛋白质组学研究的技术路线。即通过LCM技术获得感兴趣的细胞类型，制备细胞蛋白质样品，蛋白质经荧光染料标记后和抗体芯片杂交，从而可以比较两种样品蛋白质表达的异同。Clontech最近开发了一张抗体芯片，可以对378种膜蛋白和胞浆蛋白进行分析。该芯片同时配合了抗体芯片的全部操作过程的重要试剂，包括蛋白质制备试剂，蛋白质的荧光染料标记试剂，标记体系的纯化试剂，杂交试剂等。
　　对于蛋白质相互作用的研究，酵母双杂交和噬菌体展示技术无疑是很好的研究方法。Clontech开发的酵母双杂交系统和NEB公司开发的噬菌体展示技术可供研究者选用。
　　关于蛋白质组的研究，也可以将蛋白质组的部分或全部种类的蛋白质制作成蛋白质芯片，这样的蛋白质芯片可以用于蛋白质相互作用研究，蛋白表达研究和小分子蛋白结合研究。 Science，Vol. 293，Issue -2105，September 14，2001发表了一篇关于酵母蛋白质组芯片的论文。该文主要研究内容为：将酵母的5800个ORF表达成蛋白质并进行纯化点样制作芯片，然后用该芯片筛选钙调素和磷脂分子的相互作用分子。
　　最后有必要指出的是，传统的蛋白质研究注重研究单一蛋白质，而蛋白质组学注重研究参与特定生理或病理状态的所有的蛋白质种类及其与周围环境(分子)的关系。因此蛋白质组学的研究通常是高通量的。适应这个要求，蛋白质组学相关研究工具通常都是高度自动化的系统，通量高而速度快，配合相应分析软件和数据库，研究者可以在最短的时间内处理最多的数据。
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Genomic Solution Inc. 蛋白质组学研究系列仪器及软件
人体内真正发挥作用的是蛋白质，蛋白质扮演着构筑生命大厦的“砖块”角色，随着破译生命密码的人类基因组计划进入尾声，一个以蛋白质和药物基因学为研究重点的后基因组时代已经拉开序幕，蛋白质将是今后的重点研究方向之一。然而，蛋白质的分离和鉴定非常费时，目前测定蛋白质的技术远远落后于破译基因组的工具，最好的实验室每天只能分离和识别出100种蛋白质。据估计，人体内可能有几十万种蛋白质，这大概需要10年时间进行识别。
　　为了加快蛋白质组学研究进程，以专业生产蛋白质组学研究设备而著称的美国Genomic Solution Inc.公司开发了完整的蛋白质组学解决方案，由一系列机械手臂与软件，并结合了二维电泳实验设备与质谱仪，可以进行高效、自动化且具重复性的试验分析。在Genomic solution值得信赖的技术平台上，你的研究工作将更富成效，重复性更好。在这一整套Investigator平台上，各仪器之间配合无隙，由于它的整合性及标准性，使得研究进程大大加快，原来需要9—12个月才能获得数据结果发表的时间减少到9—12周。这套完整的系统具备蛋白质组研究所需的众多功能：2-D电泳、图像获取、2-D胶分析、蛋白样品切割、蛋白消化、MALDI样品准备、消化及点样、数据分析整合，再加上制备好的胶、试剂及附件，使研究工作可以立即展开。此套设备为进行蛋白质组学研究的利器,大大加速了蛋白质分离和鉴定的速度。该系统主要由以下几部分组成：
　　一、2-D电泳系统（Investigator? 2-D Electophoresis System）
　　该系统主要进行2D PAGE第一向等电聚焦凝胶电泳和第二向SDS-PAGE电泳，设备包括2-D电泳系统所需的各种设备，如pHaser?（IPG胶条电泳）、管状制胶设备、二维电泳装置、电源设备、半导体冷却器及各种相关的蛋白纯化试剂盒。
　　产品特征：
　　 * 提供2D PAGE电泳所需的各种设备，使电泳更加简便，大大节约研究时间
　　 * 高分辨率：有效的第一向等电聚焦凝胶电泳和23cm X 23cm第二向SDS-PAGE大面积板胶提供清晰的电泳图像，有效提高单体、磷酸化和糖基化蛋白的分离
　　 * 大容量：可同时容纳15块1mm一维管状胶，或8块2-3mm管状胶；10块IPG胶条和10块二维电泳板胶
　　 * 灵活性：该系统用于管状胶、IPG 胶条、预制胶、自制胶和SDS PAGE胶使用
　　 * 恒温：高效的半导体制冷装置保证电泳体系温度恒定，温度变化& 0.5℃
　　 * 专门为高分辨率2D PAGE而设计的电源系统
　　 * 提供超纯的相关化学试剂和药品
　　二、蛋白凝胶成像系统（Investigator? ProImage）
　　ProImage专业的蛋白凝胶成像系统提供高灵敏度、高分辨率的大面积蛋白凝胶成像和分析。
　　产品特征：
　　* 高灵敏度，高分辨率数字成像系统
　　* 12 bit冷CCD数码相机系统，大大提高图像信噪比
　　* 提供白光和紫外光源,可对银染、荧光、胶片、考马斯亮蓝、EB染色图像进行数字化
　　* 可以配合HT PC Analyzer蛋白质组学分析软件进行各种图像分析
　　* 多用途暗箱，保证无任何光线泄漏，免除实验室的暗房设备
　　* 对高灵敏蛋白荧光染色剂SYPRO? Ruby染色图像进行最优化
　　* 光照均匀，最大成像面积达25 x 28 cm
　　三、蛋白质点自动切取机器人平台（Investigator? ProPic Workstation）
　　Investigator? ProPic工作站主要用于2-D蛋白凝胶上蛋白质点的自动切取，可对考马斯亮蓝、银染、荧光染色的蛋白凝胶进行操作，广泛应用于制药公司、大学和重点研究所等进行高通量蛋白质组学研究的单位。Investigator ProPic是第一个将2-D凝胶成像分析和蛋白质点自动切取两个功能整合在一起的机器人工作站，主要为蛋白质组学研究的后续分析采集和提供样品，该产品市场占有率在同类产品中最高。
　　产品组成：
　　* 硬件部分：密闭暗箱及带有XYZ机器人手臂，具有100mm的切割精度，内置可换光源（白光和紫外光源），能容纳8块96微孔样品板的样品盘，并装配Gilson泵系统和12位高分辨率冷CCD数码相机的成像系统。凝胶成像和蛋白质点切取功能的整合，使得成像后凝胶不必移动而原位切取，避免移动过程中产生的位移和污染；切取结束后，可再次原位成像，检查切取结果准确性；可对操作过程实时监控。切取速度达120个/小时；全封闭的操作环境，有效防止角蛋白污染；超声水浴清洗和泵冲洗两种方式清洗枪头，有效防止样品交叉污染；污染最小化。内置水合装置，有效避免操作过程中因凝胶变干而影响切取准确性和样品回收率。
　　* 软件： HT Investigator PC Analyzer and Database,能进行高通量的蛋白凝胶图像分析，功能强大,处理量大；专业软件ProPic能自动控制数码相机曝光和切割机器人的采样操作；可由软件分析自动生成蛋白质点切取列表，亦可通过手动的point-click模式生成切取列表，在8小时的操作周期内无需专人管理，完全自动化，结果可靠。操作系统：Microsoft Windows 98/NT。
　　四、蛋白凝胶图像分析专业软件（Investigator? HT PC Analyzer）
　　该软件适用于大规模、高通量蛋白质组学研究实验室，能快速处理大量2-D蛋白电泳凝胶图像，能够对蛋白质点进行自动识别、定量和比较；软件功能强大、界面友好，容易使用。
　　产品特征：
　　* 能自动识别、定量和比较2-D蛋白凝胶图像;
　　* 自动计算2-D凝胶上蛋白质点的分子量和pI值；
　　* 能自动生成蛋白表达量变化曲线或柱形图
　　* 自动化、批处理和强大的编辑功能大大加快研究进程
　　* 通过创建True Average Gels克服样品和试验误差
　　* 能进行半自动或全自动蛋白质点匹配，不需用户提供标记
　　* 可对多块相应凝胶上的蛋白质点数据进行T-检验或其它统计分析;
　　* 数据可以传送给Investigator ProPic?自动工作站进行蛋白质点自动切割;
　　* 带有HT PC 数据库系统，可以方便进行蛋白研究的数据查询和数据管理;
　　五、自动化蛋白酶解工作站（Investigator? ProGest）
　　Investigator ProGest自动化蛋白酶解工作站是进行全自动蛋白酶解的最佳选择，适合于从2D或SDS-PAGE胶上切取胶块的自动化酶解。通过触摸式显示屏界面方便地进行反应程序的设定，从而实现酶解过程中的自动清洗，加酶和恒温孵育步骤循环。
　　产品特征：
　　* 进行自动化、高通量的蛋白斑点酶解
　　* 自动化操作和温控反应系统节约反应时间，提高反应效率，微处理器精确控制酶解反应条件
　　* 内置加热平台
　　* 专利的Flow-through技术，提高反应效率
　　* 能够同时进行96个样品反应,每轮反应时间为6.5小时
　　* 自动控制酶解反应循环时间，每天可进行两轮反应
　　* 氮气正压，超净环境
　　六、自动化MALDI点样工作站（Investigator? ProMS MALDI Spotting Workstation）
　　Investigator? ProMS 系统用于蛋白质质谱分析前的样品浓缩、脱盐和MALDI点样,点样的多肽可以进行后续的质谱分析，ProMS适用于大多数商业化的MALDI target。
　　产品特征：
　　* 软件操作方便，可根据用户需要进行定制，应用灵活，可远程控制，高通量。
　　* 溶液反应体系可对反应精确控制，多肽的反向洗脱增加检测灵敏度。
　　* 提供正压的干净空气
　　* 可以使用ZipTips?或类似产品
　　* 96孔规格
　　* 单泵分装
　　* 低流速（20 μl/min）增加纯化效率
　　七、自动化蛋白质酶解点样工作站（Investigator? ProPrep Workstation）
　　Investigator? ProPrep Workstation将能够自动完成凝胶蛋白质点酶解及酶解后样品的浓缩，脱盐和MALDI点样等一系列过程，通过4个样品针头同时操作使得实验结果高效和自动化。该仪器简化了蛋白质组学研究的繁琐步骤，大大加快了研究的实验进程。酶解后的样品适用于多种后续分析，包括LC（液相色谱）和CE（毛细管电泳），尤其适用于质谱分析，如MALDI TOF和MS/MS。该系统的酶解和MALDI点样两个操作过程可以分开单独进行，也可以整合成一个完整的过程进行自动化操作。
　　产品特征：
　　* 多功能：同时具有自动化蛋白质酶解和MALDI点样功能
　　* 高通量：酶解样品处理能力达1536个/天或更多；MALDI点样速度因方法和介质不同而不同
　　* 无污染：独特的反应槽设计有效地防止样品交叉污染，HEPA滤过的干净操作环境，有效防止角蛋白污染；自动化操作减少了手动接触污染
　　* 灵活性：提供4*96和8*96的样品盘满足不同通量的需求
　　* 操作方便：Window 2000系统和15寸平面液晶显示屏使得操作更舒适方便；软件?操作简单，PC内置软驱和CD-ROM及10/100M网卡,使数据交换和共享更容易。
　　* 灵敏度达125 fmol
　　八、RADARS/MS?快速数据管理和检索系统（Rapid Data Archival and Retrieval System ）
　　作为Genomic Solutions Inc.公司旗舰产品的RADARS/MS?快速数据管理和检索软件系统，是一个完整的蛋白质组学研究智能平台。它整合了客户机/服务器，数据库和外联网（extranet）应用软件，可以方便地进行蛋白质的分析鉴定和传输。它提供目前最快、最可信和最完整的蛋白鉴定解决方案。通过RADARS/MS系统可以方便分析大量的蛋白质组学研究数据，快速发现和确认药靶及疾病标志物，尤其适合于蛋白质组学研究中心、重点实验室和制药公司。
　　特点：
　　* 能自动化分析大量质谱数据
　　* 蛋白序列和质谱数据自动对应
　　* 快速分析蛋白翻译后修饰位点
　　* 蛋白组研究的实验数据和分析结果能进行快速数据库储存
　　* 对MS和MS/MS结果数据能进行快速自动化的数据库查询和蛋白鉴定
　　* 提供清晰、有效的结果可视化和注释工具
　　Genomic Solution Inc.系列仪器及软件为蛋白质组学研究提供了完整的解决方案，大大加快了研究进程，提高了实验效率。该系统非常灵活，用户可以根据自己现有的设备情况，有选择性地配备Genomic Solution Inc.系列仪器及软件，形成适合自己的一整套完整蛋白组学研究系统。
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与质谱兼容的银染及改良考染
其实银染时不要使蛋白质氧化,不使用交联剂如戊二醛就可以基本与质谱兼容.下面推荐欧洲分子生物学实验室方法(EMBL):该方法的质谱兼容性在银染中算比较高的.肽段的序列覆盖率以及灵敏度都不错,不过背景比较黑,如果固定过夜估计会好一些
EMBL Silver staining
Fixer: 50% MeOH, 5% HAc vol. 200 ml.
100 ml MeOH Merck 1.06009
10 ml HAc (100%) Merck 1.00063
90 ml H2O MilliQ
Wash: 50% MeOH vol. 200 ml.
100 ml MeOH
100 ml H2O
Sensitizing: 0.02% Na2S2O3 vol. 200 ml.
0.04 g. Na2S2O3 Fluka 72049
200 ml H2O
Silver nitrate: 0.1% AgNO3 Vol. 200 ml. (Cold)
0.2 g AgNO3 Sigma S-8157
200 ml. H2O
Developer: 0.04% Formalin, 2% Na2CO3 Vol. 250 ml.
100 &l Formalin (35% Formaldehyde) Merck 1.04001
5 g Na2CO3 Merck 1.06392
250 ml. H2O
5% HAc: 5% HAc Vol. 200 ml.
10 ml HAc (100%)
190 ml H2O
1. Fix gel: 50% MeOH, 5% HAc for 20 mins.
2. Wash gel: 50% MeOH for 10 mins.
3. Wash gel: H2O for 2 hrs.
Reduce background staining by over night washing.
4. Sensitize gel: 0.02% Na2S2O3 for 1 min.
5. Wash gel: H2O for 1 min.
6. Wash gel: H2O for 1 min.
7. Incubate gel: Cold 0.1% AgNO3 for 20 mins. at 4oC
8. Wash gel: H2O for 1 min.
9. Change gel chamber
10. Wash the gel: H2O for 1 min.
11. Develop gel: 0.04% Formalin, 2% Na2CO3
Observe the color and change solution when the developer turns yellow. Terminate when the staining is sufficient.
12. Termination: 5% Hac
Change the solution a couple of times
13. Leave the gel at 4oC in: 1% HAc
此外目前各大实验室最常用的方法(军事医学科学院常用的),2000年电泳杂志上推荐的方法,也是AMERSHAM试剂盒和标准protocol上所载的方法,可以在AMERSHAM的手册上面查到,也是与质谱兼容的.
介绍几个改良考染和质谱兼容的银染
1 Neuhoff胶体考染法
[1]固定：12%（W/V）三氯醋酸（TCA）2h
[2]染色：200ML染色液混合50ML甲醇 16-24h（染色液：在490ML含2%的H3PO4中加入50G（NH4）2SO4直至完全溶解，再加0.5gCBBG250搅拌混合，定容至500ML使用前摇匀）
[3]漂洗0.1mol/L Tris-H3PO4(PH6.5)漂洗两分钟；25%甲醇漂洗不超过1分钟
[4]稳定：在20%的（NH4）2SO4中稳定蛋白质-染料复合物。
优点：背景低，灵敏度高，可达200ng protein/spot
2热考马斯亮蓝染色及二次染色法
[1]染色 （0.025%考马斯亮蓝R350）：将1片PHast Gel Blue药片溶入1.6L 10%醋酸，将染色液加热到90摄氏度倒入凝胶染色盘，振荡10分钟
[2]脱色：10%醋酸室温振荡脱色2小时，期间需多次更换脱色液，脱色液可通过铺有活性炭的滤纸层过滤回收
优点：脱色液和染色液可重复使用，灵敏度较经典考染高
等待考染后的背景完全脱除后，可以用以下的银染法进行二次染色。因为蛋白点已经经过固定，可以直接从敏化步骤开始
兼容质朴的银染法
1固定 25ML acetic acid, 100ML methanol ,125ML 15min 2次
2敏化 75ML methanol ,0.5g Na2S2O3,17g NaAC,milli-Qwater to 250ml 30min
3漂洗250ml milli-Qwater 5min 3次
4银染 0.625gAgNO3,milli-Q water to 250ml 20min
5漂洗 milli-Q water 1min 2次
6显色 6.25g Na2CO3,100ul formaldehyde,milli-Q water to 250ml 4min
7终止 3.65g EDTA,milli-Qwater to 250ml 10min
8漂洗250 milli-Qwater 5min 3次
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多肽物质分离与分析方法研究进展
摘 要 综述了近几年来多肽类物质的提取分离与分析方法，主要包括高效液相色法、电泳、质谱及核磁共振等方法在肽类物质研究中的最新应用进展。
　　多肽类化合物广泛存在于自然界中，其中对具有一定生物活性的多肽的研究，一直是药物开发的一个主要方向。生物体内已知的活性多肽主要是从内分泌腺组织器官、分泌细胞和体液中产生或获得的，生命活动中的细胞分化、神经激素递质调节、肿瘤病变、免疫调节等均与活性多肽密切相关。随着现代科技的飞速发展，从天然产物中获得肽类物质的手段也不断得到提高。一些新方法、新思路的应用。不断有新的肽类物质被发现应用于防病治病之中。本文介绍了近几年肽类物质分离、分析的主要方法研究进展。
1 分离方法
　　采取何种分离纯化方法要由所提取的组织材料、所要提取物质的性质决定。对蛋白质、多肽提取分离常用的方法包括：盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法等。这些方法常常组合到一起对特定的物质进行分离纯化，同时上述这些方法也是蛋白、多肽类物质分析中常用的手段，如层析、叫泳等。
　　1.1 高效液相色谱（HPLC）
　　HPLC的出现为肽类物质的分离提供了有利的方法手段，因为蛋白质、多肽的HPLC应用与其它化合物相比，在适宜的色谱条件下不仅可以在短时间内完成分离目的，更重要的是HPLC能在制备规模上生产具有生物活性的多肽。因此在寻找多肽类物质分离制备的最佳条件上，不少学者做了大量的工作。如何保持多肽活性、如何选择固定相材料、洗脱液种类、如何分析测定都是目前研究的内容。
　　1．1．1 反相高效液相色谱（RP-HPLC）
　　结果与保留值之间的关系：利用RP-HPLC分离多肽首先得确定不同结构的多肽在柱上的保留情况。为了获得一系列的保留系数，Wilce等利用多线性回归方法对2106种肽的保留性质与结构进行分析，得出了不同氨基酸组成对保留系数影响的关系，其中极性氨基酸残基在2～20氨基酸组成的肽中，可减少在柱上的保留时间；在10～60氨基酸组成的肽中，非极性氨基酸较多也可减少在柱上的保留时间，而含5～25个氨基酸的小肽中，非极性氨基酸增加可延长在柱上的保留时间。同时有不少文献报道了肽链长度、氨基酸组成、温度等条件对保留情况的影响，并利用计算机处理分析得到每种多肽的分离提取的最佳条件。
　　肽图分析（Peptide Mapping）：肽图分析是根据蛋白质、多肽的分子量大小以及氨基酸组成特点，使用专一性较强的蛋白水解酶[一般未肽链内切酶（endopeptidase）]作用于特殊的肽链位点将多肽裂解成小片断，通过一定的分离检测手段形成特征性指纹图谱，肽图分析对多肽结构研究合特性鉴别具有重要意义。利用胰蛋白酶能特意性作用于Arg和Lys羧基端的肽链的性质，通过RP-HPLC法采用C18柱检测了重组人生长激素特征性胰肽图谱。同时胰岛素的肽图经V8酶专一裂解也制得，并可鉴别仅相差一个氨基酸残疾的不同种属来源的胰岛素。人类肿瘤坏死因子的单克隆抗体结构也应用酶解法及在线分析技术确定了肽图，便于鉴定分析。此项技术已经在新药开发中得到广泛应用。
　　1.1.2 疏水作用色谱（Hydrophobic interaction chromatogrphy，HIC）
　　HIC是利用多肽中含有疏水基因，可与固定相之间产生疏水作用而达到分离分析的目的，其比RP-GPLC具有较少使多肽变性的特点。利用GIC分离生产激素（GH）产品的结构与活性比EP-GPLC分离的要稳定，活性较稳定。Geng等利用HIC柱的低变性特点，将大肠杆菌表达出的经盐酸胍乙啶变性得到人重组干扰素-γ。通过HIC柱纯化、折叠出高生物活性的产品。不同人尿表皮生长因子（EGF）也利用HIC纯化到了，均具有良好的生物活性。HIC可将未经离子交换柱的样品纯化。而RP-HPLC则不能达到这一要求。
　　1.1.3 分子排阻色谱（Sizs-Exclusion chromatogrphy，SEC）
　　SEC是利用多肽分子大小、形状差异来分离纯化多肽物质，特别对一些较大的聚集态的分子更为方便，如人重组生长激素（hgH）的分离，不同结构、构型的GH在SEC柱上分离行为完全不同，从而可分离不同构型或在氨基酸序列上有微小差异的变异体，利用SEC研究修饰化的PEG的分离方法，此PEC具有半衰期长、作用强的特点。一些分子量较大的肽或蛋白均可利用此法分离分析。
　　1．1．4离子交换色谱（Iron-Exchange chromatography,IEXC）
　　IEXC可在中性条件下，利用多肽的带电性不同分离纯化具有生物活性的多肽。其可分为阳离子柱与阴离子柱两大类，还有一些新型树脂，如大孔型树脂、均孔型树脂、离子交换纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶树脂等。在多肽类物质的分离分析研究中，对多肽的性质、洗脱剂、洗脱条件的研究较多，不同的多肽分离条件有所不同，特别是洗脱剂的离子强度、盐浓度等对纯化影响较大。Wu等报道利用离子交换柱层析法，探讨分离牛碳酸酐异构体和牛血清白蛋白、鸡血清白蛋白酶的提取条件，获得了有价值的数据供今后此类物质分离研究。
　　1．1．5膜蛋白色谱（Chromatography of Membrane Protein,CMP）
　　CMP+分离强蔬水性蛋白、多肽混合物的层析系统，一般有去垢剂（如SDS）溶解膜蛋白后形成SDS-融膜蛋白，并由羟基磷灰石为固定相的柱子分离纯化。羟基磷灰石柱具有阴离子磷酸基团（P-端），又具有阳离子钙（C-端），与固定相结合主要决定于膜蛋白的大小、SDS结合量有关。利用原子散射法研究cAMP的分离机制发现，样品与SDS结合后在离子交换柱上存在SDS分子、带电荷氨基酸与固定相中带电离子间的交换，从而达到分级分离的目的。
　　1．1．6高效置换色谱（High-Performance Displacement Chromatography,HPDC）
　　HPDC是利用小分子高效置换剂来交换色谱柱上的样品，从而达到分离的目的。它具有分离组分含量较少成分的特性。利用HPDC鉴定分离了低于总量1%组分的活性人重组生长激素（rHG ）。在研究非毒性交换剂时Jayarama发现硫酸化葡萄糖（Detran Sulfate，DS）是对β乳球蛋白A和B的良好置换剂，一般DS的相对分子质量为1×104和4×104最宜。研究表明置换剂的相对分子质量越低，越易于与固定相结合，因此在分离相对分子质量小的多肽时，需要更小的置换剂才能将其置换纯化出来。
　　1.1.7 灌注层析（Perfusion Chromatography，PC）
　　PC是一种基于分子筛原理与高速流动的流动相的层析分离方法，固定相孔径大小及流动相速度直接影响分离效果。试验证明其在生产、制备过程中具有低投入、高产出的特性。目前市场上可供应的PC固定相种类较多，适合于不同分子量的多肽分离使用。
　　1.2 亲和层析（Affinity Chromatography，AC）
　　AC是利用连接在固定相基质上的配基与可以和其特异性产生作用的配体之间的特异亲和性而分离物质的层析方法。自1968年Cuatrecasas提出亲和层析概念以来，在寻找特异亲和作用物质上发现了许多组合，如抗原-抗体、酶-催化底物、凝集素-多糖、寡核苷酸与其互补链等等。对多肽类物质分离目前主要应用其单抗或生物模拟配基与其亲和，这些配基由天然的，也有根据其结构人工合成的。Patel等人利用一系列亲和柱分离纯化到了组织血浆纤维蛋白酶原激活剂蛋白多肽。
　　固定金属亲和层析（Immobilized Metal Affinity Chromatography.LMAC）是近年来发展起来的一种亲和方法。其固定相基质上鳌合了一些金属离子，如Cu2+、Ni2+、Fe3+等，此柱可通过配为键鳌合侧链含有Lys、Met、Asp、Arg、Tyr、Glu和His的多肽，特别是肽序列中含有His-X-X-X-His的结构最易结合到金属离子亲和柱上，纯化效果较好。其中胰岛素样生长因子（Insylin Like Growth Factor，IGF）、二氢叶还原酶融合蛋白等均用此方法分离到纯度较高的产品。
　　Chaiken等人报道了另一种亲和层析方法，利用反义DNA表达产生，其与正链DNA表达产生的肽或蛋白具有一定的亲和性，如Arg加压素受体复合物，已用此法分离得到。DNA与蛋白、多肽复合物之间的作用也是生物亲和中常用的方法。将人工合成的寡核苷酸结合在固定相基质上，将样品蛋白或多肽从柱中流过，与之结合可达到分离特定结构多肽的目的。
　　1.3 毛细管电泳（Capillary electrophoresis，CE）--分离分析方法
　　CE是在传统的电泳技术基础上于本世纪60年代末由Hjerten发明的，其利用小的毛细管代替传统的大电泳槽，使电泳效率提高了几十倍。此技术从80年代以来发展迅速，是生物化学分析工作者与生化学家分离、定性多肽与蛋白类物质的有利工具。CE根据应用原理不同可分为以下几种；毛细管区带电泳Capillary Zone electrophoresis，CZE）、毛细管等电聚焦电泳（Capillary Isoeletric Focusing，CIEF）毛细管凝胶电泳（CapillaryGelElectrophoresis，CGE）和胶束电动毛细管层析（Micellar Electokinetic Electrophoresis Chromatorgraphy,MECC）等。
　　1.3.1 毛细管区带电泳（Capillary Zone Electrophoresis，CZE）
　　CZE分离多肽类物质主要是依据不同组分中的化合物所带电性决定，比传统凝胶电泳更准确。目前存在于CZE分离分析多肽物质的主要问题是天然蛋白或肽易与毛细管硅胶柱上的硅醇发生反应，影响峰形与电泳时间，针对这些问题不少学者做了大量实验进行改进，如调节电池泳液的PH值，使与硅醇反应的极性基团减少；改进毛细管柱材料的组成，针对多肽性质的不同采取不同的CZE方法研究分离5个含9个氨基酸残基的小肽，确定了小肽分析的基本条件，即在低PH条件下，缓冲液中含有一定浓度的金属离子如Zn2+等，此时分离速度快而且准确。
　　1．3．2细管等电聚电泳（Capillary Isleletric Focusing,CIEF）
　　由于不同的蛋白、多肽的等电点（PI）不同，因此在具有不同pH梯度的电泳槽中，其可在等电点pH条件下聚集沉淀下来，而与其他肽类分离开来。CIEF在分离、分析混合多肽物质中应用不多，主要应用与不同来源的多肽异构体之间的分离，如对rHG不同异构体分离。由于在CIEF柱表面覆盖物的不稳定性限制了此法的广泛应用。
　　1．3. 3毛细管凝胶电泳 (Capillary Gel Electrophoresis,CGE)
　　CGE是基于分子筛原理，经十二烷基磺酸钠（SDS）处理的蛋白或多肽在电泳过程中主要靠分子形状、分子量不同而分离。目前，又有一种非交联欢、线性、疏水多聚凝胶柱被用于多肽物质的分离分析，此电泳法适于含疏水侧链较多的肽分离，这种凝胶易于灌注，使用寿命长，性质较为稳定。
　　1．3．4胶束电动毛细管层析（Micellar Electrokinetic Electorphoresis Chromatography, MECC）
　　MECC的原理是在电泳液中加入表面活性剂，如SDS，使一些中性分子带相同电荷分子得以分离。特别对一些小分子肽，阴离子、阳离子表面活性剂的应用都可使之形成带有一定电荷的胶束，从而得到很好的分离效果。有文献报道在电解液中加入环糊精等物质，可使用权含疏水结构组分的多肽选择性与环糊精的环孔作用，从而利用疏水作用使多肽得到分离。
　　1．4多肽蛋白质分离工程的系统应用
　　以上提到的分离多肽的技术在实际应用过程中多相互结合，根据分离多肽性质的不同，采用不同的分离手段。特别是后基因组时代，对于蛋白质组深入的研究，人们对于分离多肽及蛋白质的手段不断改进，综合利用了蛋白质和多肽的各种性质，采用包括前面提到的常规蛋白多肽提取方法，同时利用了高效液相色谱，毛细管电泳，2-D电泳等手段分离得到细胞或组织中尽可能多的蛋白多肽。在蛋白质组学研究中系统应用蛋白和多肽分离鉴定的技术在此研究中即是分离手段也是分析方法之一。特别是以下提到的质谱技术的发展，大大的提高了蛋白多肽类物质的分析鉴定的效率。
2 分析方法
　　2．1 质谱分析（Mass Spectrometry, MS）
　　MS在蛋白、多肽分析中已经得到了广泛应用，特别是在分离纯化后的在线分析中，MS的高敏性、快速性特别适合多肽物质分析鉴定。其中连续流快原子轰击质谱（Continuous-Flow Fast Atom Bombardment, cf-FAB）和电雾离子化质谱（Electrospray Ionization, EIS）是近几年发展起来的新方法。
　　2．1．1连续流快原子轰击质谱（Continuous-Flow Fast Atom Bombardment, cf-FAB）
　　cf-FAB是一种弱离子化技术，可将肽类或小分子量蛋白离子化成MH+或（M-H）形式。主要应用于肽类的分离检测，其具有中等分辨率，精确度大于+0.2amu，流速一般在0.5-1.5μl·Ml-1。在测定使流动相需加0.5%-10%基质如甘油和高有机溶剂成分，使样品在检测探针处达到敏感化。cf-FAB常与HPLC、CEZ等方法结合使用达分离分析的目的，许多多肽的cf-FAB分析方法已经建立，并得到很好的应用。如Hideaki等利用此法研究L-Pro、L-Ala的四肽化合物系列。证明L-Pro在保持小肽构相稳定性。连接分子方面具有重要意义。
　　2.1.2 电雾离子化质谱（Electrospray Ionozation，EIS）
　　EIS可产生多价离子化的蛋白或多肽，允许相对分子质量达1×105蛋白进行分析，分辨率在amu。精确度在0.01%左右。EIS更适合相对分子质量大的蛋白质的在线分析，且需要气化或有机溶剂使样品敏感化。利用EIS与HPLC联合分离分析GH和血红蛋白均获成功，其也可与CEZ联合应用。
　　2.1.3 基质辅助激光解析/离子化-飞行时间质谱（Matrix-associated laser disso-ciation/ionization time of flight mass spectrmtry，MALDI-TOF MS）
　　MALDI-TOF是目前蛋白质鉴定中精确测定测定分子质量的手段，特别适合对混合蛋白多肽类物质的相对分子质量的测定，灵敏度和分辨率均较高。它是目前蛋白质组学研究的必备工具。同时结合液相色谱的联用技术可以高效率的鉴定多肽物质。特别是当各种原理的质谱技术串联应用时，不但可以得到多肽的相对分子质量信息，还可以测定它的序列结构，此项技术将在未来蛋白质组学研究中起到决定性作用。
　　2.2 核磁共振(Nuclear Magnetic resonance，NMR)
　　NMR因图谱信号的纯数字化、过度的重叠范围过宽（由于相对分子质量太大）核信号弱等原因，在蛋白、多肽物质的分析中应用一直不多。随着二维、三维以及四维NMR的应用，分子生物学、计算机处理技术的发展，使NMR逐渐成为此类物质分析的主要方法之一。NMR可用于确定氨基酸序列、定量混合物中的各组分组成含量等分析中。但要应用于蛋白质分析中仍有许多问题需要解决，例如，如何使分子量大的蛋白质有特定的形状而便于定量与定性分析，如何减少数据处理的时间问题等。这些问题多有不少学者在进行研究。虽然在蛋白质分析中应用较少，NMR在分析分子中含少于30个氨基酸的小肽时是非常有用的，可以克服上述蛋白质分析中的缺点而达到快速准确分析的目的。
　　除上述方法之外，氨基酸组成分析、氨基酸序列分析、场解析质谱、IR、UV光谱、CD、圆而色谱、生物鉴定法、放射性同位素标记法及免疫学方法等都已应用于多肽类物质的结果鉴定、分析检测之中。
　　以上简要的介绍了近几年多肽物质分离、分析的常用方法及最新研究方向。随着科学技术水平的不断发展，会有许多更新的分离分析手段不断涌现，因此这一领域的研究具有广阔的前景。
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蛋白质药品冷冻干燥技术研究进展
由于冻干药品呈多孔状、能长时间稳定贮存、并易重新复水而恢复活性，因此冷冻干燥技术广泛应用于制备固体蛋白质药物、口服速溶药物及药物包埋剂脂质体等药品。从国家药品监督管理局数据库得知，目前国内已有注射用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、注射用重组人干扰素α2b、冻干鼠表皮生长因子、外用冻干重组人表皮生长因子、注射用重组链激酶、注射用重组人白介素-2、注射用重组人生长激素、注射用A群链球菌、注射用重组人干扰素α2b、冻干人凝血因子VⅢ、冻干人纤维蛋白原、间苯三酚口服冻干片等冻干药品获准上市。截止2000年2月，美国FDA已批准的生物技术药共计76个。
　　冷冻干燥技术最早于1813年由英国人Wollaston发明。1909年Shsckell试验用该方法对抗毒素、菌种、狂犬病毒及其它生物制品进行冻干保存，取得了较好效果。在第二次世界大战中，对血液制品的大量需求大大刺激了冷冻干燥技术的发展，从此该技术进入了工业应用阶段。此后，制冷和真空设备的飞速发展为快速发展冷冻干燥技术提供了强有力的物质条件。进入上个世纪的***十年代，科学技术的迅猛发展和人民群众对健康保障的需求为药品冷冻干燥技术的飞速发展提供了强大的动力，在药品冻干损伤和保护机理、药品冻干工艺、药品冷冻干燥机等方面取得了巨大的成绩。但药品冷冻干燥技术是一门边缘学科，需要生物学、药学、制冷、真空和控制等知识的交叉和综合，因此仍存在亟待解决的问题。
2 药品冷冻干燥原理及特点
　　药品冷冻干燥是指把药品溶液在低温下冻结，然后在真空条件下升华干燥，除去冰晶，待升华结束后再进行解吸干燥，除去部分结合水的干燥方法。该过程主要可分为：药品准备、预冻、一次干燥（升华干燥）和二次干燥（解吸干燥）、密封保存等五个步骤。药品按上述方法冻干后，可在室温下避光长期贮存，需要使用时，加蒸馏水或生理盐水制成悬浮液，即可恢复到冻干前的状态。与其它干燥方法相比，药品冷冻干燥法具有非常突出的优点和特点：
　　a) 药液在冻结前分装，剂量准确；
　　b) 在低温下干燥，能使被干燥药品中的热敏物质保留下来；
　　c) 在低压下干燥，被干燥药品不易氧化变质，同时能因缺氧而灭菌或抑制某些细菌的活力；
　　d) 冻结时被干燥药品可形成&骨架&，干燥后能保持原形，形成多孔结构而且颜色基本不变；
　　e) 复水性好，冻干药品可迅速吸水还原成冻干前的状态；
　　f) 脱水彻底，适合长途运输和长期保存。
　　虽然药品冷冻干燥具有上述优点，但是干燥速率低、干燥时间长、干燥过程能耗高和干燥设备投资大等仍是该技术的突出缺点。
3 药品冻干损伤和保护机理
　　药品冷冻干燥是一个多步骤过程，会产生多种应力使药品变性，如低温应力、冻结应力和干燥应力。其中冻结应力又可分为枝状冰晶的形成，离子浓度的增加，PH值的改变和相分离等情况。
　　因此，为了保护药品的活性，通常在药品配方中添加活性物质的保护剂。它需要具备四个特性：玻璃化转变温度高、吸水性差、结晶率低和不含还原基。
　　常用的保护剂有如下几类物质：
　　a) 糖类/多元醇：蔗糖、海藻糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、麦芽糖等；
　　b) 聚合物：HES、PVP、PEG、葡聚糖、白蛋白等；
　　c) 无水溶剂：乙烯乙二醇、甘油、DMSO、DMF等；
　　d) 表面活性剂：Tween 80等；
　　e) 氨基酸：L-丝氨酸、谷氨酸钠、丙氨酸、甘氨酸、肌氨酸等；
　　f) 盐和胺：磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐等；
　　由于冷冻干燥过程存在多种应力损伤，因此保护剂保护药品活性的机理也是不同的，可以分为低温保护和冻干保护。
　　对于低温保护，目前被广为接受的液体状态下蛋白质稳定的机理之一是优先作用原理。优先作用是指蛋白质优先与水或水溶液中的保护剂作用。在有起稳定作用的保护剂存在的条件下，蛋白质优先与水作用（优先水合），而保护剂优先被排斥在蛋白质区域外（优先排斥）。在这种情况下，蛋白质表面就比其内部有较多的水分子和较少的保护剂分子。优先作用原理同样适用于冷冻-融解过程。蛋白质保护剂，在溶液中被从蛋白质表面排斥，在冻结过程中能够稳定蛋白质。但是优先作用机理不能完全解释用聚合物或蛋白质自身在高浓度时保护蛋白质的现象。
　　在冻干过程中，由于蛋白质的水合层被除去，优先作用机理不再适用。对于冻干保护机理，仍在研究探讨之中，目前主要有两种：
　　a) 水替代假说。许多研究者认为由于蛋白质分子中存在大量氢键，结合水通过氢键与蛋白质分子联结。当蛋白质在冷冻干燥过程中失去水分后，保护剂的羟基能替代蛋白质表面的水的羟基，使蛋白质表面形成一层假定的水化膜，这样可保护氢键的联结位置不直接暴露在周围环境中，稳定蛋白质的高级结构，防止蛋白质因冻干而变性，使其即使在低温冷冻和干燥失水的情况下，仍保持蛋白质结构与功能的完整性。
　　b) 玻璃态假说。研究者认为在含保护剂溶液的干燥过程中，当浓度足够大且保护剂的结晶不会发生时，保护剂-水混合物就会玻璃化。研究发现在玻璃态下，物质兼有固体和流体的行为，粘度极高，不容易形成结晶，且分子扩散系数很低，因而具有粘性的保护剂包围在蛋白质分子的周围，形成一种在结构上与玻璃状的冰相似的碳水化合物玻璃体，使大分子物质的链锻运动受阻，阻止蛋白质的伸展和沉淀，维持蛋白质分子三维结构的稳定，从而起到保护作用。
　　目前大部分学者赞同&水替代假说&，因为可以通过实验检测到蛋白质和保护剂之间的氢键，为理论提供证据。事实上，无论是&水替代假说&还是&玻璃态假说&，它们的基础都是基于药液实现了部分或全部玻璃化冻结。
4 冻干工艺及优化
　　由于药品冷冻干燥过程会产生多种应力，对冻干药品的药性有很大的影响，因此对药品冷冻干燥过程进行合理设计，对于减少冻干损伤和提高冻干药品的质量有重大的意义。
4.1冻结研究
　　冷冻干燥过程中的冻结过程非常重要，因为在冻结中形成的冰晶形态和大小以及玻璃化程度不仅影响后继的干燥速率，而且影响冻干药品的质量。因此在冻结过程中必须考虑配方、冻结速率、冻结方式、以及是否退火等问题。
4.1.1 配方的影响
　　配方中的固体含量会影响冻结和干燥过程。如果固体含量少于2%，那么冻干药品结构的机械性能就会不稳定。尤其在干燥过程中，药品微粒不能粘在基质上，逸出的水蒸气会把这些微粒带到小瓶的塞子上，有时甚至会带到真空室当中。
　　此外，为了获得均匀一致、表面光滑、稳定的蛋白质药品，配方中必须含有填充剂、赋形剂、稳定剂等保护剂，这些保护剂对实现药品的玻璃化冻结有重大的影响。很多糖类或多元醇经常被用于溶液冻融和冻干过程中非特定蛋白质的稳定剂，它们既是有效的低温保护剂又是很好的冻干保护剂，它们对冻结的影响取决于种类和浓度。文献[16～23]对不同的保护剂进行了详尽的研究，探讨了它们的冻结特性。文献[4]还研究了其它保护剂的冻结特性。但是蛋白质种类很多，而且物理化学性质各异，因此不同的蛋白质需要不同的保护剂配方，因此它们的冻结特性就不同，一般需要实验。
4.1.2 冻结方式
　　冻结方式不同，产生的冰晶的形态和大小就不同，而且会影响后继的干燥速率和冻干药品质量。根据冻结机理，可以把冻结分为全域过冷结晶和定向结晶两类。
　　全域过冷结晶是指全部药液处于相同或相近的过冷度下进行冻结的方式。在全域过冷结晶中，冻结速率和冰晶成核温度是重要的参数。
　　全域过冷结晶按冻结速率的快慢可分为慢速冻结和快速冻结。快速冻结的冰晶细小，而且没有冻结浓缩现象，但是存在不完全冻结现象。相反，慢速冷却产生较大的冰晶，并且存在冻结浓缩的现象。Thomas W Patapoff等人发现如果把药品直接浸入液氮或干冰-乙醇溶液槽中（快速冻结），那么晶核首先在瓶壁产生，然后冰晶向中心扩散，再垂直向上扩散。由于长成的冰晶细小，而且有水平方向的结构，导致干燥阶段的传质阻力很大，升华速率降低。实验证明，快速冻结导致升华速率低，解吸速率快，慢速冻结导致升华速率快，解吸速率慢。
　　James A Searles等人认为冰晶成核温度是全域过冷结晶的重要因素，因为它是升华速率的主要决定因素。他们在研究中发现，冰晶成核温度从本质上来说是随机的、不稳定的，不容易控制，但是受溶液中的微粒含量和是否存在冰晶成核体等影响因素。正是冰晶成核温度的随机性导致升华干燥速率的不均匀性以及与形态相关的参数，如冻干药品表面积和解吸干燥速率。
　　定向结晶是指一小部分药液处于过冷状态下进行冻结的方式。Thomas W Patapoff介绍了一种垂直冻结方式。溶液用湿冰冷却，在瓶子底部用干冰冷却，形成晶核，然后放到-50℃的搁板上冻结。用这种方式冻结的样品的冰晶在垂直方向呈现烟囱状，在药品表面没有冻结浓缩层，而且整个药品的结构均一性很好，因此在干燥时的传质阻力很小，加快了冻干速率。Martin Kramer等人采用了另外一种方式实现了定向冻结。他们在真空室压力为0.1kPa，搁板温度为+10℃的条件下，让溶液开始表面冻结，形成1～3mm左右的冰晶薄层。然后解除真空，降低搁板温度到结晶温度以下进行冻结。在这种条件下长成的冰晶粗大，也呈烟囱状。同时在干燥阶段发现，升华干燥时间比采用一般冻结的时间节省了20%。分析冻干药品时还发现，对甘露醇，采用这种方式冻结的冻干品的剩余含水量比采用一般冻结的要多；但对蔗糖和甘氨酸，两者差别不大。H Schoof等人在冻干胶原质时也采用了定向结晶的方式。
　　冻结方式不同，产生的冰晶形态和大小就不同，后继的干燥速率也不同。实验证明，采用定向结晶方式的冻结药品的干燥速率比全域过冷结晶的快。但是无论采用哪种冻结方式，药品溶液必须部分或全部实现玻璃化冻结，以保护药品药性。
4.1.3 退火
　　退火是指把冻结药品温度升到共熔温度以下，保温一段时间，然后再降低温度到冻结温度的过程。在升华干燥之前增加退火步骤，至少有三个原因：
　　a) 强化结晶。在冻结过程特别是快速冻结过程中，配方中结晶成分往往来不及完全结晶。但是如果该成分能为冻干药品结构提供必要的支撑或者蛋白质在该成分完全结晶后会更稳定，那么就有必要完全结晶。此外，冻结浓缩液中也会有一部分水来不及析出，使其达不到最大浓缩状态。实验证明，当退火的温度高于配方的最大浓缩液玻璃化转变温度Tg'时，会促进再结晶的形成使结晶成分和未冻结水结晶完全。
　　b) 提高非晶相的最大浓缩液玻璃化转变温度Tg'。从非晶相中除去Tg'较低的结晶成分，能够提高非晶相的Tg'。Barry J Aldous在研究非晶态碳水化合物的水合物结晶规律时发现，经过退火之后的海藻糖干燥溶液的玻璃化转变温度由31℃上升到79℃，大大提高了稳定作用。
　　c) 改变冰晶形态和大小分布，提高干燥效率。James A Searles等人研究认为不同的成核温度产生不同的冰晶形态和粒径大小，继而导致升华干燥的速率的不均匀。但是一个过程中的干燥速率是由最慢的干燥药品确定的，因此不均匀的干燥速率会影响药品的质量和生产的经济性。研究证实退火过程中的相行为和重结晶可以减小由于成核温度差异造成的冰晶尺寸差异及干燥速率的不均匀性，提高干燥效率和药品均匀性。
　　为了达到退火目的，在退火操作中，必须考虑加热速率、退火温度、退火时间等参数。但是目前由于实验手段不够先进和理论知识比较缺乏，退火机理尚有疑问，退火参数的选取仍然没有依据。
　　药品冷冻干燥的干燥过程可以分为两个阶段，一次干燥和二次干燥。在一次干燥阶段除去自由水，在二次干燥阶段除去部分结合水。干燥过程占据了药品冷冻干燥过程的大部分能耗，因此采取有效措施提高干燥速率显得非常有意义。目前，大都采取控制搁板和药品温度、冷阱温度和真空度的做法来实现干燥速率的提高。
　　药品温度的控制。包括冻结层和已干层的温度控制。控制冻结层温度的原则是在保证冻结层不发生熔化（在低共熔点以下）的前提下，温度越高越好。控制已干层温度的原则是在不使物料变性或已干层结构崩塌的前提下、尽量采用较高的干燥温度。而搁板温度的控制是以满足药品温度控制为标准。
　　冷阱温度。冻干过程中水升华的驱动力是药品和冷阱间的温差。由于药品温度受加热方式的限制，同时不能高于共熔温度，因此冷阱温度越低越好。为了提高经济性，在升华干燥过程中应至少低于药品温度20℃；在解吸干燥过程中，对于那些要求很低残余水分的配方，冷阱温度要求更低。
　　真空度。一般认为，压力对冻干过程有正反两方面的影响：
　　a) 在药品共熔点温度和崩塌温度以下，升华界面温度越高，升华水汽越多，所需热量越大。压力越高，相应提高了已干层导热系数，表面对流作用也越大，因此升华水汽也越快，即冻干速率越大。
　　b) 升华界面通过已干层到外部的水汽逸出速度与界面和表面之间的压力差，即界面温度所对应的饱和压力与干燥室的真空度之差相关。这个压差大，有助于水汽逸出。这个压差越小，逸出越慢，干燥速率也越小。如果冷冻干燥是传热控制过程，则干燥速率随着干燥室压力升高而提高；如果冷冻干燥是传质控制过程，干燥速率随着干燥室压力升高而降低。
　　经验证明升华阶段的真空度在10～30Pa时，既有利于热量的传递，又利于升华的进行。若压强过低，则对传热不利，药品不易获得热量，升华速率反而降低，而且对设备的要求也更高，增加了成本。而当压强过高时，药品内冰的升华速度减慢，药品吸收热量将减少，于是药品自身的温度上升，当高于共熔点温度时，药品将发生熔化导致冻干失败。根据真空度对冻干速率的影响，文献[40]采用了循环压力法，得到了不错的效果。
　　药品冷冻干燥过程是一个连续的操作，不同的药品配方，有不同的冻结特性，而且冻干曲线也不同，因此应在基础研究的基础上广泛开展个体研究，优化冻干曲线，提高干燥速率，降低能耗。
5 药品冷冻干燥机
　　药品冷冻干燥机的分类方法很多，按其搁板面积可分为大、中、小三种类型，通常冻干面积小于1.5m2为小型，介于1.5m2至50m2之间为中型，大于50m2为大型；按其目的和用途可分为实验型冻干机、中试型冻干机和工业生产型冻干机。
　　药品冷冻干燥机主要由干燥箱、真空系统、制冷系统、冷阱系统、加热系统、加盖系统、自动控制系统等几大部分组成。此外，大中型冷冻干燥机还常有蒸气灭菌系统（SIP）、在位清洗系统（CIP）。
　　制冷系统分别为冷冻干燥箱和冷阱系统提供冷源。目前采用的单级制冷压缩循环的板层制冷温度约在-35℃～-40℃之间，冷阱温度在-50℃左右；双级制冷压缩循环的板层制冷温度在-45℃～-50℃之间，冷阱温度在-65℃左右；复叠式制冷循环的板层制冷温度在-55℃～-60℃之间，冷阱温度在-75℃左右。
　　冷冻干燥机的控制主要是对制冷机、真空机组、加热功率的起停及温度的控制，对真空度、温度的测定、监控、以及自动保护、报警装置等。采用全自动控制或微电脑控制的冻干机都能显示各主要部件的工作状态，显示干燥箱内搁板和药品的温度、真空度、捕水器温度，都能进行参数设定、修改和实时显示。
　　药品冷冻干燥机必须执行GMP规范标准，实现高度无菌化、无尘化，达到高度可靠、安全、维护简便。为此药品冷冻干燥机往往采用蒸气灭菌系统（SIP）以保证灭菌彻底、无死角。同时辅以在位清洗系统（CIP），对干燥室、冷凝器、主阀及管道进行就地清洗预设排液坡度，保证无液体滞留。同时具有应对停电、停水、误操作的保护措施，一旦出现故障，可以对药品实行保护；实现冻干机操作运行的计算机控制，具有停电停水三对策系统，可以多路联锁自动报警。
　　由于药品冷冻干燥机必须执行GMP规范标准，因此今后药品冷冻干燥机的研究仍将朝着无菌化和高度可靠性的方向进行，如自动进料方式、真空控制方式等的研究。
　　随着生物技术的高速发展，多肽蛋白质类药物不断涌现，可应用于临床的多肽、蛋白酶、激素、疫苗、细胞生长因子及单克隆抗体等成为开发重点。为防止药品变性，目前广泛采用冷冻干燥法制备称固态药品。经过几十年的发展，药品冷冻干燥技术虽然有了很大的进展，但是仍存在不少问题，亟需解决。在冷冻干燥过程中会产生多种冻结和干燥应力，使药品发生不同程度的变性，而且冻干法本身也存在干燥速率低、干燥时间长、干燥过程能耗高和干燥设备投资大等缺点。因此为了提高药品的稳定性和经济性，必须对药品在冻干过程中的损伤和保护机理进行进一步的研究，同时利用先进的制冷和真空设备及控制手段开发价格低、性能好的冷冻干燥机，继续完善低温低压下的传热传质理论，优化冻干工艺。
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肽电泳资料
应用SDS-PAGE显示小分子多肽
SDS-PAGE在分离、鉴定和纯化蛋白质方面有着广泛应用，其有效分离范围取决于聚丙烯酰胺的浓度和交联度，其孔径随着双丙烯酰胺与丙烯酰胺比率的增加而减小，比率接近于1：20时，孔径达到最小值。分子量低于10kD的小分子肽类，即使用较高浓度的聚丙烯酰胺凝胶的SDS-PAGE也不能完全分离，或是显不出色，或是显带较弱，带型弥散。且分子量越小，效果也越差。
为了能在SDS-PAGE上显示测定小分子量的多肽，通常采取两种方法：一是增加凝胶的浓度和交联度，在制胶时加入一些可以降低聚丙烯酰胺凝胶网限孔径的溶质分子，使用尿素、甘油或蔗糖等物质；二是选择缓冲液中的拖尾离子的种类和浓度以达到改善多肽的分离效果。
1．电泳缓冲液的配制如下表所示
缓冲液&&Tris
(mol/L)&&Tricine
(mol/L)&&pH&&SDS
阳极缓冲液
阴极缓冲液
胶缓冲液&&0.2
* 用HCl调pH
** pH约为8.25
2．丙烯酰胺贮存液的配制
单丙-双丙混合物&&单丙的百分数&&双丙的百分数
49.5% T, 3%C
49.5% T, 6%C&&48
T：丙烯酰胺的总浓度
3．胶的制备，与一般SDS-PAGE相似，按下表配制分离胶和浓缩胶
组 份&&分离胶
16% T，6%C&&浓缩胶
49.5% T, 3%C丙烯酰胺溶液（ml）
49.5% T, 6%C 丙烯酰胺溶液（ml）
胶缓冲液（ml）
脲（g）[甘油（ml）]
10%过硫酸铵（μl）
TEMED（μl）
总体积（ml）&&—
10.04&&0.48
4．样品缓冲液
50mmol/L Tris
2%巯基乙醇
0.01% Serva blue
多肽样品与样品缓冲液混合沸煮2min（或40℃温浴30min）。
5．将灌胶的玻璃板固定在电泳装置上，用1%琼脂糖封边，倒入阴极缓冲液，依次加样。
6．将电泳装置放入电泳槽内，倒入阳极缓冲液，将正负极与电泳仪相接，恒电压50~60V，待指示剂进入分离胶后，电压可升至70~90V，恒压约3h待指示剂走出凝胶下缘停止电泳。
7．染色、脱色及胶的保存同SDS-PAGE。
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蛋白质分离纯化的新技术及技术要点
浅述蛋白质分离纯化的新技术
摘 要： 本文主要介绍了浊点萃取法、置换色谱法、亲和层析法、亲和色谱法、凝胶电泳、双水相萃取等蛋白质的最新分离纯化技术，综和近年来国内外的一些研究结果，结合实际应用的例子，分析了各种分离纯化方法的优点，同时指出其不足之处。文章最后展望了蛋白质分离纯化技术的发展趋势。
关 键 词： 分离纯化 蛋白质 进展
生物技术的发展非常迅速，基因工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术，已经能设计、制造、生产人们急需的多种蛋白质。和其它生物产品的生产过程一样蛋白质的生产过程一般也分为上、中、下游过程。上、中游过程是运用生物技术生产目标产物，下游过程是指对含有目标产物的物料进行处理、分离、纯化、加工目标产物。本文主要综和近年来国内外的研究结果，介绍了蛋白质的最新分离纯化技术。
2.蛋白质的分离纯化方法：
2.1 浊点萃取法(CPE)：
2.1.1 概念及原理：
浊点萃取法(cloud point extraction，CPE)〔1〕是近年来出现的一种新兴的液―液萃取技术，它不使用挥发性有机溶剂，不影响环境。它以中性表面活性剂胶束水溶液的溶解性和浊点现象为基础，改变实验参数引发相分离，将疏水性物质与亲水性物质分离。目前该法已成功地应用于金属螯合物、生物大分子的分离与纯化及环境样品的前处理中[2-5]。
CPE 法除了利用增溶作用外，还利用了表面活性剂另一个重要性质――浊点现象。溶液静置一段时间(或离心)后会形成两个透明的液相：一为表面活性剂相(约占总体积的5%)；另一为水相(胶束浓度等于CMC)。外界条件(如温度)向相反方向变化，两相便消失，再次成为均一溶液。溶解在溶液中的疏水性物质如膜蛋白，与表面活性剂的疏水基团结合，被萃取进表面活性剂相，亲水性物质留在水相，这种利用浊点现象使样品中疏水性物质与亲水性物质分离的萃取方法就是浊点萃取。图1显示了由温度变化引发的这种相分离现象。温度的改变，引起水化层的破坏，增强了表面活性剂的疏水性。
2.1.2 蛋白质分离纯化中的应用：
CPE 法可用于分离膜蛋白、酶、动物、植物和细菌的受体，还可以替代一些分离方法如硫酸铵分级法作为纯化蛋白的第一步，与色谱方法联用。另外，CPE 法分离纯化蛋白质已经可以实现大规模操作。Minuth等人成功地进行了胆固醇氧化酶浊点萃取的中试研究。虽然使用离心分离器可以使CPE大规模连续进行，但商品离心分离器用于CPE 的效率和容量仍需进一步研究。而且，他们发现相分离操作受细胞培养 时产生的表面活性物质影响较大，体系两相间密度差较小，表面张力较小，含产物的表面活性剂相的流变学行为较复杂，操作较难。表1列出了CPE法近几年来在蛋白质分离纯化中的应用。
(1)CPE法用于分离纯化膜蛋白
膜蛋白(内嵌膜蛋白、外围膜蛋白)硫水性强、难溶于水，抽提内嵌膜蛋白时，既要削弱它与膜脂的硫水性结合，又耍使它保持硫水基在外的天然状态，较难分离纯化。由于表面活性刑具有两亲性，它一直作为腹蛋白理想的增溶剂。增溶时，膜蛋白琉水部分嵌入胶束的硫水核中而与膜脱离，又保持了膜蛋白表面的废水结构。相分离后，膜蛋白与表面活性剂共同析出，与亲水性蛋白质分离。所以，CPE 法在分离纯化膜蛋白方面极有优势。
(2)与其它分析技术的联用
CPE 可以作为高效液相色谱 (HPLC)、流动注射分析(FIA)、毛细管电泳(CE)等仪器分析的样品前处理方法，提高检出灵敏度。表面活性别可以防止样品吸附在玻璃容器上，易于与FIA中的载液及HPLC中的有机流动相或胶束流动相混合，可以直接进样。但是在很多应用中需要除去表面活性剂后再与仪器联用。将萃取物与表面活性剂分离的方法很多。对于CMC＞1mM 的表面活性剂如两性离子表面活性剂可用透析法，但操作时间较长(24h左右)。对于CMC 较小的表面活性剂可通过色谱柱分离除去，如凝胶柱、毛纫管柱等，分离出的表面活性剂可以再利用，也可以作焚烧处理。但CPE作为HPLC 的样品前处理方法有两个缺点：第一，常用的表面活性剂在UV区域有很强的背景吸收。第二，操作时间较长，从色谱柱上需用几个小时洗脱表面活性剂。表面活性剂的洗脱可能会干扰分析物的测定[3]。
2.2 置换色谱法：
2.2.1 概念及分离机理：
置换色谱(displacement chromatography)〔6〕作为一种非线性色谱技术，是指样品输入色谱柱后，用一种与固定相作用力极强的置换剂(displacer)通人色谱柱，去替代结合在固定相表面的溶质分子。样品在置换剂的推动下沿色谱柱前进，使样品中各组分按作用力强弱的次序，形成一系列前后相邻的谱带，并在置换剂的推动下流出色谱柱[7]。置换色谱的分离行为与样品组分和置换剂在实验条件下的吸附等湿线有直接的联系。置换色谱要求样品组分及置换剂的吸附等湿线应为Langmuir 型，而且置换剂相对于被分离的各组分应有最强的吸附能力，其吸附等温线位于所有组分的吸附等温线的上方[7]，见图1(A)。根据物料平衡方程，置换剂在柱中的移动速度uD有下列关系：
式中uD 为流动相的线速，ф为相比，qD 和cD 分别为置换剂在固定相和流动相中的浓度，qD/cD 是直线OD的斜率，称之为操作线(operating line)。当操作线的斜率小于被分离组分等温线的起始斜率，样品才能进行置换展开，最终形成如图l(中的置换序列，这是在理想的情况下(假定无轴向扩散及二次化学平衡)获得的置换色谱图。每一组分形成矩形的平台(Plateau)洗脱峰，相邻各组分的平台洗脱峰组成了一个台阶状的色谱图。此时，样品中不同的组分以置换剂的速度前进，即达到等速状态(isobathic conditions)：
uD＝u2； u3＝u4
式中u2、u3、u4 指被置换的三组分的速度
2.2.2 影响置换色谱分离的因素：
（1）置换剂
置换剂的选择是置换色谱能否成功地分离和纯化目标产物的关键因素之一〔7,8〕。对于蛋白质生物大分子的置换色谱来说，多离子型的置换剂与离子交换续料相结合是目前常用的分离方式。传统观点认为分子量相对大的聚电解质是较合适的置换剂，因为它们对固定相的结合比分离物更强，如羧甲基葡聚糖(CMD)、
硫酸葡聚糖、羧甲基淀粉(CMS)〔9〕、硫酸鱼精蛋、肝素、多硫酸戊聚糖(PPS)等。近期的研究表明，低分子量的化合物作为置换剂则更有优势，因为即使置换剂与蛋白质产物的峰有叠加，在后处理过程中，低分子量置换剂则较容易从目标产物中分离；同时，合成低分子量置换剂成本较低，色谱柱再生过程也比分子量大的置换剂快。
（2）固定相
理想的固定相应具备以下条件：样品及置换剂在固定相上应有较强的吸附作用，且吸附是可逆的；样品及置换剂在固定相上的吸附等温线应为Langmuir 型；样品各组分在固定相上的吸附能力应有较大差别，以保证置换色谱带的交叠部分尽可能小而获得良好的产率；有较好的化学稳定性，可适用于不同pH 值的缓冲液和有机溶剂；有较大的比表面及吸附容量；有较好的机械强度，而且容易再生。置换色谱中的环境不同，置换效果也不一样，即使是选用同样的硅胶，由于来源和制备方法上的差异也会影响置换效率。反相
色谱中使用的烷基硅胶柱常被应用于置换色谱。同其它硅胶固定相相比，烷基硅胶柱由于柱容量低及非选择性吸附等缺点，很少被用于洗脱色谱，但它却可以用于置换色诺，并成功地分离了对映异构体。
1、问题：电渗纯化蛋白质，结果几乎没得到蛋白，请问哪位有高见 今夜纯化蛋白，本以为唾手可得，结果却大失所望....我用SDS-PAGE分离，KCL显带，割胶，而后电渗分离，测OD 值极低，请问哪位有这方面的经验或其它方法，望赐教。解决：多挖点胶，收集起来，放在1.5 离心管里，用PBS捣烂，4度 过夜。然后离心，收集上清即可。最后，把上清冻成干粉。
2、问题：蛋白质提纯的方法：
SDS-PAGE and N-terminal amino acid sequence analysis.（dahuaidang）SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)was performed in 12% acrylamide and 0.1% SDS with adiscontinuous Tris-glycine buffer system.Purified enzyme was subjected to SDS-PAGE and electroblotted toImmobilo-PSQ 0.45%26m polyvinylidene fluoride membrane (Millipore).After the membrane was stained with
Ponceau S (Sigma),the enzyme protein was cut out and washed with methanol.The membrane strip holding the protein was subjected to automatic Edman degradation for sequencing of the N-terminal aminol acids using an
Applied Biosystems 477A protein sequencer (Parkin Elmer).
3、问题：蛋白质纯化，装柱，过柱应注意事项有哪些？（dahuaidang）
现在要进行蛋白质纯化，有关装柱和过柱的注意事项有哪些呀？还有，需要测序的蛋白质样品，大概需要多少，样品要求有哪些。柱子sephadex-200,和DEAE-纤维互素。
第一，手工装柱一般只适宜于大量蛋白质的提取。分子筛柱一般在盐析以后用效率才高，因为它的分媛实汀Ｒ话阄叶荚蕹捎茫龋校蹋弥?颍疲校蹋弥?Gelfitration column).如果手工装柱，长度应是内径的６０－８０倍，一般柱长应在1.2-2米，对于软胶，走一次柱须１２小时以上，对硬胶，也需５－６小时。
第二，仪器检测器灵敏度调整：最重要的是确定仪器工作正常，信号相应正常。可用在检测器出口通气泡和检测器入口注射有色样品的方法确认仪器正常和估计灵敏度。
第三，均匀,无气泡，平衡充分，分子筛要注意长度与直径比。测序的蛋白量' 我用的方法的量是SDS-PAGE
第四，如果是测序的话,跑SDS-PAGE,把染出的蛋白质带,挖下来.,直接拿去做质谱,只要你有钱国家生物医学分析中心。还有就是要保证挖的是一个蛋白质带,不能含杂蛋白质的,不然,把杂蛋白质测了怎么办。
第五，测序跟质谱不是一回事儿的。做质谱可以做分子量和质谱图，但是未必是序列。序列是要单测的。北大有位老师可以做：180块钱一个氨基酸。做质谱多得是：测分子量大约是450块钱了，测图谱的要一千多块。
4、问题：跑SDS-PAGE 有好多带，而过柱时却没有峰，原因是什么？
1、会不会是洗脱太快。
2、查查有没有断层。
3、SDS-PAGE 分离能力强,而在柱子FRACTION 中几个低峰依次串在一起就不明显了。
4、上柱前样品要浓缩，保证样浓度不能太低。如没浓缩，检测仪的量程又没选好，可能看不出来。
5、Sephadex 是Amersham 公司经典的层析填料，有很高的选择性，不同颗粒大小的填料有不同的分离范围，主要用于凝胶层析（亦称分子筛）。粗颗粒流速较快，细颗粒流速较慢，但分辨率较高。Sephadex 200的分离范围（以球蛋白计）是5－60kDa。这种填料的另一个优点是较便宜。（也够贵的）现已被新一代Bioprocess填料代替。
DEAE--纤维素 我没用过，应该是用于离子交换吧。这是一种弱阴离子填料。
以下情况都是正常的：
1，没有峰的部位有带。可能吸收低上样量少或者检测手段不对头（最麻烦，好像只好分部收集了，但是一般情况下，首先考虑的是找到更合适的检测手段）。
2，一个很好的峰的部位有很多带。这个就没有必要解释了。
3，有峰的部位没有带。可能是有紫外吸收的小分之或者降解的短肽（这个最可恨）或者在电泳中间分子量太小跑到顶端了等等。
4，同一个蛋白出现在不同的部位。在离子交换中可能是电荷分布不对称。上面的所有的还有一个可能就是柱子有问题，那我就不好说了。但是我用到的都是世界上最好的公司的预装柱，所以我就不考虑了。还有的情况是上面的1、4同时出现，那真是要把人气死！！！至于说拖尾，刺峰等等都很常见。而且首先大概就是考虑柱子效率下降了或者坏了。呵呵！！！
5、样品浓度多少才不算低？0.8mg/ml的蛋白质浓度算不算低。我不太想用透析袋浓缩，那样会丢失好多样品。想直接加样，洗脱。还有，上样体积问题？2.6*96cm 柱子，上100ml 的样品怎么样？最后一个问题，样品中含有少量edta会不会有影响？
1、如果是离子交换，上样浓度太大反而不好，这样子动态载量会减小；
2、如果是凝胶层析，上样浓度要尽量大些，道理和电泳一样，样品在跑的过程中不可避免地会被稀释，变得%26broad%26，杂质和目标蛋白的洗脱峰就有更多的部分重叠，影响纯度。
3、关于凝胶层析的上样量，通常是柱体积的2－5%，太多会影响分离效果。你的上样量显然太大了。在现有条件下，可以通过连续批次上样，即不等前次样品跑出柱子，就第二次上样，通常可以做到一个柱体积上两次样，这样子可以节省时间和试剂。但要具体摸索。
4、至于量程的设定，我建议先用缓冲液回零，再用注射器或泵将样品注入检测器，调至满刻度，应该差不多了。
5、edta 是常用的生物缓冲液的成分之一，它在某些情况下会影响层析，具体情况具体分析。
6、什么叫连续批次上样？具体我应该怎么fumble呀，我还从没听说过这个词呢。还望指教。
一般情况下，上柱的样品跑出柱子后，根据紫外或电导或其他检测器的情况分部收集完成后，才开始第二次上样，需要用至少一个柱体积的缓冲液。这种情况下，绝大部分缓冲液是用于将样品%26冲%26出柱子，尤其是后半部分的缓冲液。有些浪费。这部分缓冲液的完全可以再上一次样品，适当地调节两次上样的间隔，可以做到两次样品完全分开而不会重叠，从而一个柱体积的洗脱中可以两次上样，节省试剂，缩短时间，
即所谓%26连续批次%26。这是相对通常情况下而言的。
7、例子：样品是用10mMTris-Cl,pH7.4(含10mMEDTA),而流洗缓冲是30mMTris-Cl,pH7.9,我自己认为这样应该不会有太大影响吧，希望有知情者告知。好让我下次改正。
分析：根据你的描述，看来你是在用Sephadex 26/100做凝胶层析。
1、凝胶层析主要用途有两个，一个是在其分辨率范围内根据分子大小进行分离，常用于蛋白质纯化的最后一步，即精细纯化（polishing），由于样品体积明显影响分离速度和分辨率，故很少用于粗提纯。另一个用途是脱盐/缓冲液置换，即将蛋白或其他大分子量的组分与无机盐等小分子组分分开。常用于不同层析步骤之间的缓冲液置换，使得样品与待使用的缓冲液成分尽量一致。目前Amersham公司的填料中Sephadex G25较常用于这方面。
2、如果你的凝胶柱子用于蛋白质的分离纯化，如我前所提，分辨率至关重要。装柱的效果直接影响分离效果。装得不好的柱子是对填料的浪费，尤其是用好的凝胶。不知道你是否测过这个柱子的柱效？合格的Sephadex G100柱子的每米理论塔板数应在之间。如果低于3000，最好重装。
3、平衡也很重要。柱子装完后，要用和上样缓冲液尽量相同的缓冲液平衡，流速也与上样尽量一致，平衡至少5 个柱体积，让填料%26喝饱%26，即流出的液体和进的液体成分尽量一致，有时紫外检测器的走线平稳并不一定意味着平衡完成即是如此。连续上样过程中，也要适当进行平衡，比如3－5 次上样后平衡2个柱体积，对柱子的分离效果和寿命都有好处。
8、问题：823a型紫外检测仪――3057型便携式记录仪。我不明白这种组装是啥道理？是通过什么信号使得记录仪能够记录到，由检测器检测出的信息。所以我在操作时，不知道怎么调节。那些按钮之间的关系？
1.短接记录仪，记录笔应回到机械零位，否则调之；
2.接通检测器，检测器中充满1mg/ml 的蛋白质溶液（如Albumin），调节检测器的信号输出（通常是用电压标识 mv），使记录笔接近100%满刻度；
3.检测器中充满缓冲液，看记录笔的位置，最好接近～10%刻度的地方，这样防止出现吸光度值低于缓冲液无法记录的情况；如果笔位太高，应增大检测器信号输出，重新按步骤2 调节；反之降低信号输出；有的记录仪也可调节输入信号的范围，这样子就更方便了。满刻度的调节要视具体应用，不一定是1mg/ml 的蛋白浓度。
9、about dimension of column:（davidzrock）
%26The choice of inner diameter may be based on the desired sample load or on considerations of the extra
dispersion
effects from the wall region,which extends 20 particle diameters away from the wall....The length of the column
is primarily chosen according to the resolution that is required.%26
%26The dimensions may be chosen according to the application at hand,but most laboratory columns have a4- to
16-mm inner diameter(i.d.)and a length of 25 to 70 cm.%26
-----From %26Protein Purification principles,High Resolution Methods,and Applications%26 2ed edited by J.C.Janson
and L.Ryden
%26The resolution of two separated zones in gel filtration increases as the sequare root of column length.Long
columns should,therefore,be used to obtain the best resolution in analytical fractionation.Bed heights of greater
than 1m are seldom required.If a very long bed is judged to be necessary ,the effective bed height can often be
increased simply by recycling or by using columns coupled in series.%26
从amersham商品化提供的预装柱能看到，没有超过1m的。很长的柱子装填难度极大。装得好的柱子一根可以当两根用。
关于手工装柱，取决于装柱操作者的经验，完全可以比预装柱的效果好，而且可以根据试验的具体情况改变柱子参数。但预装柱的优点是方便、省事，很适合对柱子和填料进行%26scaning%26。另外工业化的层析要求是重复性，%26对人是不信任的%26，而不要求最好的效果，只要满足要求即可。这时就要有装柱设备（packingstation）了。现应用于工业生产的凝胶层析柱直径已超过1m。
10、在室温下的柱子，怎么保证其胶不发霉
1.柱子装填和使用过程中要注意减少微生物的污染，如对缓冲液和样品等进行澄清、除菌过滤。低温并不能保证无菌生长。
2.柱子在使用过程中，要定期进行在位清洗/消毒（SIP/CIP，sanitization/clean in place）。如1M NaOH 处理1hr，可有效地减少微生物污染。具体使用哪种消毒剂以及消毒方法，请参阅凝胶及空柱使用说明书，避免损害凝胶柱。如你没有，我可帮你查。
3.柱子长期不用时，为防止微生物生长，建议在位保存。如用10mM NaOH或20%乙醇将柱内的液体全部置换出来，存放在建议温度下（不一定是低温）。使用前再进行冲洗和平衡。也可将凝胶取出，保存于上述溶液中。
4.如有微生物生长，应进行灭菌处理，如1M NaOH 或取出凝胶进行高温灭菌，具体方法亦需事先参阅说明书。
From Amersham
Antimicrobial agents for chromatography
Aqueous buffer solutions will often support growth of micro-organisms commonly found in laboratories.Since it is difficult to clean columns that have become heavily contaminated with microorganisms,precautions should be taken to avoid growth in the column or in buffer vessels.Always use fresh buffer solutions and cover the buffer vessels to keep out dust,spores and other particles.If a column will not be used for more than a couple of days,it should be equilibrated with the bacteriostatic agent described in the manual supplied with the separation medium or prepacked column.We recommend ethanol or sodium hydroxide for general use.These agents are effective,inexpensive and do not cause disposal problems.Ethanol 20% Many chromatography media from Amersham Biosciences are supplied as a suspension containing 20% ethanol.Ethanol,20%,can also be used as an alternative to NaOH for storing chromatography media under bacteriostatic
conditions.It should not be used for columns packed with Sephadex G-types and other media based on Sephadex since the bed will shrink and spoil the packing.Sodium hydroxide Sodium hydroxide,0.01 M,is an effective bacteriostatic agent.At higher concentrations (0.5-1.0 M)it is an
effective sanitizing agent for contaminated columns.For the most frequent contaminants in chromatographic systems,such as gram-negative bacteria,a good bactericidal effect is reached even at concentrations as low as
0.01 M NaOH.Treatment with sodium hydroxide inactivates endotoxins (LPS)and will,in many cases,solubilize substances precipitated on the column.Its low toxicity is an advantage that reduces the risk of sample contamination.Sodium hydroxide is not recommended for use with Sepharose or for storage of Sephacryl HR.
11、层析关于装柱和使用，主要有几点要注意的：（davidzrock）
1、装柱前要仔细看填料的使用说明书，每种填料都有自己的特性，以及特殊的装柱方法，针对不同的空柱，也要注意方法可能不同；2、填料要加水搅拌成均匀悬液，悬液浓度依填料而不同，一般70－85%，迅速倒入空柱内，或吸或压，流速和具体步骤看说明书。
3、这一点非常重要：装柱包括以后使用中绝对不允许柱内进入气泡（bubble free），柱头事先也要排除气泡。
4、选择合适的泵，首先是流速满足要求，脉冲尽量小。首选柱塞泵。
5、所有柱子尽量做到填料均匀，尤其是用于凝胶层析的柱子。装柱完成后，可用柱效测定的方法检查装填效果。一个装填合格的柱子的理论塔板高度应是填料平均粒径的2－4 倍，在此范围内越小越好。
6、准备上柱的液体应进行过滤，至少是0.45micrometre。
7、至于测序，我想大概不到1mg 应该足够了。
8、关于纯化，首先要考虑的是你的目标：纯度、数量、速度、收率等等，再根据样品的具体情况，尤其是目标蛋白的性质，确定纯化策略。通常三步曲：capture、purification、polishing。第一步先从大量或复杂样品中将目标蛋白%26抓出%26，与主要杂质分离；再用高选择性的层析去除绝大部分杂质；最后精细纯化，提供纯度至设定目标。到实际工作中，不要死靠三步，也许一步也许四步或更多，具体情况具体分析。所谓%26三步%26只是一种思路而已。
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亲和层析技术研究进展
（刘望才 化工学院 D040503）
摘要： 亲和层析具有高选择，高活性回收率和高纯度等特点已成为纯化蛋白质等生物大分子最有效的技术之一．本文综述了亲和层析技术及其发展趋势。
关键词：亲和层析 配基 研究进展
Research and development of affinity chromatography
（Wangcai Liu ，the Institute Chemical Engineering，D040503）
Abstract：Affinity chromatography is one of the most efficient techniques in biologic macromolecular separation and purification which has the advantages of high specificity，high recovery efficiency，high purity and so on．The types and development of affinity chromatography are introduced。
keyword： Affinity Chromatography，ligand ,review
亲和层析(Affinity Chromatography，AC)是利用偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目标产物，使目标产物得到分离纯化的液相层析法。亲和层析已经广泛应用于生物分子的分离和纯化，如结合蛋白、酶、抑制剂、抗原、抗体、激素、激素素受体、糖蛋白、核酸及多糖类等；也可以用于分离细胞、细胞器、病毒等[1，2]。
亲和层析技术的最大优点在于．利用它可以从粗提物中经过一些简单的处理便可得到所需的高纯度活性物质。利用亲和层析技术成功地分离了单克隆抗体、人生长因子、细胞分裂素、激素、血液凝固因子、纤维蛋白溶酶、促红细胞生长素等产品[3]，亲和层析技术是目前分离纯化药物蛋白等生物大分子最重要的方法之一。
近几十年来，亲和层析技术发展十分迅速。对于那些分离流程长、浓度低、杂质多、采用常规方法难以进行分离的生物分子来说，亲相层析技术就显示出其独特的优越性。亲和层析在分离、纯化的效率上可以说是最重要的方法之一[4，5]。
本文讲述了亲和层析的技术要点，介绍了免疫亲和层析、金属离子亲和层析等主要的亲和层析方法，还介绍了各种亲和层析联用技术。
1 亲和层析的一般问题
1．1 配基的选择
将一对能可逆结合和解离生物分子的一方与水不溶载体相偶联制成亲和吸附剂，这样一对生物分子中，被偶联的一方就叫作配基。在实际工作中，究竞选择哪一种物质作配基，要根据分离对象和实验的具体情况而定。纯化酶选择酶的竞争性抑制剂、底物、辅酶和效应剂作配基。纯化酶的抑制剂选择相应的酶做配基。纯化能结合维生素的蛋白质，选择与其专一结合的维生素做配基。纯化激素受体蛋白，选择相应的激素做配基，纯化核酸可以根据核酸与蛋白质的相互作用、脱氧核糖核酸分子中不同互补链之间、DNA和R14A之间杂合作用的关系选择合适的配基[5]。
1．2 载体的选择
将亲和配基共价偶联在固体粒子的表面(或孔内)即可制备亲和吸附介质，该固体粒子通常称为配基的载体。因此，亲和吸附介质又称亲和载体。作为载体的固体粒子应满足下列要求[3，5]：(1)具有亲水性多孔结构，无非特异性吸附，比表面积大；(2)物理和化学稳定性高，有较高的机械强度，使用寿命长；(3)含有可活化的反应基团，用于亲和配基的固定化；(4)粒径均一的球形粒子。常用的亲和层析载体有：琼脂糖凝胶和交联琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺—琼脂糖凝胶、纤维素、多孔玻璃等。其它用于载体的物质还有：聚苯乙烯、淀粉珠、壳聚糖、硅胶等。
1.3 基质活化和偶联
大部份基质在偶联抗体之前，均需要进行化学活化。活化基质通常经过与抗体表面残基的—NH反应将抗体偶联，偶联反应也可通过与抗体表面的一0H、一C00H或一NH进行。
在小配体的亲和色谱中，间隔臂常插在基质和配体之间，以尽量减少空间位阻对蛋白质与其配体相互作用的影响[6]。当配体本身就是蛋白质大分子，因此，空间位阻将不会阻碍抗体与抗原的相互作用。
最常使用的基质活化方法是溴化氰法。用溴化氰活化多糖类基质具有简单、效果好的特点。许多活化好的、稳定的基质已商品化，在仅仅需要少量基质时可以购买。如果基质的需要量大，自己进行活化更为经济。
1．4 洗脱问题
洗脱亲和吸附剂上吸附的物质大多采用非特异洗脱的方法，通过改变洗脱液的PH值、离子强度、离子种类或温度等理化性质使固定化配基和生物高分子之间的亲和力降低，以至解开生物高分子和亲和吸附剂之间的结合。假如那些纯化对象和亲和吸附剂的亲和力不强，当连续通过大体积的平衡缓冲液时，便可在紧随杂蛋白洗出蜂后，得到纯化对象的组分。对于那些吸附得比较牢固的大分子，必须用较强的酸或碱作为洗脱液。也可以用特异洗脱的方法，利用含有与亲和配基或目标产物具有亲和作用的小分子化合物溶液为洗脱剂，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合，脱附目标产物。另一种洗脱的方法是利用配基通过重氮键或硫脂键连接在载体上的这一特点，当吸附生物大分子以后，可以用还原剂断裂重氮键或断裂硫脂键，从而得到生物大分子和配基的络合物，然后将络合物解离，再分出欲纯化的生物大分子[5，6]。
1.5 应用举例
刘卫刚等[7]用脂多糖亲和层析柱吸附抗脂多糖抗体取得