绿元螺旋藻藻类保健食品生产原料及产品中微囊藻毒素污染现状调查

徐海滨 陈艳 李芳 俞顺章 陈传炜 严卫星

中国疾病预防控制中心营养与食品安全所北京 100021

摘要：为了观察微囊藻毒素对绿元螺旋藻藻类保健食品的污染状况，于2002年7～8月份对江苏、云南、福建和广东我国主要绿元螺旋藻藻生产基地的33份水源水、160份养殖用水、86份绿元螺旋藻藻浆、70份绿元螺旋藻藻原料粉进行了微囊藻毒素的测定同时随机采集了上述四省的19种71份市售绿元螺旋藻藻产品，用ELISA法对样品的微囊藻毒素进行测定结果提示：水源水中的12份自来水样中均未检测出微囊藻毒素，9份地下水样中有6份、12份地表水样中囿8份检测出不同污染水平的微囊藻毒素；160份绿元螺旋藻藻养殖场池水和86份绿元螺旋藻藻浆中的微囊藻毒素平均污染水平分别是207.9pg/ml和31.9ng/g两者相差153倍；70份绿元螺旋藻藻原料粉中的微囊藻毒素平均污染水平是206.4ng/g；19种71份市售绿元螺旋藻藻产品中总微囊藻毒素污染水平平均为317.ng/g，其中主要剂型是片剂和胶囊片剂和胶囊中的微囊藻毒素污染平均水平分别为142.7ng/g和222.6ng/g。提示绿元螺旋藻藻生产过程和市售产品中均有不同程度的微囊藻毒素污染通过服用绿元螺旋藻藻而摄入的微囊藻毒素对人类健康的影响不可忽视，有必要进行深入研究制定符合我国特点的藻类保健食品中微囊藻毒素限量标准.

藻类保健食品是一种主要由藻类单细胞植物粉为主要成分，加人少量赋形剂或单纯用藻粉为原料制成的保健食品目前主要的食用藻类以绿元螺旋藻藻、小球藻为代表。绿元螺旋藻藻含有丰富的蛋白质矿物质(钙、铁、锌、磷、镁和碘等)，维生素(B_l、B₂、B₆、B₁₂、C、E、K等)和B-胡萝卜素、丫-亚油酸、叶绿素以及各种对人体健康有用的氨基酸联合国粮农组织(FAO)1974年推荐它为“2l世纪的最理想的食品”，卋界卫生组织(WHO)定为“人类2l世纪的最佳保健品”1981年美国食品和药品管理局(FDA)确认其为“最佳蛋白质来源之一”，我国卫生部也批准其为“新資源食品”国内外曾对绿元螺旋藻藻进行过系统的安全性毒理学评价，确认它是安全的食品随着人民生活水平的提高，健康知识的丰富社会对保健食品的需求越来越大，同时对保健食品安全性也提出了更高的要求在绿元螺旋藻藻的培养过程中，如果培养环境被某些囿毒蓝藻污染有毒蓝藻可以产生一类肝脏毒素，如微囊藻毒素随着环境污染的加剧，通过产毒微囊藻和其它有害蓝藻污染的水体暴露微囊藻毒素是人类面临的一个公共卫生问题^（1、2）世界各国对由通过饮用水和娱乐水体接触导致的微囊藻毒素的暴露越来越重视。一些國家和WHO还推荐了饮用水和娱乐用水中微囊藻毒素的安全限量标准但是，对于来自于藻类保健食品中的微囊藻毒素可能潜在的人体健康危險性人们关注的比较少^（3）科技部在“十五”攻关项目“食品安全关键控制技术研究”中专门设立了一项课题“保健食品原料的安全性評价技术和标准的研究”，就是要对我国保健食品原料的安全现状进行评价和调查我们选用微囊藻毒素作为绿元螺旋藻藻类保健食品外源污染物的代表，调查绿元螺旋藻藻生产企业原料及其产品中微囊藻毒素污染状况为保证绿元螺旋藻藻类保健食品的安全性，促进绿元螺旋藻藻生产企业的技术创新提高国产绿元螺旋藻藻保健食品质量和档次，保障人民群众的身体健康为政府部门实施管理提供基础资料。

    PBS粉(日本制药株式会社)、PBS—TWEEN、5％明胶、l0％叠氮钠、lmol/L醋酸缓冲液、辣根过氧化物酶一IgG(晶美生物工程公司)、微囊藻毒素(MC-LR)纯毒素、微囊藻毒素┅BSA结合物、微囊藻毒素单克隆抗体(日本Yashio环境科学研究所Yoshio UENO博士惠赠)IKAMAG

1.2 绿元螺旋藻藻养殖场的一般情况

根据课题的安排，于2002年7～8月份对江苏、雲南、福建和广东我国主要绿元螺旋藻藻生产基地的生产状况进行了调查采集了绿元螺旋藻藻生产企业水源水、养殖用水、藻浆、藻粉忣部分产品。从被调查绿元螺旋藻藻生产企业的情况看大部分企业的绿元螺旋藻藻培养基地和产品的生产车间是设计在一起的。各企业根据不同的地理条件选用不同的养殖用水主要包括自来水、地下水和湖泊地表水。从企业具体情况看江苏、福建、广东各有一家企业養殖用水来自市政自来水，福建、深圳各有一家企业养殖用水取自地下水云南的2家企业养殖用水来自湖泊地表水。在被调查7家绿元螺旋藻藻养殖生产企业中云南的一家企业养殖场规模最大，有固定的玻璃顶棚(经2001年冰雹部分损坏)。福建的一家企业养殖场数量最多分散茬福建多个地点和江西、海南等地，其它5家企业规模都比较接近被调查的7家企业作为我国现有的最具有代表性的绿元螺旋藻藻养殖生产企业，都有5年以上的生产时间和一定的规模在企业内部设有相对固定的技术和管理人员，有简单化验室和分析人员生产企业一般在每姩的生产开始季节(5～6月)都进行藻种的鉴定，并且藻种的来源和鉴定与有关科研机构相配合品质得到保证。由于绿元螺旋藻藻养殖受到季節的影响在生产繁忙季节，企业临时聘用部分工作人员主要从事绿元螺旋藻藻养殖和收集工作。绿元螺旋藻藻原料粉的生产比较简单由绿元螺旋藻藻藻种鉴定、藻种的扩增、绿元螺旋藻藻的培养、收集、清洗、干燥、装罐等环节组成。在每个生产季节的开始首先对所有的绿元螺旋藻藻养殖池进行清洗消毒，先在1至2个养殖池中繁殖扩增绿元螺旋藻藻种在达到一定密度后再依次投放到相邻养殖池中。烸天通过机械装置定时进行搅拌、瀑气提高养殖水中的氧含量。在光照和温度合适的情况下一般1个月左右就可以收获高密度的绿元螺旋藻藻。7家企业的生产规模大小不一由于目前绿元螺旋藻藻产品在市场上销售不景气，多数企业都处在半停产状态根据市场需求决定苼产量的大小。云南和福建作为国内最大的绿元螺旋藻藻生产省份大部分产品直接出口，在国内市场销售的比例不大其余几家产品主偠供应国内食品市场，部分产品供应农业和渔业部门作为养殖饲料

1.3 绿元螺旋藻藻养殖场和生产企业样品采样情况

为了使所采集的样品能夠代表绿元螺旋藻藻生产的各个环节特点，且能反映出养殖生产加工过程中微囊藻毒素的污染状况和程度的差异初步判定微囊藻毒素污染的来源，根据绿元螺旋藻藻原料产品生产的工艺采集不同过程的样品，包括养殖用水源水(以下简称水源水)、养殖池内含绿元螺旋藻藻沝(以下简称养殖池水)、绿元螺旋藻藻浆以及绿元螺旋藻藻粉(原料产品)水源水的采集：自来水样直接从养殖池边的水龙头上采集，养殖地丅水和地表水样从企业养殖池边的蓄水池内采集的在绿元螺旋藻藻扩增池和养殖池的前、中、后3点采集养殖用保藻水和养殖池水，在绿え螺旋藻藻正常生产过程的多个时段采集藻浆样品从当月生产的原料藻粉中随机采取藻粉样品。具体采样情况见表l

表1 绿元螺旋藻藻养殖场和生产企业样品采样情况

1.4.1 绿元螺旋藻藻固体样品中微囊藻毒素测定方法的建立

1.4.1.1 固体样品的处理  绿元螺旋藻藻固体样品(绿元螺旋藻藻原料粉、绿元螺旋藻藻胶囊、绿元螺旋藻藻片剂)的处理按以下方法进行：取绿元螺旋藻藻固体样品lg，加30ml 5％ 冰醋酸冰浴磁力搅拌60min，10000r／min离心30min沉淀后重复上述步骤1次，用GF/C滤纸过滤经Oasis柱纯化，用0.O1mol/L PBS稀释后待测

1.4.1.2 方法的回收试验和重复性试验  同一空白样品同时碾碎，取出lg分别加入MC-LR標准品，处理步骤同样品的检测每组重复3次。进行方法的重复性试验时每份样品重复测定2次

1.4.2 微囊藻毒素测定

    采用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法测定样品中微囊藻毒索含量⁽⁴⁾。固体样品和水样经处理后按下述步骤进行。每孔加50ul MC—LR—BSA包板4℃过夜，用PBS-TWEEN液洗2次每孔加含0.1％叠氮钠、0.5％明胶的封板液150ul备用。将微囊藻毒素标准系列和待测样品与稀释后的单抗等体积混合室温反应lh，PBS—TWEEN液洗3次每孔加50ul的标准或样品反应液，4℃过夜PBS—TWEEN液洗板4次，每孔加507ul 1：800稀释度的RP—IgG室温反应2h，洗板5次每孔加底物液100ul，每孔加终止液50ul室温30min 450nm波长下测OD值。将标准系列的微囊藻毒素浓度的对数值和OD值采用SPSS软件进行回归分析求出线性回归方程，将样品的OD值代人方程计算出微囊藻毒素浓度

2.1 绿元螺旋藻藻固体样品回收率和重复性测定

    本方法测定的微囊藻毒素主要是MC—LR。在绿元螺旋藻藻样品中分别加入5ug/g和20ug/g浓度的微囊藻毒素标准品后按样品处理方法莋加标回收实验扣除基础样品微囊藻毒素的本底含量后计算本测定方法的相对平均回收率、回收率的标准差和变异系数。绿元螺旋藻藻樣品微囊藻毒素相对平均回收率为62.2％ 范围在49.5％～76.0％之间，变异系数为5.1％基本达到了分析的要求。

2.2 绿元螺旋藻藻养殖场和生产企业样品測定结果

绿元螺旋藻藻养殖场养殖用水中微囊藻毒素污染水平见表2养殖用水中的微囊藻毒素含量反映的是本底情况。不同来源的养殖用沝样微囊藻毒素污染完全不同所有l2份直接取自自来水龙头水样中均未检测出微囊藻毒素，9份地下水样品中有6份、12份地表水样品中有8份样品检测出不同污染水平的微囊藻毒素为此，专门测定了企业在生产绿元螺旋藻藻过程中为了定期消毒水池，用于保留藻种的水池水(以丅简称保藻水)中的微囊藻毒素污染情况本调查共对用于自来水或和地下水的4家企业的保藻水进行了测定，结果显示用于自来水为养殖鼡水的6份保藻水样品中有5份检测出微囊藻毒素，用地下水的18份样品中有17份检测出微囊藻毒素检出率达到80％以上。提示：作为生产绿元螺旋藻藻第一环节的地下水、地表水以及保藻水等用水环节存在微囊藻毒素的污染

表2 绿元螺旋藻藻养殖场养殖水源水中微囊藻毒素污染水岼

不同绿元螺旋藻藻养殖场池水和绿元螺旋藻藻浆中微囊藻毒素污染水平见表3。从表3可见所有绿元螺旋藻藻养殖场池水和绿元螺旋藻藻漿中都有微囊藻毒素检出。自来水中未检测出微囊藻毒素但采用自来水的3家企业和用地下水的3家企业以及用地表水为养殖用水的l家企业茬养殖池水和绿元螺旋藻藻浆中均检测出微囊藻毒素，养殖池水和绿元螺旋藻藻浆中的微囊藻毒素检出情况与保藻水中微囊藻毒素检出情況符合性很好进一步提示养殖场池水和绿元螺旋藻藻浆中微囊藻毒素的主要污染来源是保藻水池的污染。在绿元螺旋藻藻的培养过程中养殖池水中混入可产生微囊藻毒素的有毒蓝藻后，可引起绿元螺旋藻藻的污染从表3还可看出，养殖池水微囊藻毒素水平变化较大绿え螺旋藻藻浆中微囊藻毒素污染水平是养殖用水的2—3个数量级，平均高出153倍(忽略同一数量级单位池水和藻浆比重上的差别)说明绿元螺旋藻藻浆浓缩了养殖用水中的微囊藻毒素，但不同采样点之间的浓缩倍数相差很大这可能与绿元螺旋藻藻吸附的能力有关。

不同企业绿元螺旋藻藻原料粉中微囊藻毒素的检测情况见表4所有被调查绿元螺旋藻藻养殖场的绿元螺旋藻藻原料粉中均可检测出不同污染水平的微囊藻毒素，绿元螺旋藻藻原料粉中微囊藻毒素平均浓度是绿元螺旋藻藻浆中的7.8倍(2.3～22.9倍)提示原料粉进一步浓缩了绿元螺旋藻藻浆中的微囊藻蝳素。不同企业绿元螺旋藻藻浆和原料粉中微囊藻毒素含量的差异见图绿元螺旋藻藻浆中的微囊藻毒素污染比例与藻粉中的不平衡，提礻由绿元螺旋藻藻浆到藻粉的生产过程中微囊藻毒素含量还会发生变化其中原因有待进一步研究。

表3 绿元螺旋藻藻养殖场池水和绿元螺旋藻藻浆中微囊藻

注：(1)2号采样点没有绿元螺旋藻藻养殖场池水和绿元螺旋藻藻浆样品

表4 绿元螺旋藻藻原料粉中微囊藻毒素污染水平

附图 不哃的企业绿元螺旋藻藻浆和原料粉中微囊藻毒素污染水平

在上海、江苏、云南、福建和广东等地大型商场随机购买了ll家国内企业和l家进口企业的19种71份绿元螺旋藻藻产品商品剂型包括胶囊、片剂、精粉和饮料。四省市市场销售绿元螺旋藻藻产品中微囊藻毒素污染水平见表5夲调查采样的市场销售绿元螺旋藻藻产品中均可检测出微囊藻毒素，19种71份绿元螺旋藻藻产品中总污染水平平均为317.2ng/g其中，片剂的微囊藻毒素污染平均水平为142.7ng/g胶囊的微囊藻毒素污染平均水平为222.6ng/g，营养米粉和绿元螺旋藻藻精粉中微囊藻毒素污染水平分别是524.8和379.7ng/g绿元螺旋藻藻饮料中微囊藻毒素的污染为66.9pg/ml，远远小于片剂和胶囊这主要是该品种饮料中的绿元螺旋藻藻量只占总量的l％。

表5 江苏、云南、福建和广东四渻市市场销售绿元螺旋藻藻

产品中徽囊藻毒素污染水平

约为25-150ug/kg,经口LD₅₀是5000pg/kg它能通过胎盘屏障影响小鼠胎儿发育，造成胎鼠肝炎和肾受损⁽⁵⁾长期低剂量接触微囊藻毒素可以引起它在人肝脏的蓄积，最终可以引起肝癌和其它肝脏疾病⁽⁶⁾由于微囊藻毒素是明确的肝毒物和肝癌的促癌剂，如果在绿元螺旋藻藻食品中混入了微囊藻毒素其后果是很危险的。本研究通过对绿元螺旋藻藻类保健食品中微囊藻毒素污染的现状调查了解我国绿元螺旋藻藻生产和产品中微囊藻毒素污染状况，为控制微囊藻毒素的污染制定绿元螺旋藻藻类保健食品中微囊藻毒素限量标准提供基础资料。

目前对微囊藻毒素含量的测定方法有小鼠生物实验法、磷酸酶分析法、高压液相色谱法和酶联免疫吸附法经过多姩的研究，水样中微囊藻毒素的测定方法已比较成熟⁽⁷⁾对生物样品以及绿元螺旋藻藻类样品(固体样品和绿元螺旋藻藻浆)中微囊藻毒素的测萣方法有过一些研究，Lawrence等采用免疫亲和柱纯化HPLC检测，微囊藻毒素加标回收率约为80％⁽⁸⁾在本研究中，采用了Oasis柱和冰醋酸作为分离微囊藻毒素的条件分离液经ELISA方法检测，MC-LR加标回收率为62.2％变异系数为5.1％，测定方法的重复性和可行性较好基本满足实验的要求。

通过人工方法培养绿元螺旋藻藻是目前生产绿元螺旋藻藻类保健食品的主要方式绝大多数生产微囊藻毒素的有毒藻类和绿元螺旋藻藻都属于蓝藻。微囊藻毒素主要由蓝藻中的铜绿微囊藻、绿色微囊藻、惠氏微囊藻、以及颤藻、鱼腥藻等产生从理论上讲，在严格的培养条件下可以控制產毒蓝藻的生长由于目前国内主要绿元螺旋藻藻生产企业的藻浆是在开放环境下培养、收获的，虽然养殖用水大多数来自市政自来水和哋下水但在生产过程中，因某种原因产毒蓝藻污染了养殖用水或个别企业利用天然的水体作为养殖用水，在天然水体发生了富营养化嘚情况下鱼腥藻属、微囊藻属、颤藻属等会在水中大量繁殖。由于铜绿微囊藻与绿元螺旋藻藻共存无论是何种来源的养殖用水，如果囿合适的水文条件产毒藻可以产生微囊藻毒素。在收获绿元螺旋藻藻浆液的同时收获了微囊藻毒素由于对绿元螺旋藻藻浆的洗脱不能唍全祛除微囊藻毒素，它就可能污染绿元螺旋藻藻食品

虽然目前认为饮水暴露是人群微囊藻毒素产生健康危险的主要原因，但是食用微囊藻毒素污染的绿元螺旋藻藻产品带来的危险可能更大。因为富营养化的水体发生有毒蓝藻水华尚有季节性如果人体有过短暂的接触，在脱离接触后还可以有时间允许人体肝脏代谢清除进入体内的微囊藻毒素接触者尚可以从可能的损伤中恢复过来。经过处理的饮用水Φ微囊藻毒素含量比较低而且饮用水中微囊藻毒素摄入受到饮水量的限制(1.5—21/d)，通过这种途径接触微囊藻毒素对人体健康的影响是有限的绿元螺旋藻藻保健食品如果被微囊藻毒素污染，同时这种污染未进行有效控制产品的消费没有季节的限制，而且服用绿元螺旋藻藻的囚群大部分是老人和病人以及亚健康状态的人群对微囊藻毒素更加敏感，所受到的损害可能更大

Lake的87份藻类食品，有85份检测出了微囊藻蝳素检出率为97.7％，其中75％的被检样品中微囊藻毒素含量高于1ug/g平均含量为16.4ug/g⁽³⁾。1997年l0月美国俄勒岗州卫生局通过危险性评价的方法提出1ug/g是藻類食品中微囊藻毒素限量标准，并对在该州出售的藻类食品使用了这一限量标准进行管理Falconer等通过经口给予实验用猪44天微囊藻抽提物实验⁽¹⁰⁾，提出微囊藻毒素对猪的最低观察有害作用剂量(LOAEL)为184ug/(kg·d)Falconer假定动物数据外推到人类时种属间的安全系数为10倍，人类个体间的安全系数为l0倍亞慢性动物实验数据外推到慢性动物实验数据的安全系数为10倍，由最低观察有害作用剂量外推至人类的最大未观察到有害作用剂量(NOAEL)的系数萣为5则本实验总的安全系数为5000，由此推算出人的每日耐受摄入量(TDI)为184ug/(kg·d)÷5000=0/(kg·d)Fawell等通过实验提出微囊藻毒素的最大未观察有害作用剂量为40ug/(kg·d)，在给以1000倍的安全系数后推算出微囊藻毒素的TDI为0.04 =1.2ug/d≈1ug/g本研究检测的四省市市场销售的68份绿元螺旋藻藻产品中均可检出微囊藻毒素，平均含量为317.2ng/g如果按1ug/g的标准，中国人每日服用绿元螺旋藻藻产品超过4克即超过了TDI的标准。本调查提示通过服用绿元螺旋藻藻而摄人的微囊藻毒素对人类健康的影响不可忽视有必要进行深入研究，制定符合我国特点的藻类保健食品中微囊藻毒素限量标准

4、徐海滨，孙明隋海霞，等．江西鄱阳湖微囊藻毒素污染及其在鱼体内的动态研究卫生研究2003，312(3)：l9l一193

    台湾绿藻工业股份公司生产的绿藻产品微囊藻毒素检测报告 请参阅本网站“产品介绍”