分子量160要15Kd蛋白转膜转多久多长时间

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2022-11-20 06:06 标签： 15Kd蛋白转膜转多久

蛋白名称（可保密）：ICAM-1

转膜方式（恒压、恒流）：湿转 恒流 300 mA

一抗用的santa cruz 1 mL包装的。 比例调整到1：800做出很好的条带。效价会一直降低的。去年做的这个指标，今年夏天做就不行了。

转膜方式（恒压、恒流）：0.2 A恒流

转膜方式（恒压、恒流）：0.25 A恒流

蛋白名称（可保密）：保密

蛋白分子量：80 KD

转膜方式（恒压、恒流）：半干转移系统恒流，勿超过0.85 mA/cm2，同时转多张膜电流需累加（串联）

其实有些东西并不是非常严格的，要转移的目的蛋白分子量小，那么转移的时间就短一些，反之，则长一点；蛋白量充足，可以多转一会，蛋白量较少，则要少转一下，免得蛋白穿膜而过到了上而前功尽弃。

蛋白来源：人和鼠肝癌细胞、胞浆、胞核蛋白

蛋白名称（可保密）：***

转膜方式（恒压、恒流）：恒流 200 mA

转膜设备：湿转 北京六一 24D mini

蛋白名称（可保密）：保密

转膜方式（恒压、恒流）：湿转 90 V 电流约为230--280 mA之间。两张膜串联叠加。

蛋白名称（可保密）：蛋白

转膜方式（恒压、恒流）：恒流 0.85-1 mA/平方厘米膜

转膜设备: 北京六一 半干转

建议：转膜缓冲液用新鲜配制的，可先配成2倍的母液，转膜液的多少会影响电转的效率，一般将吸水纸润湿即可，不要和膜一起浸泡，这样效果很好。

蛋白来源：人肝癌肿瘤细胞

蛋白名称（可保密）：notch

转膜方式（恒压、恒流）：恒流 0.3 A

建议：转膜缓冲液用新鲜配制的，可先配成10倍或5倍的母液，保持低温是转膜效果的一个保证，这样效果很好。

蛋白来源：胶质瘤细胞总蛋白和核蛋白

转膜方式（恒压、恒流）：0.35 恒流

转缓液的配制有点讲究。如果蛋白大于一百多，一般加入，时间延长结果会更好些。

由于，目前试验的蛋白就都不大，所以，我们都采用不加SDS的转缓液，跑出来的条带也很整齐、干净。

蛋白名称（可保密）：保密

转膜方式（恒压、恒流）：恒压

转膜设备：湿转，天能。

WB用膜类型、孔径：PVDF（0.45）膜

转膜方式（恒压、恒流）：300 mA 恒流

转膜缓冲液：25％甲醛 觉得这个浓度的甲醛可以有效降低电转的热量，而且使膜对蛋白的吸附效果较好，Marker转到膜上很鲜艳。 用立春红染色效果也很好。

WB用膜类型、孔径：PVDF

转膜方式（恒压、恒流）：0.3 A 恒流

转膜方式（恒压、恒流）：恒压， semi-dry

蛋白来源：肺脏、肝脏等。

蛋白名称（可保密）：actin

蛋白分子量：43 kD

转膜方式（恒压、恒流）：湿转 恒流 200 mA

用的santa cruz 分装和整装的都可以。效价一般1：1000-1：3000左右，可稳定较长一段时间。

蛋白名称（可保密）：保密

转膜方式（恒压、恒流）：恒流250

蛋白名称（可保密）：保密

转膜方式（恒压、恒流）：恒流，200 mA

转膜设备:湿转,北京六一

WB用膜类型、孔径：NC

转膜方式（恒压、恒流）：恒压

蛋白名称（可保密）：保密

转膜方式（恒压、恒流）：20 V

蛋白来源：子宫内膜癌组织

蛋白分子量：156.8

WB用膜类型、孔径：NC膜

转膜方式（恒压、恒流）：恒流400mA

蛋白名称（可保密）：（多种，30个以上）

WB用膜类型、孔径：PVDF

转膜方式（恒压、恒流）：恒压100 V（电流在280 mA至350 mA之间）

蛋白名称（可保密）：保密

转膜方式（恒压、恒流）：湿转 恒流 350 mA

一抗用的sigma 羊抗大鼠，0.2 mL包装的，打折后价格3000多，有些贵哦。

比例调整到1：1500左右条带可，用BSA封闭。但是背景稍高。

WB用膜类型、孔径：PVDF膜，

转膜方式（恒压、恒流）：80 v恒压

蛋白分子量：约35 kD（双亚基）

转膜方式（恒压、恒流）：恒流200 mA

转膜设备：湿转Bio-rad,天能，六一

转膜时间其实不需要那么长的，转膜没转上一般原因不在这里，可能是转膜液的原因：有些蛋白SDS可能影响其与膜的结合，还原型电泳因巯基乙醇的原因也可能导致后面的不结合（这是我最近的经验教训），还有一抗的选择很重要，一定要选识别线性表位的抗体，才能用于做WB。

蛋白名称（可保密）：全部的可溶性蛋白

转膜方式（恒压、恒流）：湿转 恒流300 mA

蛋白来源： 骨肉瘤细胞

转膜方式（恒压、恒流）： 半干转 恒流200 mA

转膜设备：Bio-Rad 型号忘了，就是有4个插孔的电泳仪。

建议改进方向：低温很重要，新鲜的电转液也很重要。

蛋白质印迹法标准操作流程

3、电泳、转膜试剂及耗材
4、封闭、一抗二抗孵育及曝光试剂
  • a. 贴壁培养细胞收集
    去除贴壁细胞的培养液，用PBS、NS或无血清培养基清洗1次，低速离心，弃上清，留取沉淀。
  • b. 悬浮培养细胞收集
    速离心悬浮细胞，弃上清，收集沉淀。手指轻弹细胞，使其松散。
    • 把组织剪切成细小的碎片，越小越好。取液氮或超低温冰箱中冷冻30min以上的组织，迅速用液氮研磨，研磨过程尽量控制在1~2min之内，以减少蛋白的降解。
    将装有细胞沉淀或组织碎片的容器完全插入冰中。细胞沉淀按照1mL裂解液/107个细胞(1个T75培养瓶细胞量)的比例加入相应体积的裂解液（细胞量足够时都加入3mL，不足时根据细胞量计算），裂解20min，每隔5min将离心管置于涡旋振荡仪上震荡10s。组织碎片按照0.5mL 裂解液/100mg组织向匀浆器中加入蛋白裂解液，每3min研磨一次，重复5次，使组织尽量碾碎。（裂解液中根据需要选择添加或不添加蛋白酶抑制剂）。 把裂解好的样品配平后，置于预冷的高速冷冻离心机中，12000 rpm，15min。 完成离心后，上清即为蛋白提取液。吸取少量蛋白提取液做蛋白浓度测定。向剩余的蛋白提取液的离心管中加入1/4上清体积的5×Loading Buffer（最终工作液为1X)，待干式恒温器温度升至95℃后，将1.5mL离心管插入加热孔中，95℃加热变性10min，待液体完全冷却后置于-20℃保存。

（3）蛋白浓度测定（BCA法）

    根据样品数量，按50体积BCA试剂A加入1体积BCA试剂B（50:1）配置适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24h内稳定。 BSA）稀释至50μl，使终浓度为1mg/ml。稀释后的蛋白标准品可以-20℃长期保存。此标准品溶液的稀释液可使用去离子水或1*PBS。将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加入到96孔板中，加稀释液补足到20μl（见附表）。加适当体积样品到96孔板的样品孔中，如果样本不足20μl，需加稀释液补足到20μl。请注意记录样品体积。各孔加入200μl BCA工作液，37℃放置20-30min。用酶标仪测定A562，或540-595nm之间的其他波长吸光度。根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。
  • 根据不同蛋白大小，选择不同浓度的分离胶（见附件表）。将制备好的胶溶液注入预先安装好的制胶器中，加入异丙醇封胶。室温水平放置30min左右。注意防止胶溶液产生气泡并注入制胶器中；注胶前再加入TEMED，防止注胶前凝固；注入异丙醇时需沿玻板一边缓慢拖动加入。
  • 分离胶凝固后，沿玻板一边倒出异丙醇，并用滤纸吸干。再根据需要的体积制备浓缩胶（见附表）。将制备好的胶溶液注入制胶器中，并把准备好的样品梳沿玻板一端缓慢插入胶溶液中，室温水平放置20-30min。注意样品梳与胶溶液之间避免气泡产生。
  • 上样完以后，连通电泳仪电源，注意正负极需连接正确，设定适宜的电泳参数，浓缩胶电泳参数为恒压80V，待样本进入分离胶时，可将电泳调至120V。当溴酚蓝电泳到凝胶底部时，停止电泳，关闭电泳仪电源。
  • a. 转膜缓冲液至少提前2h （即开始电泳后）放入-20℃冰箱预冷。
  • 取出玻板中的凝胶，在夹板上依次放一块多孔垫、三张滤纸、凝胶、NC膜、三张滤纸、一块多孔垫（“三明治”结构），将转好的膜放在转膜槽，按一定的条件进行转膜。（见附表）
  • 将膜从“三明治”结构中取出，放入合适的抗体孵育槽中，加入Western Blocking Buffer室温孵育1h，一张6.3×8.3cm大小的膜加入6~7ml即可。
  • b. 封闭结束后，将稀释好的一抗工作液倒入孵育槽中，室温2h或4℃过夜。
  • a. 一抗洗涤结束前10min，将二抗用1XTBST Buffer按照合适比例进行稀释。
  • b. 洗涤结束后，将稀释好的二抗工作液加入孵育槽中，室温1h。
  • a. 根据膜的大小，按每 10cm2 膜使用 1-2ml 工作液，按比例吸取等体积的 SolutionⅠ和 SolutionⅡ混匀，配制成发光检测工作液。
  • b. 用平头镊子将膜取出，膜的下缘轻轻接触吸水纸，去除膜上多余的液体。用移液器将工作液加到转印膜上，使其均有覆盖，室温孵育 1-2min，此步骤可在洁净保鲜膜上或塑料盒中完成。
  • c. 压片检测：将膜固定于片夹内。暗室内压片 1 分钟，立即显影定影，根据结果再调整压片时间。或直接分别压片 30 秒、1、3、 5 分钟，然后一起显影定影观察结果。
  • d. 荧光成像仪检测：将膜放置到荧光成像仪内，参考仪器说明书进行检测。

附表1：BSA标准品稀释

对应的蛋白含量（mg/ml）
0 0
0

附表2：分离胶浓度的选择

备注：X为目的蛋白大小

备注：X为目的蛋白大小

免疫组织化学标准操作流程（石蜡切片——非磷酸化项目检测）

微波炉、4℃冰箱、恒温恒湿箱、烘箱、光学显微镜、移液器、孵育湿盒、抗原修复盒。

  • (3) 封闭液：5%空白山羊血清;
  • (7) 脱蜡液、无水乙醇（分析纯）、去离子水（dH2O）、Mayer’s苏木素、中性树胶封片剂。
  • （1）烤片：将石蜡切片按同一朝向放置在切片架上，将其放入55℃的恒温箱中烤片30分钟；同时将脱蜡液1缸一起放入55℃的恒温箱中；
  • （2）脱蜡至水：将石蜡切片连同切片架一起放入脱蜡液1缸中,再一起从恒温箱中取出置于常温，5分钟后，将切片取出浸入到常温脱蜡液2缸中，并按照脱蜡液2、脱蜡液3、无水乙醇1、无水乙醇2、无水乙醇3的顺序依次将石蜡切片放入缸中，每缸5分钟；用流水清洗切片5分钟。

注意：流水清洗时水流不能直接对着切片；操作过程中需一直保持切片处于湿润状态。

2．内源性过氧化物酶灭活：
  • 将切片完全浸入到3%双氧水溶液中，室温，孵育10分钟；完成后流水清洗5分钟。

注意：内源性酶含量高的组织，可以延长灭活时间至15-20分钟；双氧水需新鲜配制，可提前5-10分钟配制3%的双氧水。

3．抗原修复（可选）：
  • （1）方法一，微波热修复：将切片浸入盛有修复液的修复盒中，将抗原修复盒盖斜盖在修复盒上；整体放入微波炉中，高火加热3分钟后停火，微波炉内静置5分钟；再高火加热3分钟后停火，微波炉内静置5分钟；随后中低火加热1分钟后停火，微波炉内静置5分钟，然后将切片连同抗原修复盒拿出缓慢冷却至室温。待修复液温度降至室温后，用缓冲液PBS洗涤3次，每次1min。
  • （2）方法二，高压热修复：在高压锅中，加入抗原修复液，高火预热；待修复液沸腾后将切片置于其中，并完全浸泡组织，盖好锅盖，扣上压力阀，高火继续加热；待限压阀开始转动喷气后调至中火，同时开始计时2分钟；计时结束后离开热源，自然降压后将高压锅移入冷水中缓慢冷却。待修复液温度降至室温后，用缓冲液PBS洗涤3次，每次1min。

注意：修复液需完全浸没切片上组织；修复过程中严禁打开仪器或中断运行程序；修复完成后避免快速冷却；修复液可根据实验需求自行选用修复液。

  • （1）封闭：待修复液温度降至室温后，从修复盒中取出切片；用缓冲液PBS清洗切片2次，每次3分钟；去除切片上的缓冲液；在组织切片上滴加5%空白山羊血清封闭液；将切片水平放置在底部呈有水的孵育湿盒中，于37℃恒温孵育30分钟；
  • （2）一抗孵育：去除封闭液，在组织切片上滴加用缓冲液PBS稀释的一抗，水平放置于孵育湿盒中，于4℃孵育过夜；
  • （3）复温：将孵育湿盒取出室温复温15-30分钟，去除抗体工作液，用缓冲液PBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液PBS洗涤3次，每次5分钟；
  • （4）二抗孵育：在组织切片上滴加二抗工作液后水平放置于孵育湿盒中，于37℃恒温孵育1h；
  • （5）去除切片上的溶液，用缓冲液PBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液PBS洗涤3次，每次5分钟；
  • （6）显色：显色前5分钟，配置DAB显色工作液，C液:B液体积比1:100，充分混匀；在组织切片上滴加显色工作液，显微镜下密切观察颜色变化情况，通常10-60秒即可得到合适的染色强度；将切片浸入大量dH2O中即可终止显色；
  • （7）复染、返蓝：将切片浸入Mayer’s苏木素中复染切片，用流水清洗10分钟。

注意：染色过程中需一直保持切片处于湿润状态；染色过程中所有试剂使用过程中均需保证完全覆盖切片上组织。

  • （1）脱水：将清洗后的切片于无水乙醇中浸泡1次，10秒；高温（55℃-60℃）下完全干燥；
  • （2）封片：在切片中心滴加适量中性树胶，并加盖盖玻片。

来自于发表文献，仅供参考所用，ABclonal不承担任何责任。

暂无以FLII为关键词搜索的文献记录。

该服务由赛特新思提供，上述关联分析来自已发表文献，仅供参考所用，ABclonal不承担任何责任。

1. 转一张膜需准备 6 张 7.0～8.3 cm 的滤纸和 1 张 7.3～8.6 cm 的硝酸纤维素膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切好的硝酸纤维素膜置于水上浸 2 h 才可使用。

（1）用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水；

（2）个人感觉其实转膜之前浸湿一下就 ok 了，没有多大问题，可能按照上述操作结果会更好。

2. 在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。

3. 将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。在垫子上垫三层滤纸，一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。

（1）「用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡」，要领：一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。

（2）「在上面垫一张海绵垫」要领：可三张纸先叠在一起在垫于垫子上。个人感觉就垫 1 张滤纸也没问题。

4. 要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。

除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。

在膜上盖 3 张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。

（1）「要在两个边上轻轻的反复撬」要领：应该边撬边用流水缓缓冲洗

（2）「直到撬去玻板」要领：撬时一定要小心，胶很易裂，要用巧劲

（3）转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。

（4）最后做成的「三明治」千万不能形成短路，不然有可能会短路烧坏转膜装置（价格不菲，尤其是进口的），第一次做的应请老手指教。

5. 将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用 60 V 转移 2 h 或 40 V 转移 3 h。

（1） 实际上应该根据蛋白分子量的大小确定转膜时间，对于小分子量的蛋白，转膜时最好垫两块硝纤膜，以免转膜过头。

因为如果第一张膜上蛋白质已经转过了，第二张膜上还有蛋白质可以进行检测；对于大分子量的蛋白，转膜时电压要高一点，一般 80-100 V，时间也要延长一点，开始最好也用两块膜，特别是务必注意加强降温措施。当然转膜是要摸条件的，最好刚开始做的时候摸个转膜的时间梯度。如果由于时间原因来不及做下面实验，可以在 4 度下 12V 转膜过夜

（2） 硝纤膜建议使用 0.22 μm 的小孔径膜，不容易转膜过头；

（3） 不同的转膜装置，转移效率是不一样的，所以换用转膜装置，最好再摸个条件

（4） 转膜时电极方向注意是膜正胶负。

6. 转完后将膜用 1×丽春红染液染 5 min（于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。 将膜晾干备用。（一般不需要做这步）

我要回帖

更多关于 15Kd蛋白转膜转多久 的文章

 

随机推荐