【摘要】： 传统观点认为寄生虫与宿主间的相互关系表现为寄生虫对宿主的损害和宿主对寄生虫的抵抗，而宿主对寄生虫的抵抗主要表现为宿主的免疫应答可以杀灭宿主体内的部分寄生虫并限制寄生虫的再感染，与此同时，寄生虫则利用各种方式逃避宿主的免疫攻击。 然而，新近研究及流行病学资料显示，在宿主免疫功能低下时，血吸虫的发育或生殖力受限，提示宿主的免疫反应对血吸虫的影响可能不光局限于限制或杀灭，血吸虫对宿主的免疫攻击可能也不仅限于逃避，我们的假设是：在寄生虫与宿主长期共进化过程中，血吸虫为了生存，不仅设法逃避宿主的免疫攻击，而且还可能利用宿主免疫反应提供的某些效应分子(如细胞因子、抗体等)，促进自身的发育或生殖，即宿主的免疫应答可能有助于血吸虫的发育或生殖。但是，迄今为止，哪种类型的免疫应答或免疫反应中哪些因素及效应分子有利于血吸虫的生长和繁殖，还远不清楚。 研制有效的抗血吸虫疫苗是防治血吸虫病的根本途径，疫苗的研究工作已超过半个世纪，然而，迄今为止，该研究仍无实质性进展。由于目前对血吸虫感染免疫的认识是建立在传统观点之上的，而抗血吸虫疫苗研究的理论基础也是建立在免疫反应能杀灭虫体或限制其产卵能力之上的，完全没有考虑诱导的免疫应答是否会对血吸虫产生有利作用。因此，深入认识血吸虫感染的免疫对血吸虫生长、发育及生殖的影响对疫苗研究尤为重要，阐明影响血吸虫发育和繁殖的免疫应答类型或效应分子，将为在血吸虫疫苗研究中如何激活不利于血吸虫发育的因素而避免激活有利于血吸虫发的因素提供理论基础。 本研究通过观察日本血吸虫在不同免疫缺陷动物体内的发育、生殖及宿主肝脏虫卵肉芽肿的病理特点，探讨不同免疫因素对日本血吸虫发育、生殖及宿主虫卵肉芽肿形成的影响。 本论文包括如下三部分： 第一部分T细胞对日本血吸虫生长、发育、生殖及对虫卵肉芽肿形成的影响 第二部分信号转导与转录活化因子Stat4和Stat6对血吸虫生长、发育、生殖及对虫卵肉芽肿形成的影响 第三部分宿主细胞因子IL-12、IL-4对血吸虫生长、发育、生殖及对虫卵肉芽肿形成的影响 第一部分T细胞对日本血吸虫生长、发育、生殖及对虫卵肉芽肿形成的影响 裸鼠是由于染色体内裸体位点的等位基因(Nu基因)发生纯合而形成的突变小鼠。该小鼠由于先天性胸腺缺陷，导致其体内不能产生胸腺依赖淋巴细胞(T细胞)及其诱导的各类免疫反应。我们利用裸鼠此特性，研究宿主T细胞缺陷对日本血吸虫生长、发育、生殖及对宿主肝脏虫卵肉芽肿形成的影响。 材料与方法 正常BALB／c小鼠及相同遗传背景的裸鼠每只均感染日本血吸虫尾蚴25条。两组小鼠各分3小组，分别于感染后第28天、35天及42天剖杀小鼠，经门静脉灌注法收集虫体，计数总虫荷，然后于解剖显微镜下分别计数雌、雄虫荷，并观察虫体发育情况。所有虫体经10％福尔马林固定后，盐酸卡红酒精染色，并置于载玻片上用中性树胶封固。将封固虫体的玻片置于光学显微镜下等倍数码成像，并导入Image pro 5．0图像分析程序，测量并计算虫体的长度。镜下观察虫体，计数雌虫子宫内虫卵数。 门静脉灌注收集虫体后摘取小鼠肝脏，从肝右叶切取部分新鲜肝组织，置于10％福尔马林液中固定后，石蜡包埋、切片，HE染色，显微镜下组织病理学观察。选择切片中含单个虫卵的肉芽肿，利用Image pro 5．0图像分析系统，以虫卵内毛蚴为中心，测量肉芽肿直径。剩余肝组织经5％KOH溶液消化后，显微镜下计数虫卵，并计算肝组织中每对虫体平均产卵数。 所有数据均以(?)±s表示，用SPSS12．0进行统计学处理，两组间比较采用Student's双尾t检验。 结果 实验结果显示，两组小鼠体内总虫荷及雌雄虫配对数在感染后第28、35及42天均无差异，但感染后第28天，裸鼠体内雌虫及雄虫长度均明显低于正常BALB／c小鼠，且差异具极显著性(p＜0．01)。然而，至感染后第35天，该差异缩小至无显著性(p＞0．05)。至感染后第42天，两组小鼠体内虫体长度已趋于一致。 裸鼠肝组织中每对虫体平均产卵数在感染后各时间点均显著低于正常BALB／c小鼠(p＜0．05)。裸鼠体内雌虫子宫虫卵数在感染后第28、35及42天均略低于BALB／c小鼠，但差异均无显著性(p＞0．05)。BALB／c小鼠在感染后第28天雌虫子宫内均有虫卵产生，而裸鼠在感染后第28天有部分雌虫(28．5％)子宫内未见虫卵，至感染后第35天仍有个别雌虫(4．7％)子宫内不含虫卵，直至感染后第42天，所有被检测雌虫子宫内才均含有虫卵。 裸鼠肝脏虫卵肉芽肿平均直径明显小于BALB／c小鼠，且差异具极显著性(p＜0．01)感染后第42天，正常BALB／c小鼠肝脏可见典型虫卵肉芽肿形成，肉芽肿周围未见明显肝细胞坏死。裸鼠肝脏内肉芽肿较不典型，且浸润细胞显著减少，其中，以嗜酸性粒细胞减少最为明显。另外，裸鼠肝脏虫卵肉芽肿周围可见大面积肝细胞坏死。 结论 上述结果表明，宿主T细胞缺陷并不影响日本血吸虫在宿主体内的生存，且日本血吸虫仍可在宿主体内发育成熟并产卵。然而，T细胞缺陷时，虫体发育及产卵明显延迟，提示T细胞介导的免疫反应及某些相关特异性免疫因子的产生可能有利于血吸虫在宿主体内的移行或发育，但通过动态观察，首次发现宿主T细胞缺陷对日本血吸虫发育及产卵的影响是一过性的，主要作用于发育早期。 另外，虫卵肉芽肿的形成有赖于T细胞，T细胞对介导肉芽肿内嗜酸性粒细胞的浸润具有重要作用。 第二部分信号转导与转录活化因子Stat4和Stat6对血吸虫生长、发育、生殖及对虫卵肉芽肿形成的影响 近年来，大量研究报道感染血吸虫的宿主体内辅助性CD4~+辅助性T细胞(Thcell)的分化方向，即向Th1细胞或Th2细胞亚群的分化，对宿主的保护性免疫效应及虫卵肉芽肿的免疫病理反应具有重要影响。 Stat4和stat6分别为启动Th细胞向Th1细胞和Th2细胞亚群分化的重要信号转导分子。当Stat4缺乏时，刺激Th细胞向Th1细胞分化的信号途径被阻断，导致Th1型免疫反应缺陷，而stat6缺乏则导致Th2型免疫反应缺陷。 本研究利用Stat4基因敲除(Stat4~(-/-))小鼠和Star6基因敲除(Stat6~(-/-))小鼠，分别观察宿主Th1型免疫缺陷和Th2型免疫缺陷对日本血吸虫发育生殖及宿主虫卵肉芽肿形成的影响。 材料与方法 正常BALB／c J小鼠及相同遗传背景的Stat4~(-/-)、Stat6~(-/-)小鼠每只均感染日本血吸虫尾蚴25条。三组小鼠各分3小组，分别于感染后第28天、35天及42天剖杀小鼠，经门静脉灌注法收集虫体，计数总虫荷及雌、雄虫荷，并观察虫体发育情况。所有虫体卡红染色后，测量虫体的长度，计数雌虫子宫内虫卵数。门静脉灌注收集虫体后摘取小鼠肝脏，从肝右叶切取部分新鲜肝组织，置于10％福尔马林液中固定后，石蜡包埋、切片，HE染色，显微镜下病理组织学观察，测量切片中含单个虫卵的肉芽肿直径。剩余肝组织经5％KOH溶液消化后，显微镜下计数虫卵，并计算肝组织中每对虫体平均产卵数(检测方法同第一部分)。 所有数据均以(?)±s表示，用SPSS12．0进行统计学处理，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)。 结果 实验结果显示，Stat4~(-/-)和Stat6~(-/-)小鼠体内总虫荷及雌雄虫配对数在感染后第28、35及42天与BALB／c J小鼠相比均无差异。三组小鼠体内虫体长度在感染后各时间点亦均无差异(p＞0．05)。 J小鼠，至感染后第42天，该差异进一步增大但始终无显著性(p＞0．05)。各组雌虫子宫内虫卵数在感染后第28天无明显差异，至感染后第42天，Star4~(-/-)和Star6~(-/-)小鼠雌虫子宫内虫卵数略高于BALB／c J小鼠，但差异无显著性(p＞0．05)。该结果与各组小鼠肝组织内每对虫体产卵量的变化趋势一致。 此外，Stat4~(-/-)小鼠肝脏虫卵肉芽肿纤维化较对照组组更为明显，而Stat6~(-/-)小鼠肝脏虫卵肉芽肿较不典型，纤维化不明显。肉芽肿直径在各组间无明显差异(p＞0．05)。 结论 本研究发现Stat4~(-/-)和Stat6~(-/-)小鼠体内虫荷、虫体长度、肝组织中每对虫体平均产卵数及雌虫子宫内虫卵数与正常小鼠均无明显差异，表明单纯Th1型或Th2型免疫应答对日本血吸虫的生存、发育及生殖均无明显影响。Stat4缺陷促进虫卵肉芽肿纤维化，提示Th1型免疫应答对虫卵肉芽肿的纤维化有抑制作用。Stat6缺陷不利于虫卵肉芽肿的形成及纤维化，提示Th2型免疫应答对肉芽肿的形成及纤维化起关键作用。 第三部分宿主细胞因子IL-12、IL-4对血吸虫生长、发育、生殖及对虫卵肉芽肿形成的影响 研究报道，细胞因子的刺激对Th细胞的分化具有重要作用。初始CD4~+Th细胞的分化受IL-12和IL-4的双向调节。IL-12可促使初始Th细胞向Th1细胞分化，而IL-4可促使Th细胞向Th2细胞分化。血吸虫感染中有关细胞因子的调控作用是目前的研究热点。 关于细胞因子功能的研究传统方法是通过静脉注射抗细胞因子单克隆抗体来实现其中和作用。然而，观察血吸虫在终宿主体内发育及虫卵肉芽肿的形成需经历一个较长的过程，而抗体在宿主体内会逐步降解而不能持续发挥中和作用，将能分泌相应单克隆抗体的杂交瘤细胞直接接种于实验动物体内，则可保证单克隆抗体的持续分泌并有效的分布于血液及组织中。 本实验将抗IL-12和抗IL-4的杂交瘤细胞分别接种于小鼠背部皮下，通过杂交瘤细胞持续分泌的相应单克隆抗体中和小鼠体内的IL-12或IL-4，观察这些细胞因子缺陷对血吸虫生长、发育、生殖和对虫卵肉芽肿形成的影响。 材料与方法 将分泌抗小鼠IL-12的杂交瘤细胞(C 17．8)和分泌抗小鼠IL-4的杂交瘤细胞(11B11)经PBS混悬后定量注射于BALB／c小鼠背部皮下，共接种两次，两次之间间隔三周。小鼠分为如下3组： 1)抗IL-12组(小鼠接种抗IL-12杂交瘤细胞) 2)抗IL-4组(小鼠接种抗IL-4杂交瘤细胞) 3)对照组(小鼠注射等体积PBS) 每只小鼠于首次接种杂交瘤细胞后4～5天感染日本血吸虫尾蚴25条。于感染后第0、28及42天用双抗夹心ELISA法检测各组小鼠血清中IL-12和IL-4水平。于感染后第28天和第42天，剖杀小鼠收集虫体，计数总虫荷及雌雄虫配对数，对比各组小鼠体内虫体发育生殖状况及肝脏虫卵肉芽肿病理改变。所有虫体经盐酸卡红酒精染色，数码成像，并导入Image pro 5．0图像分析程序，测量并计算虫体的长度，以了解虫体发育情况；显微镜下计数雌虫子宫内虫卵数；门静脉灌注收集虫体后摘取小鼠肝脏，经消化后，计算肝组织中每对虫体平均产卵数；感染后第42天，观察小鼠肝组织病理学变化。 所有数据均以(?)±s表示，用SPSS12．0进行统计学处理，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)。 结果 接种抗IL-12或抗IL-4杂交瘤细胞的小鼠血清中均未检测到相应细胞因子。三组间虫荷在感染后第28天及42天均无显著性差异。然而，在感染后第28天，除了抗IL-12组外，抗IL-4组和对照组均可见少量幼虫。抗IL-12组体内虫体长度在感染后28天及42天均大于抗IL-4组和对照组，且差异具有显著性(p＜0．05)。而抗IL-4组和对照组之间虫体长度无明显差异。 抗IL-12组小鼠肝组织中每对虫体平均产卵数在感染后第28天显著高于抗IL-4组及对照组(p＜0．05)，然而至感染后第42天，该差异缩小且无显著性。 抗IL-12组雌虫子宫内虫卵数在感染后第28天明显高于对照组(p＜0．05)。抗IL-12组在感染后第28天所有雌虫子宫内均已含有虫卵，而抗IL-4组和对照组在该时间点均有少量雌虫(抗IL-4组：6．3％；对照组：14．3％)子宫内未见虫卵。 在感染后第42天，抗IL-12组小鼠肝脏虫卵肉芽肿直径明显大于对照组(p＜0．05)，而抗IL-4组虫卵肉芽肿较不典型，且直径略小于对照组，但差异无显著性(p＞0．05)。与对照组相比，抗IL-12组肉芽肿纤维化明显增强，而抗IL-4组较不明显。 结论 利用杂交瘤细胞皮下接种的方法能持续有效的中和小鼠血清中相应细胞因子。IL-12或IL-4缺陷小鼠体内虫荷与正常小鼠无显著性差异，提示细胞因子IL-12或IL-4对宿主体内血吸虫的存活无明显影响。然而，IL-12缺陷有利于血吸虫发育，提示IL-12对血吸虫发育可能有阻碍作用。IL-4对日本血吸虫的发育无明显作用。抗IL-12组产卵提前且感染早期产卵量较正常组高，然而随着感染时间的延长，其产卵量与正常小鼠无明显差异，提示IL-12对雌虫生殖的抑制作用可能是通过抑制其发育而实现的，此抑制作用是一过性的。抗IL-4处理可减弱虫卵诱导的肝组织纤维化，而抗IL-12处理则明显增强肝脏的纤维化，提示IL-4可促进肝脏虫卵肉芽肿的纤维化，而IL-12则对纤维化有抑制作用。 全文小结 综上3部分所述，本研究结论如下： 1．宿主T细胞缺陷时，同本血吸虫发育及产卵明显延迟，提示T细胞介导的免疫反应及某些相关特异性免疫因子的产生可能有利于血吸虫在宿主体内的移行或发育，且T细胞对虫卵肉芽肿的形成及肉芽肿内嗜酸性粒细胞的浸润具有重要作用。 通过动态观察，首次发现宿主T细胞缺陷对日本血吸虫发育及产卵的影响是一过性的，主要作用于发育早期。 2．利用Stat4~(-/-)和Stat6~(-/-)小鼠作为动物模型，首次证明单纯Th1型或Th2免疫应答对日本血吸虫生长、发育或生殖均无明显影响。Stat4缺陷促进虫卵肉芽肿纤维化的形成，提示Th1型免疫应答对虫卵肉芽肿的纤维化有抑制作用；Stat6缺陷不利于虫卵肉芽肿的形成，提示Th2型免疫应答对肉芽肿的形成及局限化起关键作用。 3．通过将杂交瘤细胞直接接种于小鼠皮下，以借助其持续分泌的单克隆抗体中和相关细胞因子，观察IL-12或IL-4缺陷对日本血吸虫发育、生殖及虫卵肉芽肿形成的影响。首次证实IL-12对血吸虫的发育、生殖及对肉芽肿的纤维化有抑制作用，其中对血吸虫的发育及生殖具的抑制作用是一过性的，而IL-4对日本血吸虫的发育无明显影响，但可促进肝脏虫卵肉芽肿的纤维化。 综合上述结果，我们认为宿主免疫应答类型及某些细胞因子与虫卵肉芽肿的发生、发展密切相关，而能影响血吸虫在宿主体内生长、发育或生殖的是某些细胞因子；鉴于单纯Th1型或Th2免疫应答对日本血吸虫生长、发育或生殖均无明显影响，因此我们推测细胞因子对血吸虫生长、发育或生殖的影响可能不是通过单纯T细胞应答类型而发挥作用的，细胞因子对血吸虫生长、发育或生殖影响的具体作用机制还有待进一步研究。