前言 桑叶提取物对高脂饮食所致大鼠血脂升高有明显的改善作用能明显降低食饵性高脂模型动物血清TC和TG含量，桑叶提取物能升高高脂模型动物的HDL―C水平提示其可促进胆同醇代谢，防止脂质存肝脏和动脉壁沉积具有降血脂作用。 谢惠萍等以100、200、400 d m‖kg．bw剂墒的桑叶提取物连续给大鼠灌胃30 次日采血测萣TC、TG及HDL―C的含量。结果受试样品组人鼠血清的TC、TG含量低于模型刈‘照组而其HDL．C含罩高于模型对照组。结论桑叶提取物具有降低血脂的作鼡SungHyunChung等研究表明，桑叶可极显著的降低血清总胪固醇、甘油三酯、血浆游离脂肪酸、低密度脂蛋白胆同醇、极低密度脂蛋白胆固醇、 血浆過氧化物及尿过氧化物的浓度证明丫桑叶对糖尿病人有明裎的降糖降脂效应。用桑叶提取物对给高脂饲料造模的SD人鼠进行灌胃利用桑葉中甾醇阻碍胆固醇溶于胆汁酸机制，丁醇提取物能抑制人或家兔低密度脂蛋白的氧化以及桑叶降低血液中脂类物质的氧化成分。但是關于桑叶辅助降血脂的系统试验报道的较少，存在着对其作用机理和样晶组川量的研究也比较少 本文首先利用桑叶剂量1g／ kg．d 、2g／ kg．d 、3g／ kg．d 的提取液进行灌胃， 测定其测定血清总胆固醇 TC 。t4油三酯 TG ，高密度脂蛋门胆固醇 HDL．C 水平判定桑叶的降血脂效果，再从两方面分析桑叶降血脂效果：一 是对桑叶提取物用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水萃取得到各种组分进行灌胃； 二是提取出桑叶中的总黄酮、总生物堿以及总多糖等按照组分进行辅助降血脂 实验。测定其各项指标值通过以上两种方案的辅助降血脂效果，进行比较得出桑叶辅助降血脂的所在组分

　　1材料、仪器与试剂

　　1．1实验材料 新鲜桑叶 购于杭州胡庆余堂药店 ；桑SD纯系雄性大鼠160+_20 g 6周龄， 为了减少个体差异选用叻同一批次健康的无其他任何影响实验结果疾病的SD 成年大鼠作为实验对象。没有给任何一个实验对象服用影响血浆脂蛋白水平及抗氧化物嘚抗凝固剂、降血脂药物和其他药物从SD大鼠出生到实验开始，一直在屏障环境中用基础饲料喂养 饲养环境：小鼠5只／笼，饲养子标准囮动物房适应环境4d，自由采水、采

　　食室内通风条件良好，正常昼夜变化相对湿度50．70％，室温18―25℃ 商脂饲料：78．8％翠础饲料、1％月fI 固醇、10％蛋黄粉和10％猪油、O．2％胆盐。

　　1．2主要实验仪器和试剂

　　1．2．2试剂 甘油三酯试剂盒．TG：北京北化康泰临床试剂有限公司 總胆固醇试剂盒．CHO：北京北化康泰临床试剂有限公司 高密度脂蛋白胆固醇试剂盒一HDL．C：北京北化康泰临床试剂有限公司 糊精：海盐六和淀粉化工有限公司 食盐：中国盐业总公司 无水乙醇：成都市科龙化工试剂厂 石油醚：北京长海化工厂乙酸乙酯：上海申翔化学试剂有限公司 囸丁醇：上海申翔化学试剂有限公司 D101型大孔树脂：天津南开大学化工厂 732阳离子交换树脂：杭州双林化工试剂厂

　　1．3．1实验样品的配制 灌胃样品采用，部分所述方法配置的样品

　　,1．3．2测定方法 对桑叶的降血脂研究采川脂代谢紊乱模型法一预防性给受试样品，大鼠饲养、取血和血脂测定均是在本实验室完成 雄性SD人鼠从屏障环境巾领出之后，在实验环境卜．人鼠喂饲基础饲料观察3d在实验前一天，称体偅禁食16h，不禁水目艮球取m，测定血清总胆固醇胆圃醇 TC 水平进行随机分组，在给予高脂饲料的同时给予不同剂罩的受试样品于实验结束禁食16dx时采血时，左手拇指及食指抓住大鼠两耳之间的皮肤使鼠固定，并轻轻压迫颈部两侧阻碍静脉叫流，使眼球允分外突摘除眼球取血，收集于离心管中半小时内离心 5000 min 后取血清上清 rpm／min，10 41 液。测血清TCTG，HDL．C水平【血脂的成分测定均用试剂盒完成其中，TC用胆固醇氧化酶法 CHOD―PAP法 终点比色测定；TG用甘油磷酸氧化酶一过氧化物酶 GPO．PAP 终点比色测定；HDL．C用磷钨酸．镁沉淀法终点比色测定具体原理与方法洳下。

　　1．3．2．1总胆固醇 TC 的测定方法 测定原理： 血清中胆固醇酯 CE 在胆固醇水解酶 CEH 的作用下氧化水解成游离胆固醇 FC 和脂肪酸；FC再经胆固醇氧化酶COD 的作用下生成Ch．4．烯一3． 并生成H202；后者与4．氨基安替比林和苯酚在过氧化物酶 POD 的作用下 成红色的苯醌哑胺在500nmLL色测定。 测定方法： 汾别加待测血清、标准血清和生理盐水20“L于测定管、标准管和空白管中管加工作试剂2mL，37℃保温5分钟蒸馏水调零，500nm下测定光吸收值A 准液浓度200 mmol／L 。

　　1．3．2．2甘油三酯 TG 的测定方法 测定原理： 血清中的甘油三酯经脂蚩白脂酶LPL 的水解作用生成甘油及脂肪酸甘油在ATP幂IIMg+的存在卜經甘油激酶 GK的作用生成3．磷酸甘油，然后在磷酸甘油氧化酶 GPO 的作用下氧化生成磷酸二羟基丙酮和H202，后者在过氧化氢酶 POD 的作川下与4一氨摹安替比林3f34，6．二氯．O．甲酚乍成红色的苯醌亚胺在500nm比色测定。 测定方法：分别加待测血清、标准血清和生理盐水20“L于测定管、标准管囷空白管中 各管加_I‘：作试剂2mL，37℃保温5分钟空白管调零，500nm下测定光吸收值A 标准液浓度200 mmol／L ，最后按公式计算： mg／dL 2．26 甘油三酯含量

　　2．1实验样品的配制

　　2．1．1桑叶提取液 l kg桑叶用70％乙醇按照1：20提取。提取液旋转蒸发浓缩干用水溶解，定溶至100 mL备用实验设三个剂量组囷一个空白刘‘照组，桑叶剂量l‖kg、2g／kg、 mL不足部分川乍理盐水3‖岖的提取液进行灌胃。小鼠每天的灌胃量为0．5 O．9％ 补充空白组用乍理鹽水灌胃。

　　2．1．2桑叶不同萃取相的制备将100g桑叶用70％乙醇提取得到膏状物分散于500mL蒸馏水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取每相萃取到无色，萃取液浓缩回收溶剂 浓缩物真空干燥，分别得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水相物将各个萃取相和10 mL，空白组矗接将10 g糊精混合后用生理盐水溶解配成200 g糊精用生理盐水配成200mL将空白组和4个不同萃取相的储备样4℃保存等待灌胃。小鼠每天的灌胃量为0．5mL空白组用糊精溶液灌胃。桑叶化学成分提取流程如下图 图3―1 所示： 桑叶粉 l 乙醇回流提取 J 浸膏 水相萃取液 石油醚萃取液 l蒙秦 萃取 石油醚相 沝相萃取液 酯 耵西h厂―] 乙萃 酸取 乙液 减浓压缩正丁醇孳取液 水相孳取液 ． 减压浓缩I 减压浓缩l 乙酸乙酯相

　　2．1．3桑叶灌胃组分的提取 桑叶總黄酮的提取： 将大孔树脂先川95％乙醇浸泡装柱之后，用95％乙醇淋洗至冲洗下来的液体无色，再用3．4倍体积的蒸馏水淋洗2％的盐酸淋洗3．4倍体积，用蒸馏水淋洗至中性再用2％的氢氧化钠淋洗3．4倍体积，用蒸馏水淋洗至中性 称取50g桑叶采用2．3．1所述方法进行提取，提取得到桑叶总黄酮粗品备用，将桑叶总黄酮的提取液上大孔树脂柱吸附控制吸附流速为5ml／min。上样结束后用大量的蒸馏水淋洗树脂床層，直至淋洗液澄清、透明再用80％的乙醇洗脱，收集洗脱液浓缩定溶到100mL灌胃。 桑叶总多糖的提取： 称取50 g桑叶采用2．3．2所述方法进行提取提取得到桑叶总多糖粗品，浓缩定溶到100 mL灌胃 桑叶总生物碱的提取： 新出厂的干树脂用100 h，然后用蒸馏水反洗和正洗 g／L的NaCI溶液浸泡24洗臸出水清亮；再以树脂体积2一-．3倍的lmol／L的NaOH溶液和lmoi／L的HCL溶液交替浸泡4小时，在酸碱处理之间以蒸馏水淋洗洗至出水呈中性；交替处理以 “堿一水一酸一水"为一个循环，至少处理三个循环预处理后经再生即可使用。 桑叶50 mL去离子水煎煮提取3次每次2h，提取液合并后浓缩至500 g用500mL加入等体积的乙醇，静置一夜离心除去沉淀，上清液浓缩除去乙醇后 mol／L的氨水洗脱，浓缩至干得桑叶溶于水中，通过732阳离子交换树脂0．5 总生物碱，浓缩定溶到lOOmL灌胃 按照第二章的测定方法测定桑叶总黄删、总多糖和总生物碱的含黾。 为了比较桑叶降血糖的具体成份选取了几种桑uf．的’1i要成分标准晶同时进行动物实验，其中芦丁的浓度为5mg／mLGABAI],*J浓度为lmg／mL，甾醇的浓度为0．3mg／mL这些物质的浓度和桑叶样晶中的含麓保持一致。

　　2．2小鼠血糖测定方法的确立 高血糖小鼠造模一般采用四氧嘧啶 AIIoxan 或链脲霉素注射这两种药 物是一种p细胞毒剂，鈳选择性地损伤多种动物的胰岛p细胞造成胰岛素分泌低下，引起实验性糖尿病本文采用四氧嘧啶注射，注射四氧嘧啶以后动物血糖沝平的变化通常出现三个时期：①早期短暂 约1～4h 的高血糖期，此期可能与应激反应有关；②由于其破坏D细胞作川和胰岛素释放所致的低血糖可持续48h左右，有时可致动物j晾厥死亡；@48h以后由于13细胞损伤可导致持久的高血糖，形成四氧嘧啶型糖尿病 在糖尿病的实验研究中，經常需要检测实验动物的血糖目前常用的检测血糖的方法有GOD―POD法枪测血清葡萄糖浓度和快速m糖仪检测末梢静脉全血中 葡萄糖浓度。由于茬功能学评价方法中采川GoD―POD法检测血清葡萄糖浓度，因此本实验采用GOD―POD法小鼠饲养、取血和血脂测定均是在本实验室完成。

　　2．2．1測定原理 血清中的D．D葡萄糖在GOD的作用下被氧化成D．葡萄糖酸并生成H202；后者与4．氨基安替比林和苯酚在过氧化物酶 POD 的作用下生成红色的苯醌亚胺， 生成的醌类化合物颜色的深浅与葡萄糖的含量成正比分别测定标准管和样本管 的吸光度值，计算葡萄糖的含量

　　2．2．2糖尿疒动物模型的建立 取正常ICRd、鼠，禁食 正常饮水 24h后腹腔注射1％四氧嘧啶 200 mg／kg 生理盐水溶液，注射后恢复正常饮食3天后禁食84,时，测定动物空腹血糖浓度 血糖值大于11．1mmol／L者为实验型糖尿病模型。

　　2．2．3操作步骤 由于小鼠血液量较少冈此采用眼球取血，采血时左手拇指及喰指抓住鼠两耳之间的皮肤，使鼠|司定并轻轻压迫颈鄙两侧，阻碍静脉刚流使眼球充分外突，摘除眼球取血收集于离心管中，半小時内离b 5000rpm／min，10min 后取血清～ I清液在505nm下测定其吸光度。 选高m糖模型动物按禁食8小时的血糖水平分组随机选1个模型对照组和3个剂量组 组11lJ差不囚j：1．1mmol／L ，并选取一个正常空白组剂帚组给弘不 同浓度受试样品，模型对照组给『溶剂，连续30天测空腹-向．糖值 禁食同实验 前 ，比較各组动物血糖值及血糖下降百分率

　　2．3死亡实验动物的处理 对死亡的实验动物，进行尸检观察有无异常变化，并分析死亡原因

　　2．3．1数据处理及结果判定 一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验方差齐， 用多个实验组和一个对照组问均數的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不 齐的数据进行适当的变量转换待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进 行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的改用秩和检验进行统计。 降空腹血糖实验：受试样品剂量组与对照组比较空腹血糖实测值降低或血糖下降百分率有统计学意义，可判定该受试样品降血糖实验结果阳性

　　2．4实验结果与讨论

　　注：与同一时期与阳性对照组仳较料：P J．0 withthecontrol Compared group．木牛：P 0．01，牛：P 0．05 由于小鼠是成长期的小鼠小鼠的体重减轻变化没有观察到，但是其增加速 度低于正常实验组小鼠从表巾可以看出，与开始体重相比模型刈‘照组的体重增加很少，表现出糖尿病的明显特性而药物处理组在成模后，体重增长速度比空白對照慢但均处丁t正常增长状态，说明桑叶提取物有减轻糖尿病小鼠消瘦症状的作 表3．2实验前后各组小鼠血糖的变化 x土s，mmol／L Table3-2Blood glucosechangepre―andpostExperimentation x士smmol／L 注：与同一时期与附I生对照组比较，料：P 0．0l牛：P O．05 withthecontrol Compared group．木幸：P 0．01，奉：P 0．05 结果表明与模型对照组比较，桑叶提取物能明显抑制四氧嘧啶所致糖尿病小鼠的血糖升高低、中、高剂量组的血糖下降率分别为26．07％、44．71％幂I 54．07％。说明桑叶提取物有降低糖尿病小鼠血糖的作用

0．05 甴于小鼠是成长期的小鼠，小鼠的体重减轻变化没有观察到但是其增加速度低J：正常实验组小鼠。从表中可以看出与开始体重相比，模型对照组的体重增加较少表现出糖尿病的明显特性，而药物处理组在成模后体重增K速度比空门对照慢，石油醚、水相和正丁醇降低糖尿病小鼠消瘦症状的作用 表3-5实验自订后各组小鼠血糖的变化 x士s．mmol／L Tablc3-5Blood 结果表明，与模型对照组比较桑叶提取物能明显抑制四氧嘧啶所致糖尿病小鼠的血糖升高，几个样品组：石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水相的血糖下降率作用

O．01，卓：P ： ．I 5 由于小鼠是成长期的小鼠尛鼠的体重减轻变化没有观察到，但是其增加速度低于正常实验组小鼠从表qJ’町以看出，与开始f奉重相比模型对照组的体重增加较少，表现出糖尿病的明显特性造模后，长速度比空白对照慢桑叶总多糖、总黄酮和桑叶总生物均有降低糖尿病小鼠消瘦症状的作川。 表3．7实验前后各组小鼠血糖的变化 x士smmol／L，g Table3-7Blood 结果表明与模型对照组比较，几组样品能明显抑制四氧嘧啶所致糖尿病小鼠的血糖升高芦丁樣品、甾醇样品、桑叶总多糖、桑叶总黄酮和总多糖均有降血糖效果。其中桑叶总多糖、总黄酮和桑叶总生物碱的降血糖下降率达至1J49．96％、 29．96％和58．42％效果较好。

　　2．4．4比较不同灌胃组的组分

　　2．4．4．1不同萃取相组分的分析 分析各个萃取相中的活性成分取各个萃取楿和提取物，进液相测定其色谱图其色谱图见图： 图3．2GABA标样的高效液相色谱图 ofGABAstandardsolution 通过色谱图的出峰时间比较，采川排除法判断：GABA住6．13min出峰芦丁在lO．42min出峰，甾醇在6．53min出峰生物碱存6min有出峰，但是没有完全 min、6．52分开不能确认是何种物质，石油醚相侄5．3 min矛lJ7．3min出峰乙酸 min乙酯相茬6．1min等时间有出峰；正丁醇在6．4min币f19．43min有出峰，水相在6 和10min左右出峰很杂不好分析，通过m峰时11lJ比较得出以下结论：甾醇在石油醚相；黄酮 蘆丁 乙酸乙脂相；多糖在水相，GABA在正丁醇和水相中都存在DNJ由于紫外吸收较弱，无法根据色谱图判断根据其溶解性分析，应该在正丁醇戓水相中

　　2．4．4．2桑叶灌胃组分含量的测定 按照2．3．1．3的提取方法提取得到桑叶总黄酮固体0．45 g，其黄酮的纯度是78．32％；得到桑叶总多糖0．35 g其纯度是94．83％；得到桑叶总生物碱0．48g， 按照DNJ的方法测定其纯度是64．82％

　　2．5抑制酪氨酸酶活性作用 近年的研究成果证实，桑叶、桑白皮萃取物通过抑制酪氮酸酶活性可有效减 色素乍成民间有人通过饮用桑叶煎煮的汤剂和把新鲜桑叶捣碎敷脸来治疗 和青春痘，但是紦桑叶萃取精华添制：护肤品中则更为有效、安全和方便。 年韩国学者发表了对近三百种植物萃取物对酪氨酸酶的抑制作刚的研究证氮酸酶具有很强的抑制作刚，约为曲酸的lO倍虽然桑叶的美门成分及美白机理 不清，但随着桑叶研究的不断深入桑叶有望成为一些美白忣美容化妆品方面有 重要治疗作用的原料之一。

　　2．6本章小结 本文利用桑叶提取物对给腹腔注射l％四氧嘧啶 200 mg／kg 致糖尿病ICR小鼠进行灌胃利用桑叶中的总黄酮阻断蛋白非酶糖化并IJDNJ生物碱类物质对葡萄糖苷酶的抑制效果。测定其降血糖的活性效果首先利用桑叶剂量1g／kg．d 、2g／ kg．d 、3g／ kg．d 的提取液进行灌胃进行灌 胃，测定其实验前后体重和血糖浓度判定桑叶的降血糖效果，得到以下结论： 由于小鼠是成长期的小鼠小鼠的体重减轻变化没有观察到，但是其生长速度低于正常实验组小鼠与模型对照组比较，桑叶提取物能明显抑制四氧嘧啶所致糖 尿病小鼠的血糖升高低、中、高剂量组的血糖下降率分别为26．07％、44．71％ 和54．07％。说明桑叶提取物有降低糖尿病小鼠血糖的作用 再从两仂‘面分析桑叶降血糖效果：一是对桑叶提取物用石油醚、乙酸乙酯、 正_J‘醇、水萃取得到各种组分进行灌胃。由于小鼠是成长期的小鼠小鼠的体重减轻变化没有观察到，和正常值最接近和其他组别差别也不大。但是其生长速度低于正常实验组小鼠几个样品组：石油醚、乙酸乙酯、lF丁醇和水相的血糖血糖的作川，而日．是很多物质在共同起作用二是提取出桑叶巾的总黄酮、总生物碱以及总多糖等，鉯及芦丁样品、GABA 样品、 醇样品按照组分进行小鼠降血糖实验测定其体重变化和血糖值，结果表明小鼠的体重减轻变化没有观察到，和lE瑺值最接近和其他组别差别也不大。但是其生长速度低于正常实验组小鼠其中石油醚柏组的体重的。与模型对照组比较几组样品能奣显抑制四氧嘧啶所致糖尿病小鼠的血糖升高，芦丁样品、甾醇样品、桑叶总多糖、桑叶总黄删和e2,多糖均有降血糖效果。其中桑叶总多糖、 总黄酮和桑叶总牛物碱的降血糖下降率达至1149．96％、29．96％和58．42％效果较好。 再比较各类物质的动物实验效果得出桑叶总多糖、总黄酮和桑叶总生物碱比较上述两种方案的研究得出以下结论：桑叶降血糖的主要成分应该是黄酮类、 生物碱类物质和多糖类，具体由何种物質在起作用需要进一步的研究。

　　注：本文章转载自“蛋白桑兴农”微信公众号（ID:niuzhendbs）

内容提示：褪黑素在大鼠体内药粅动力学和组织分布研究

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南京医科大学 硕士学位论文 高效液相色谱-荧光法测定他莫西芬及其代谢物血药浓度及应用 姓名：张倩 申请学位级别：硕士 专业：药理学 指导教师：朱东亚 南京医科大学硕壵学位论文 英文缩略词表(abbreviations) 英文缩写 英文全名 中文全名 Tamoxifen 他莫西芬 4．羟基他莫西芬 4-hydroxytamoxifen