线栓法制备MCAO模型大鼠的经验体会
The Experience of the Preparation of Rat Model of MCAO with Suture-occluded Method
线栓法制备大鼠局灶性脑缺血模型具有不开颅、损伤小、重复性高等优点,是制备该模型最常用的方法,但目前仍存在很多因素的制约,如技术要求高、模型成功率和存活率较低、术后差异较大等,这些都是亟待解决的问题.笔者从实验动物的选择、术前禁食与否、麻醉剂的选择、线栓制备、手术操作、护理及并发症7个方面对模型制备进行探讨,以期能为各位同仁提供参考.
湖南中医药大学,湖南长沙,410208
年，卷(期)
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&&8:00-11:30,13:00-17:00(工作日)大鼠线栓法大脑中动脉闭塞模型改进的实验研究--《苏州大学》2011年硕士论文
大鼠线栓法大脑中动脉闭塞模型改进的实验研究
【摘要】：背景与目的
缺血性脑血管病(Ischemic Cerebral Vesscular Disease,ICVD)是神经科常见病多发病,在ICVD的治疗中重建血流或增强缺血区的血流供应是缺血脑组织修复损伤的必需条件,但同时带来的再灌注损伤也是目前最受关注的问题。线栓法大鼠大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型能最大程度模拟人类缺血性卒中发生,被广泛用于实验性脑缺血再灌注(Ischemia-reperfusion ,IR)损伤的研究。国内外大量实验证实,MK-801(dizocilpine)在实验性脑缺血模型中具有重要的神经保护作用。
本实验用周龄和性别匹配的SD大鼠成功建立了MCAO动物模型,对原有线栓法大脑中动脉闭塞模型进行了改进,并用MK-801预处理进一步验证动物模型,为研究脑缺血再灌注损伤的发病机理和研制治疗药物打下基础。
50只雄性SD大鼠随机分为3组,IR组、p-MCAO(permanent MCAO)组及假手术组(10只)。IR组(n=22)分为2个亚组,IR治疗组(12只)及IR模型组(10只)。p-MCAO组(n=18)也分为2个亚组,p-MCAO治疗组(10只)及p-MCAO模型组(8只)。两治疗组将药物MK-801(0.5mg/Kg,溶于二甲基亚砜:0.9%生理盐水,体积比为1:39的混合溶液中)于脑缺血15分钟前经颈外动脉给药。假手术组、两模型组大鼠仅给予等容量溶剂。手术组以线栓法制备MCAO模型,假手术组接受相同手术流程,但不插入线栓。手术后分别对各组大鼠做神经功能缺损评分,随后取各大鼠大脑冠状位切片行TTC染色以测量脑梗死及水肿体积,冰冻切片焦油紫染色观察大鼠大脑皮层区细胞损伤程度,酶联免疫吸附法测定脑中肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量。
1.各手术组大鼠出现严重的神经功能障碍,假手术组大鼠则无任何临床症状。且神经行为学评分显示IR治疗组大鼠神经功能明显优于IR模型组。
2.切片TTC、焦油紫染色各手术组大鼠脑组织见明显脑梗死灶,假手术组大鼠无此改变。IR治疗组脑梗塞体积较IR模型组明显减小。
3.对大鼠脑组织生化指标检测发现,手术组大鼠的TNF-α的表达明显增加。与IR模型组相比,IR治疗组大鼠TNF-α的含量有所降低(P0.01)。
1.本实验建立的大鼠模型在临床表现、病理变化等方面符合MCAO模型的表现,模型稳定、可靠,是研究脑缺血再灌注损伤的理想动物模型。
2. MK-801能改善脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能障碍,减轻缺血区的脑梗死,并减少炎症因子TNF-α的产生,具有明显的改善脑缺血再灌注损伤的作用。
【关键词】：
【学位授予单位】：苏州大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2011【分类号】：R743;R-332【目录】：
中文摘要4-6Abstract6-9引言9-14 参考文献12-14前言14-15材料与方法15-19 一、实验材料15-16 二、实验方法16-19实验结果19-25 一、大鼠局灶性脑缺血再灌注后的神经功能缺损评分19 二、MK-801 对大鼠脑血流(cerebral blood flower,CBF)的影响19-20 三、ELISA 检测脑组织 TNF-α含量20-21 四、焦油紫染色病理形态学观察21-22 五、TTC 染色结果22-25讨论25-31结论31-32参考文献32-35综述35-45 参考文献42-45中英文缩略词汇表45-46攻读学位期间公开发表的论文46-47致谢47-48
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京公网安备75号线拴法建立小鼠局灶性脑缺血再灌注模型的经验总结　
□ 臧志萍 曹晓岚 李义召
　　摘要：目的
建立小鼠局灶性脑缺血再灌注模型，并总结经验教训。方法
从颈外动脉插入栓塞线至颈内动脉，选择性栓塞大脑中动脉，造成大脑中动脉闭塞的动物模型。通过控制再灌注时间，观察其对小鼠神经行为学、脑缺血程度及存活期的影响。结果
除假手术组未制成脑缺血模型外，其他3组均于手术后24h出现神经行为学异常，脑切片TTC染色可见缺血病灶。结论
小鼠局灶性脑缺血再灌注模型制造成功，小鼠术后的成活率、梗死体积、神经行为学表现与手术方法密切相关。
　　关键词：小鼠；大脑中动脉闭塞；动物模型；线拴法
　　中图分类号：R743．3l R255．2
　　文献标识码：A
　　文章编号：(11―03
　　在临床缺血性脑血管病中，最为常见的是火脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)引起的，因此在动物实验中也较常采用大脑中动脉闭塞的动物模型。由于大鼠的脑血管分布与人类相似，并且易存活、抵抗力强，同时便于进行动物智能测试及电生理检查，因而目前MCAO模型大都以大鼠为主。而小鼠因为其体积小、操作困难，尽管动物成本低廉，仍然使其应用受到限制。但随着医疗设备、实验器材以及技术水平的提高，已经克服了上述困难，加上转基因小鼠的日益应用，使得小鼠局灶性脑缺血／再灌注模型被广泛采用。本实验根据国外制作小鼠MCAO模型的先进经验和国内现有报道，将实验操作方法及所得经验教训简述如下，以便同行交流。
　　1材料与方法
　　1．1材料的准备　健康6周龄雄性昆明小鼠(购自山东大学西校区动物中心)40只，体重(22～25)g。2，3，5一氯化三苯基四氮唑(triphenyl tetrazoliu chloride，TTC，上海国药集团生化公司生产)，MOTIC手术显微镜(SMZ系列)，显微手术剪刀，系结镊子，开睑器(均为六六视觉公司生产)。栓塞用线：使用蓝色6－0号单纤丝尼龙线，剪成长2cm的线段，用酒精灯将两端烧成圆球形以备用。
　　1．2实验方法
　　1．2．1动物分组　40只小鼠随机分为4组，即永久闭塞组、缺血0．5 h再灌注24h组、缺血1h再灌注24h组、假手术组，每组10只。
　　1．2．2模型制作　用10％的水合氯醛(350 mg／kg)将小鼠腹腔麻醉，仰卧位固定于手术台上，保持呼吸通畅。用酒精棉球擦拭颈部，在颈正中切口，钝性分离下颌下腺，显微镜下游离左侧颈总动脉，使用微血管夹夹闭。游离左侧颈外动脉，用6―0号丝线结扎其远端，在左颈总动脉分叉至前一颈外动脉结扎线之间打一松结，游离左颈内动脉并用微血管夹夹闭。用显微眼科手术剪刀在两结扎线之间剪一小口，将栓塞线向下插入至颈总动脉处，将松结扎紧，在颈外动脉远端结扎处下方、栓塞线插入的上方剪断左颈外动脉，撤离颈内动脉处的微血管夹，并使栓塞线插入端在左颈总动脉分叉处。将颈外动脉拉向外下方，使其与颈内动脉处于同一直线。将栓塞线向颈内动脉方向插入1cm左右，直至感受到阻力，为防止出血将6―0丝线扎紧。永久闭塞组此时即可将颈总动脉处微血管夹撤离，缝皮；缺血0．5h再灌注24 h组、缺血1 h再灌注24 h组即是在缺血0．5h和1h后将栓塞线和左颈总动脉处微血管夹撤出，保持动脉流畅24h。假手术组不插入栓塞线，剪断左颈外动脉后，左颈总动脉夹闭1h后撤血管夹，缝皮。术后将小鼠置于放有清洁垫料的饲养盒中，室温保持在(25～28)℃自由饮水、进食。
　　1．2．3神经行为学评分　术后24h，采用5 min对小鼠的神经功能缺损进行评分。0分：无神经缺损症状；1分：右前肢不能完全伸直；2分：向右旋转；3分：行走向右侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。1分～4分为有效动物缺血模型。
　　1．2．4脑梗死体积的计算　术后24 h断头取脑，迅速置－20℃冷冻箱中冷冻20 min后取出，在操作台上迅速由前向后行厚2．0mm的冠状切片，将切片立即置于质量分数为1％的TTC磷酸盐缓冲液中，避光37℃恒温孵育30 min。用数码相机按顺序拍摄染色后的脑片，用计算机软件(NIH Image 1．54)计算每一脑片缺血区的面积(SIN)以及双侧大脑面积(SN)，按公式A＝XSIN／XSN×100％计算脑梗死区占整个大脑体积的百分比。
　　1．3统计学处理　采用SPSS统计软件进行数据统计，计量资料采用t检验、配对t检验等方法；计数资料采用r2检验；等级资料采用Ridit分析。
　　2．1神经行为学评分(见表1)观察术后小鼠表现，经统计分析，除假手术组无明显的缺血行为表现外，其他3组均表现出神经行为学异常，为有效动物缺血模型。但经观察，缺血后再灌注的两组神经行为学改变更明显，缺血0．5h再灌注24h组比缺血1h再灌注24h组的症状出现晚。永久闭塞组的症状较缺血再灌注组出现得早，症状却轻些，存活时间长。分析可能是缺血后再灌注损伤使小鼠症状加重。假手术组偶有出现偏瘫症状者，可能与小鼠个体解剖差异有关。
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