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中药早期干预对急性心肌梗死患者心功能的影响
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中药治疗急性心肌梗死后焦虑症80例临床疗效观察
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中药治疗急性心肌梗死后焦虑症80例临床疗效观察
官方公共微信&&&&&&&&&&&&&&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&&&&&&&&&&&&&&&
: &&&&DOI: 10.3969/j.issn.15.36.007
骨髓干细胞 bone marrow stem cells
不同治法中药干预心肌梗死边缘区归巢骨髓间充质干细胞的增殖与分化
张金生1，张宝霞2，张阳阳1，朱慧芳1
1河南中医学院第三附属医院，河南省郑州市& 450000； 2河南中医学院第一附属医院，河南省郑州市& 450008
Interventional effects of different Chinese medicine therapies on proliferation and differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells homing to the border zone of myocardial infarction&
Zhang Jin-sheng1, Zhang Bao-xia2, Zhang Yang-yang1, Zhu Hui-fang1
1Third Affiliated Hospital of Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, Henan Province, C 2First Affiliated Hospital of Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450008, Henan Province, China
参考文献(9)
干细胞生物学方面的一些研究成果为心肌细胞的再生治疗提供了希望，但值得注意的是骨髓间充质干细胞通过血行&归巢&到心肌梗死区后，在活体动物中分化为功能性的心肌细胞数量较少，达不到替换坏死心肌细胞、实现心肌自我修复的治疗作用[1-2]，因此，通过某些特定的条件刺激骨髓间充质干细胞的增殖潜能，提高直接分化为功能性心肌细胞数量，补充缺失的心肌细胞，有效地抑制心肌成纤维细胞过度增殖，是心血管疾病再生治疗的新方法和思路。近年来，中医药介入干细胞研究已取得显著进展，课题组前期研究表明，活血化瘀方药通过动员骨髓中的干细胞增殖，并&驱使&干细胞从骨髓池进入循环池，致循环池中的干细胞数量增加，基于此，本实验拟进一步采用不同治法中药干预&归巢&到心肌梗死区骨髓间充质干细胞的增殖分化，探讨中医药调控干细胞增殖分化机制。
1.1&设计&细胞学体外观察实验。
1.2&时间及地点&实验于2010年12月至2013年12月在河南中医学院动物实验中心完成。
1.3.1&实验动物&健康SD大鼠350只，雌雄各半，3月龄，体质量280-300 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK(京)，SPF级，饲养于河南中医学院动物实验中心。
1.3.2&实验药品&①血塞通软胶囊(主要成分：三七总皂苷)，每粒0.33 g，批号：国药准字Z、昆明制药集团股份有限公司。②黄芪颗粒(黄芪全成分提取)，每袋15 g(有糖)，批号：国药准字Z，四川百利药业有限责任公司。③诺迪康胶囊(主要成分：红景天苷)，每粒0.28 g；批号：国药准字Z，四川诺迪康药业股份有限公司。④重组人粒细胞集落刺激因子注射液(G-CSF)，批号：国药准字S，山东科兴生物制品有限公司。
不同中药干预骨髓间充质干细胞增殖与分化实验所用主要试剂与仪器：
试剂和仪器&
Rat anti-Mousei-CD54/ICAM-1、Rat anti-Mouse CD106(VCAM-1)
Becton,Dickinson and Company
Anti-Ki-67、cTnT(心肌特异性肌钙蛋白T抗体)、Anti-CD117(干细胞生长因子受体)、Anti-GATA-4(抗GATA结合蛋白4抗体)、CD105免疫组化试剂盒、Anti-Vimentin(波形蛋白抗体)等
Bioss Biological Technology Co.
小动物呼吸机(型号 TKR-200C)
江西特力麻醉呼吸设备公司
CH20BIMF200光学显微镜
日本OLYMPUS光学有限公司
SSC-DC18P彩色病理图象分析系统
日本Sony公司
电热恒温水浴锅
上海跃进医疗器械厂
&1.4&实验方法
1.4.1&采用Olivette等[3]方法建立急性心肌梗死模型&取&成年雄性SD大鼠350只，麻醉后，将大鼠仰卧位固定在手术台上，行气管插管术和机械通气，开胸暴露心脏，以丝线环绕冠状动脉左前降支，稳定1 min后结扎左冠状动脉前降支。术后注射青霉素4&104 U/d，连用3 d预防感染。
1.4.2&造模成功的标准 &结扎后可见左室前壁搏动减弱，心电监测可见肢体导联R波振幅显著升高，随后I、aVL导联ST段抬高，证实急性心肌梗死制模成功。
1.4.3&动物分组与给药方法 &术后24 h存活的大鼠随机分为活血组、益气组、益气活血组、模型组，各组再按术后24 h，72 h，7 d，14 d，28 d等时点分为亚组，取材时保证每亚组仍有8只存活大鼠，以未造模的正常大鼠为正常组。根据预实验结果结合《药理实验方法学》所示体表面积剂量换算法计算给药量[4]，活血组给予80 g/L血塞通软胶囊、益气组给予0.5 g/mL黄芪颗粒、益气活血组给予&& 70 g/L诺迪康胶囊灌胃，大鼠按每100 g体质量灌胃1 mL药液；模型组和正常组按每100 g体质量给予生理盐水&&& 1 mL，直到处死大鼠停止。
1.5&主要观察指标&免疫组化法检测不同时间点大鼠心肌梗死边缘区CD105、C-kit、Ki-67、cTnT、GATA-4、Vimentin的表达情况，按照说明书操作。采用BI-2000图像分析系统观察每个视野阳性细胞个数，每张切片取4个不重复视野，为避免计数重复，不计算血管内的阳性细胞，每只动物取3张切片获得一个平均值代表阳性细胞数。
1.6&统计学分析&用SPSS20.0统计软件包对相关数据进行处理。所有数据以x(_)&s表示，采用配对t 检验，两变量之间的关系采用直线相关分析。
目前干细胞治疗心肌梗死的主要作用：①直接分化为心肌细胞，补充缺失的心肌细胞以提高局部室壁运动能力，改善心脏功能。②通过干细胞的旁分泌作用，分泌如血管内皮生长因子、基质细胞衍生因子1、血小板源性生长因子及血管生成素等趋化和生长因子，促进新生血管生成，加强损伤心肌细胞修复，并通过抑制成纤维细胞增殖及胶原合成，限制炎症反应，减轻心肌重构和重塑的发生。③增强原位心脏干细胞的增殖、动员、分化、生存和功能，促进干细胞生存微环境的恢复。④抑制炎症反应，缓解免疫系统对自身的攻击和炎症反应对周边组织的侵扰，延缓心肌梗死后心室重构[5-6]。研究显示，锌指转录因子4(GATA4)是重要的心肌发育转录调控因子。GATA4直接或间接地在心肌梗死修复中扮演着重要的调节作用，它可以促进血管生成，增加细胞存活和分化，而转染了GATA4真核表达质粒的骨髓间充质干细胞，不仅能促进骨髓间充质干细胞释放生长因子，还促进毛细血管样结构的形成。干细胞向心肌细胞的终末分化首先表达心肌特异性结构蛋白，进而出现心肌结构蛋白的集聚，产生规则的肌小节结构，因此，cTnT作为鉴定心肌分化的重要指标之一，cTnT表达意味着分化的心肌样细胞具有收缩的结构基础，这对确定细胞的分化和成熟阶段有重要作用。波形蛋白(Vimentin)与成纤维细胞中细胞骨架与功能相适应，通过Vimentin可以研究局部成纤维细胞由于各种损伤及病理刺激转变为成肌纤维细胞，成肌纤维细胞通过细胞增殖及表达Ⅰ型和Ⅲ型胶原而参与纤维化的发生、发展过程[7-9]。Ki-67抗原是一种存在于增殖细胞核基质内的抗原，在细胞周期中除G0及G1早期外，ki-67均有表达，尤以M期最高，因此，Ki-67是一种与细胞周期相关的蛋白质，可直接敏感地反应细胞的增殖活性与生长方式，是应用最广泛的增殖细胞标记物之一。
课题研究发现：Ki-67标记细胞增加明显高于CD105或CD117，提示Ki-67标记细胞可能一部分来自心脏原位干细胞，一部分来源骨髓间充质干细胞，但即使那些c-kit+心肌干细胞也有可能从CD105+干细胞分化而来，进一步说明干细胞归巢在心肌梗死后被募集到心肌损伤区，参与损伤心肌再生和修复。另对比各组Ki-67与CD105、CD117和cTnT、GATA-4染色结果，发现他们虽然并不完全平行，但增长趋势大致一致，显示干细胞动员、归巢、分化机制的统一性。另研究显示：模型组CD105、CD117、cTnT、GATA-4、Ki-67、Vimentin的表达明显高于正常组，说明心肌梗死后机体自我动员干细胞修复机制，成纤维细胞即向纤维细胞开始转化，但各个指标的表达先逐渐增多，其后下降，说明干细胞的分化能力会受时间的限制，且成纤维细胞向纤维细胞的进程受到机体自我限制和调控。而活血组、益气活血组、益气组各时间点梗死周边CD105、CD117、cTnT、GATA-4、Ki-67阳性细胞数比模型组增多明显，而Vimentin阳性细胞数比模型组减少，中药对骨髓间充质干细胞促增殖及分化效果显著，且对缺血区肌纤维化程度较同期模型组明显减轻，活血组优于益气活血组、益气组，表明虽然不同治则方药均可促进干细胞归巢到梗死边缘区，但3者中活血化瘀方药效果明显。另外活血组Vimentin阳性细胞数少于益气活血组、益气组，但3者中活血化瘀方药最少明显，说明这与活血化瘀药可以抗心肌缺血、缺氧和扩张冠脉，祛瘀生新，抗凋亡，促进血管新生等效用有关，进一步表明活血化瘀药通过调控CD105和CD117抑制成纤维细胞增殖，延缓成纤维细胞向纤维细胞的进程，延缓了心室的重塑。
近年来，干细胞治疗急性心肌梗死的基础研究已显示出巨大的潜力，相关临床试验也已取得重要进展。骨髓间充质干细胞不仅可向多种细胞分化，还可广泛迁移，即&干细胞循环&，通过机体的调控迁移到新的组织位点，并不断进行自我更新和分化，在生理或病理情况下参与多种组织的更新和修复，维持机体组织形态完整性和功能稳定性。但干细胞临床治疗急性心肌梗死还存在两个关键问题：一是干细胞迁移到梗死区数量少，二是迁移后的干细胞分化和生存率低。最新研究显示，干细胞心肌移植治疗后细胞24h死亡率＞50%，14d后梗死区移植细胞数量仅占移植总量的3%；经冠脉内移植干细胞的归巢率仅 1%-6%，移植骨髓单个核细胞群后只有 1%-2%的细胞滞留于目标心肌，大部分细胞分布于肝、脾等组织，而经静脉移植时只有极少量归巢到受损心肌。分析造成上述问题主要原因有：①体内骨髓间充质干细胞归巢数量减少。②间充质干细胞对缺血心肌发出归巢信号反应力不敏感。③各种障碍导致干细胞在外周血迁移速度降低和跨越血管归巢损伤部位的干细胞归巢数量不足。④梗死区微环境恶劣，如局部病理炎性反应、冠脉循环-神经体液异常激活、缺血再灌注损伤及局部机械压力等，导致间充质干细胞的分化率和生存率存活低。因此，采取恰当策略促使足够数量骨髓间充质干细胞归巢到心肌梗死区并分化有功能心肌细胞，改善梗死后心肌微环境和提高骨髓间充质干细胞在恶劣环境的生存耐受力是目前中西医界关注焦点。
研究亮点: 1 在检测急性心肌梗死大鼠模型不同时点梗死区Ki-67+与C-kit+细胞数变化的同时，又检测CD105、心肌特异性蛋白 MHC、cTnT 和 GATA- 4、Vimentin不同时点的细胞数变化，从多角度探索影响骨髓间充质干细胞归巢后向心肌样细胞分化的情况。
2 明确了益气法、益气活血法与活血化瘀法在动员骨髓间充质干细胞&归巢&、促进骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化、防治心肌梗死后心肌重塑的差异性，明确了活血化瘀方药效果最明显，指出了活血化瘀方药动员骨髓间充质干细胞治疗心肌梗死是可行的。
3 研究还表明活血化瘀方药可以促进骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化，但向心肌样细胞分化的比例极低，对心肌梗死后心肌重塑的影响作用不明显，可能不是防治心肌梗死后心肌重塑的主要作用机制。
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2.1&实验动物数量分析&共有350只大鼠，造模过程中以及术后有感染及其他原因脱落的大鼠，最后进入结果分析时保证每亚组仍有8只存活大鼠。
2.2&不同时间点梗死边缘区CD105表达的变化&CD105标记细胞镜下表现为棕黄色或棕褐色颗粒，不同时间点梗死边缘区CD105阳性细胞数见表1，图1。
2.3&不同时间点梗死边缘区C-kit的表达变化&C-kit阳性细胞镜下呈黄褐色，主要表达在梗死边缘区，梗死区表达较低。不同时间点梗死边缘区C-kit阳性细胞数见表2，图2。
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2.4&不同时间点梗死边缘区Ki-67的表达变化&Ki-67标记细胞镜下呈棕黄色或棕褐色颗粒。不同时间点梗死边缘区Ki-67阳性细胞数见表3，图3。
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2.5&不同时间点梗死边缘区cTnT的表达变化&cTnT标记细胞镜下呈棕黄色或棕褐色颗粒。不同时间点梗死边缘区cTnT阳性细胞数见表4，图4。
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2.6&不同时间点梗死边缘区GATA-4的表达变化 &GATA-4标记细胞镜下呈棕黄色或棕褐色颗粒。不同时间点梗死边缘区GATA-4阳性细胞数见表5，图5。
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2.7&不同时间点梗死边缘区Vimentin的表达变化 &Vimentin标记细胞镜下呈棕黄色或棕褐色颗粒。不同时间点梗死边缘区Vimentin阳性细胞数见表6，图6
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