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[求助]fluo-3测钙,激光共聚焦标本
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请问，我用fluo-3标记细胞内的钙离子，想请问以下几个问题：
1.fluo-3标记后，是显什么颜色的荧光啊？分布在哪个位置呢?
2.激光共聚焦检测时，是用贴壁细胞还是先将细胞消化离心后用荧光剂孵化啊？
3.我是用24孔板培养细胞及添加药物，那每孔需要加多少fluo-3啊？
谢谢查看完整版本请点击这里：
dragonkilly ( 19:13:10)
那个，fluo-3需要无菌吗？
utt0989 ( 19:13:43)
绿色荧光，整个细胞都会呈绿色；
贴壁细胞和细胞悬液都可以，但最好是用贴壁细胞做；
实验前先将flou-3am 配成1mg/mL，用来孵化时使flou-3am 的浓度达到10mg/L
我也是刚开始做这类实验，我QQ，大家交流下，一起探讨探讨
dragonkilly ( 19:14:06)
好像我试了下，悬浮的效果好一些吧？
utt0989 ( 19:14:29)
我做出来也是悬浮的效果比较好，但是在观察的时候细胞会漂，进行药物刺激的时候，甚至会出现细胞漂出视野的情况，所以还必须得贴壁，我现在在摸索那种贴壁方法好一点
baidukk ( 19:15:05)
请问，我用fluo-3标记细胞内的钙离子，想请问以下几个问题：
1.fluo-3标记后，是显什么颜色的荧光啊？分布在哪个位置呢?
2.激光共聚焦检测时，是用贴壁细胞还是先将细胞消化离心后用荧光剂孵化啊？
3.我是用24孔板培养细胞及添加药物，那每孔需要加多少fluo-3啊？
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1.fluo-3染的是胞浆钙离子浓度，因此应该全细胞呈现荧光。共聚焦激发波长488nm，发射波长525nm（？不确定），呈绿色荧光；
2、既然是激光共聚焦，贴壁细胞还是比较靠谱点吧，如果是悬浮的话，最好用流式做（没做过）；
3、若用激光共聚焦检测的话，由于光的折射的问题，一个很大的问题就是与显微镜镜头接触（因为一般是油镜下观察）的透明介质的厚度必须非常薄。因此，用孔板或者培养皿直接在共聚焦显微镜下检测是检测不到的。2种解决办法：一是传代细胞之前就在孔板中央放置一个消毒后的盖玻片，细胞在盖玻片上贴壁之后方可进行染色以及进一步的检测。检测时应有一个专门的固定盖玻片的装置（我们实验室有一个，不锈钢的，巨贵），将盖玻片固定好后观察。此方法颇为繁琐，且成功率不高。第二个方法就是直接将细胞传代至专门用于活细胞共聚焦检测的培养皿中，这种培养皿直径35mm，底部贴有一个盖玻片。进口的比较贵，7个美刀一个，但可复用，盖玻片的质量也很好，不发愁贴壁问题；国产的（好像南京有个厂家生产）虽然便宜，5元左右一个，但质量真的很难恭维，显微镜下观察盖玻片上的划痕很多，而且出现细胞污染、不贴壁的情况也时常发生，还不能复用（泡在酒精中时粘贴盖玻片的胶就会溶解，盖玻片脱落）。
终浓度大约7个μmol/L即可。建议先把市售的fluo-3以dmso预溶解至1mM做为储备液，分装-20°C保存，使用时以含钙的Hank‘s平衡盐溶液稀释至7μmol/L即可。若用专用培养皿的话，只需在皿中央的小孔中滴入100μl左右的工作液即可。
good luck！
dragonkilly ( 19:15:27)
使用时以含钙的Hank‘s平衡盐溶液稀释至7μmol/L即可？？
请问，用HBSS稀释可以吗？我做的具体步骤是这样的，请各位看看，给予指点，谢谢
细胞贴壁后，PBS洗两遍，24孔板，然后加入配好的fluo-3/AM，200ul(我是用HBSS稀释的，浓度大概在4umol/L,可能浓度低了点，下次改正),37度避光30分钟，请问这样就可以了吗？还是需要别的步骤？
utt0989 ( 19:15:48)
用HBSS应该也可以，HBSS,Tyrode,Hanks的成分都比较像,我在文献上也看到过有人用HBSS；
你应该还少了一步在室温下孵化，我把我的步骤写上来你参考下，做出来的荧光效果一般情况下都比较好。
钙敏探针孵育：
贴壁细胞用台氏液(Tyrode)清洗2次；
37℃下，用 Fluo-3 AM（10mg/L，实验前先将flou-3am 配成1mg/mL）避光孵育细胞30min；
细胞用Tyrode液清洗2次，在室温下再放置30min，使细胞完全负载上Fluo 3。
dragonkilly ( 19:16:08)
我做的结果，就是能看到荧光，但有很多细胞没染上，是不是还是步骤有问题啊？
dragonkilly ( 19:16:25)
还有，请问如果细胞爬片，然后制片，这个制片的过程和普通组织制片的过程一样吗？有什么需要特别注意的地方？谢谢！
fklo83 ( 19:16:54)
请问你们的fluo-3，am都是在哪家公司买的啊 规格和价钱怎么样？
我现在急着买 但不知道在哪儿买 找了一家碧云天的 他们有20ul包装的 卖469元 这算贵还是便宜啊？
还有他的产品说明上面说&本Fluo-3 AM (钙离子荧光探针) 是配制于无水DMSO (anhydrous DMSO)中的储存液，浓度为5mM'意思是不是说买回来就直接用d-hanks液稀释就可以了啊？
wsll ( 19:17:12)
请问，用含有钙的Hanks液配置Fluo-3 AM，对试验结果有影响么！是不是尽量避免外源性的钙离子比较好啊？虽然知道Fluo-3 AM是在细胞内被酶分解为Fluo-3而激发显色，但是还是不敢确定.请高手解答！谢谢
kulee ( 19:17:38)
请问你们的fluo-3，am都是在哪家公司买的啊 规格和价钱怎么样？
我现在急着买 但不知道在哪儿买 找了一家碧云天的 他们有20ul包装的 卖469元 这算贵还是便宜啊？
还有他的产品说明上面说&本Fluo-3 AM (钙离子荧光探针) 是配制于无水DMSO (anhydrous DMSO)中的储存液，浓度为5mM'意思是不是说买回来就直接用d-hanks液稀释就可以了啊？
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他们应该是分装Invitrogen公司的。
价格还可以吧。
第三问，是的。
kulee ( 19:18:16)
请问，用含有钙的Hanks液配置Fluo-3 AM，对试验结果有影响么！是不是尽量避免外源性的钙离子比较好啊？虽然知道Fluo-3 AM是在细胞内被酶分解为Fluo-3而激发显色，但是还是不敢确定.请高手解答！谢谢
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用无钙的平衡盐溶液才会有影响，因为生理性的细胞外钙是细胞内钙的10^3-4倍，若人为造成细胞外无钙环境，细胞内钙有可能通过钠钙交换蛋白等途径释放到细胞外。
当然，有一种确定细胞内钙具体浓度的方法，需要用不同钙离子浓度的细胞外缓冲液来分别测量，之后有一公式计算。但具体我没做过，你可以查查文献，有这方面的报道的。
dragonkilly ( 19:18:35)
不会吧，无钙的才会有影响？晕，我买的HBSS，是无钙的吖，不能用吗？
哦，那个fluo-3,我是在鼎国买的，50ug,200多
dragonkilly ( 19:18:59)
D-hanks稀释，不也就是无钙的吗？
kulee ( 19:19:41)
不会吧，无钙的才会有影响？晕，我买的HBSS，是无钙的吖，不能用吗？
哦，那个fluo-3,我是在鼎国买的，50ug,200多
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可以用。自己加氯化钙就行。市售的HBSS肯定是无钙的，因为如果加钙的话有可能形成碳酸钙沉淀。因此钙都是后加的。
我们的方法:事先配制100倍的氯化钙（0.13M）,100ml水中加入1.44g。使用时以无钙的HBSS稀释100倍即可（如，100mlHBSS中加入1ml的100×氯化钙溶液），氯化钙的终浓度是1.3mM。
kulee ( 19:20:08)
D-hanks稀释，不也就是无钙的吗？
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染料的稀释应该问题不大。最关键的是活细胞检测时外环境的钙离子浓度。如果无钙会有影响。
当然最好也是以含钙的HBSS稀释。
D-hanks和HBSS成分好像还是不太一样。可以自己查一下。
HBSS就是hank’s 平衡盐溶液的简称。
gemei0115 ( 19:20:34)
你好，我想问一下，用碧云天的fluo-3am做的效果怎么样，可靠吗？
dragonkilly ( 19:21:02)
碧云天的我没用过，不清楚吖
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