中祥灵芝菌丝体胶囊保健功能/成分原料/适宜人群-上海中祥生物制品有限公司
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中祥灵芝菌丝体胶囊
中祥灵芝菌丝体胶囊生产企业:上海中祥生物制品有限公司,功效主治和保健功能:免疫调节、改善睡眠,适宜人群:免疫力低下者、睡眠状况不佳者。,主要成分原料:、、、。,中祥灵芝菌丝体胶囊批准文号查询:卫食健字(2000)第0234号
中祥菌丝体胶囊
申请人中文名称
上海中祥生物制品有限公司
申请人地址
上海市沪闵路6200号
免疫调节、改善睡眠
功效成分/标志性成分含量
每1g含：多糖≥22mg、三萜类≥4.8%、多肽类≥12%。
免疫力低下者、睡眠状况不佳者。
不适宜人群
少年儿童。
食用方法及食用量
口服，每日2-3次，每次2-4粒。
阴凉干燥处储藏
1、少数人服用后有轻度、便溏、头晕，数天后会动消失；2、本品不能代替药物。
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卫食健字(2000)第0234号
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药品名称：
&金氏康虫草菌丝体灵芝粉
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批准文号：
& 卫食健字（1998）第340号
药品生产单位：
& 山东东阿古胶公司
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金氏康虫草菌丝体灵芝粉 药品详细说明：
金氏康虫草菌丝体灵芝粉
【批准文号】：国食健:卫食健字（1998）第340号 &&&
【卖　　点】：
【剂　　型】：冲剂 &&&
【产品功效】：肿瘤患者，蓝盒放疗期用 &&&
【成　　分】：　 &&&
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【规　　格】：10袋/盒 &&&
【包　　装】：100盒/件，两盒配一手提袋　 &&&
【生产单位】：山东东阿古胶公司 &&&
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&&&&最新医药招商药品钙调磷脂酶信号对灵芝菌丝体液体发酵生产抗癌次级代谢物灵芝酸的影响--《上海交通大学》2013年博士论文
钙调磷脂酶信号对灵芝菌丝体液体发酵生产抗癌次级代谢物灵芝酸的影响
【摘要】：蘑菇作为一类高等真菌，能有效生产萜类、杂环化合物、聚酮化合物、甾醇等多种独特的生物活性物质。药用蘑菇灵芝是中国传统名贵中草药，其三萜类次级代谢物灵芝酸具有抗肿瘤、抗转移和抗HIV等多种重要的药理活性。但是，灵芝酸的含量和产量较低，需要通过现代生物工程技术来进一步提高，以满足大规模临床试验和商业应用的需求。
近年来，信号转导工程作为一种提高高附加值次级代谢产物的方法，受到了广泛的关注。在一些子囊菌中，钙调磷脂酶信号参与次级代谢物的合成，但在高等真菌的另一分支担子菌中却未见报道。至今，有关钙调磷脂酶信号是否能够调节三萜合成及其调节机制均不清楚，所以，更不用说，在灵芝的发酵过程中，钙感应蛋白和灵芝酸合成基因对于钙调磷脂酶信号是如何响应。但是，这些信息对于提高发酵产量等应用将具有重要的意义。
在本学位论文工作中，首先采用比较转录组分析的方法来研究振荡加静置的两阶段培养优于传统的全程振荡培养的分子机制。通过建立差减杂交文库，找到了在两阶段培养和全程振荡培养中差异表达的基因。通过对差减杂交文库中1920个cDNA进行分析，观察到147个unigenes在两阶段培养中上调。其中，与钙信号有关的钙调素、钙通道和钙库操纵性钙内流通道在两阶段培养中上调，暗示钙信号对于灵芝酸生物合成调控可能起着重要作用。因此，在以下的工作中，我们在两阶段培养中探索了钙信号对于灵芝酸合成的影响及其作用机理。
首先，发现在静置培养开始时加入钙离子或钠离子或锰离子是提高灵芝酸产量的有效策略。钙离子、钠离子或锰离子的最优浓度分别为10mM，100mM和10mM。它们的总的粗灵芝酸产量（由分光光度法测定）最高分别达到1.58g/L，1.32g/L和0.96g/L，比未添加的对照样品分别提高了4.03，3.38和2.45倍。单体灵芝酸T，灵芝酸S和灵芝酸Me（由高压液相色谱分析）在添加10mM钙离子时达到最高，而灵芝酸Mk（由高压液相色谱分析）在添加100mM钠离子时达到最高。灵芝酸Mk，灵芝酸T，灵芝酸S和灵芝酸Me的最高产量分别为274.15±9.1mg/L，327.8±13.5mg/L，122.1±8.4mg/L和153.6±6.5mg/L，比未添加时分别提高了3.54，5.50，3.67和4.55倍。这是至今这些灵芝酸单体所报道的最高产量。
据文献报道，在钠离子或锰离子或锂离子的较高盐浓度的压力下，胞内钙离子会迸发、进而促发钙信号来调节拟南芥中脱叶酸的生物合成。在本研究中，在加入钙离子、钠离子或锰离子的条件下，检测了发酵过程中灵芝细胞的钙离子流、钠离子流或锰离子流。当在培养基中加入钙离子，胞内钙离子水平显著提高，在第4天达到最高，而同时胞外钙离子浓度显著下降，在第4天降到最低，这暗示在高浓度的钙离子条件下，培养基中的钙离子在发酵初期内流，但在第4天以后，胞内的钙离子又逐渐流出到培养基中。当在培养基中加入钠离子或锰离子，观察到类似的胞内钠离子或锰离子的上升以及胞外钠离子或锰离子的下降的现象。而且，我们发现胞内钠离子或锰离子浓度的提升会导致培养基中的钙离子内流，暗示它们可能是通过促发钙信号来调节灵芝酸生物合成的。
为了研究钙信号提高灵芝酸产量的分子机制，我们用钙调磷脂酶抑制剂（环孢霉素A）来研究钙调磷脂酶信号是如何调控灵芝酸生物合成的。在钙离子、钠离子或锰离子诱导下，实验发现孢子数、总的粗灵芝酸以及4种灵芝酸单体的含量均有提高，而在加入环孢霉素A的条件下，均有下降，并且在回补钙离子、钠离子或锰离子的条件下，环孢霉素A对孢子数、总灵芝酸和4种灵芝酸单体的抑制作用又有所一定程度被解除。这些实验结果表明钙离子、钠离子或锰离子可能是通过钙调磷脂酶信号来调节灵芝酸生物合成。为了进一步揭示胞内钙离子、钙调磷脂酶信号和灵芝酸生物合成之间的关系，我们用荧光法检测了胞内钙离子。添加钙离子、钠离子或锰离子的细胞发出了强烈的绿色荧光，这表明胞内的钙离子浓度很高。然而在添加环孢霉素A的细胞中，我们发现荧光强度显著降低，但在回补钙离子、钠离子或锰离子的细胞中，观察到荧光强度又有所加强。以上事实显示在钙离子、钠离子或锰离子诱导下，胞内钙离子的水平获得提升，钙调磷脂酶信号参与了其调节。
为了进一步研究钙调磷脂酶信号调控灵芝酸生物合成的机制，在整个灵芝菌丝体发酵过程中检测了钙交换蛋白、钙感应蛋白和灵芝酸合成基因的转录水平。为了阐述钠离子或锰离子与钙调磷脂酶信号之间的关系，检测了钠钙交换蛋白（ENA1和ATPase）和锰钙交换蛋白（PMR1）的基因转录水平。结果表明钠离子诱导提高了ena1和Ca~(2+)-ATPase的转录水平，锰离子诱导提高了pmr1的转录水平，但在加抑制剂的条件下，它们的转录水平都下调。这些数据表明在较高浓度的钠离子或锰离子浓度下，这些交换蛋白起到维持离子平衡，进而激活信号途径的作用。在添加钙离子、钠离子或锰离子的条件下，我们发现灵芝酸合成和钙感应蛋白基因的转录水平均有提高，而在添加抑制剂的时候，这些基因均下调。这与灵芝酸积累的规律变化相一致。以上结果表明，钙离子、钠离子或锰离子可能是通过上调这些基因的转录水平来提高灵芝酸产量的。
由于灵芝酸合成基因的转录水平对于灵芝酸生物合成产量的重要作用，我们在以下的工作中尝试高表达灵芝酸合成基因。但是，众所周知，对蘑菇真菌（包括灵芝）的基因改造至今仍是一个难题。因此，我们首先在灵芝中建立了农杆菌介导（ATMT）的基因转化平台。在此基础上，通过高表达3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR）基因，成功地使灵芝酸含量提高了约2倍。同时，中间代谢产物鲨烯和羊毛甾醇的含量也得到提高，下游合成途径中的法呢烯合酶、鲨烯合酶和羊毛甾醇合酶基因也得到上调。以上结果表明，通过转基因的方法改造灵芝酸的代谢途径具有良好应用前景的。
综上所述，本学位论文首先用差减杂交的方法在两阶段培养体系中发现了100多个上调的基因，其中暗示钙信号对于灵芝酸生物合成调节的重要性。接下来在静置培养中通过添加钙离子、钠离子或锰离子，显著提高了灵芝酸的产量。通过检测胞内钙离子以及添加钙调磷脂酶抑制剂（环孢霉素A）实验，发现了添加钙离子、钠离子或锰离子会使培养基中的钙离子内流并促发钙调磷脂酶信号。之后又进一步在分子水平上研究钙调磷脂酶信号对灵芝酸合成的作用机理。本研究不仅提出了通过添加钙离子、钠离子或锰离子来高效生产灵芝酸的简便策略，而且还揭示了钙离子、钠离子或锰离子通过钙调磷脂酶信号来调控灵芝酸生物合成的机制。另外，通过开发基因转化系统并将能被钙调磷脂酶信号诱导的一个灵芝酸合成基因（hmgr）进行高表达，显著提高了总灵芝酸的含量。本文所提出的思路和策略有助于抗癌活性化合物灵芝酸以及其他蘑菇类次级代谢物的高效发酵生产。
【关键词】：
【学位授予单位】：上海交通大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2013【分类号】：S567.31【目录】：
摘要3-8ABSTRACT8-18第一章 绪论 (Chapter 1. Introduction)18-28 1.1 高等药用真菌 (Medicinal higher fungi)18 1.2 灵芝及其活性成分 (Ganoderma lucidum and its bioactive components)18-21
1.2.1 灵芝 (Ganoderma lucidum)18-19
1.2.2 灵芝的活性成分 (Bioactive components of G. lucidum)19
1.2.3 灵芝酸及其药理活性 (Ganoderic acid (GA) and its pharmacological activities)19-21 1.3 灵芝酸的发酵生产及其研究进展 (GA fermentation and research progress)21-23 1.4 灵芝酸的生物合成途径 (GA biosynthetic pathway)23-24 1.5 钙信号对细胞生长和代谢的影响 (Effects of Ca~(2+)signals on cell growth and metabolism)24-25 1.6 高等药用真菌及灵芝的基因转化体系 (Gene transformation system of mushrooms and G. lucidum)25-26 1.7 代谢工程在改造萜类生物合成中的应用 (Improvement of terpenoids biosynthesis by metabolic engineering)26 1.8 本文的立题目的与意义 (Aim and significance of this thesis work)26-27 1.9 本文的主要研究内容 (Main research work of this thesis)27-28第二章 液体振荡和静置培养方式下灵芝酸积累比较及差异表达基因的鉴定(Chapter 2. Comparison of GA accumulation and identification of differentially expressed genes in liquid static culture vs. shaking culture of G. lucidum)28-45 2.1 前言 (Introduction)28-29 2.2 实验材料与方法 (Materials and methods)29-37
2.2.1 菌种 (Strain)29
2.2.2 试剂与仪器 (Reagents and instrument)29-30
2.2.3 灵芝培养 (Cultivation of G. lucidum)30-31
2.2.4 分析方法 (Analytical methods)31-33
2.2.5 总 RNA 的提取 (Total RNA extraction)33-34
2.2.6 反转录 (Reverse transcription)34-35
2.2.7 基因表达的 qRT-PCR 检测 (Detection of gene transcription by qRT-PCR)35-36
2.2.8 差减杂交文库的建立 (Construction of SSH library)36-37
2.2.9 阳性克隆的测序与生物信息学分析 (Sequencing and bioinformatic analysis of postive colonies)37
2.2.10 数据分析 (Data analysis)37 2.3 实验结果与讨论 (Results and discussion)37-44
2.3.1 液体振荡和静置培养条件下灵芝菌丝体的形态 (Observation of cell morphology under liquid shaking culture and static culture)37-39
2.3.2 液体振荡和静置培养条件下灵芝细胞生长和灵芝酸合成的动态变化 (Kinetic profiles of cell growth and GA accumulation under liquid shaking culture and static culture)39
2.3.3 液体振荡和静置培养条件下灵芝酸生物合成基因转录水平的动态变化(Kinetic profiles of the transcriptional levels of GA biosynthetic genes under liquid shaking culture and static culture)39-43
2.3.4 液体振荡和静置培养条件下差异表达基因的筛选与鉴定 (Screening and identification of differentially expressed genes under liquid shaking culture and static culture)43-44 2.4 小结 (Conclusion)44-45第三章 金属离子对灵芝酸生产的影响 (Chapter 3. Effects of metal ions on GA production)45-60 3.1 前言 (Introduction)45 3.2 实验材料与方法 (Materials and methods)45-46
3.2.1 试剂与仪器 (Reagents and equipment)45-46
3.2.2 灵芝菌丝体培养 (Cultivation of G. lucidum)46
3.2.3 分析方法 (Analytic methods)46
3.2.4 胞内外金属离子含量的测定 (Determination of extracellular and intracellular concentrations of metal ions)46 3.3 实验结果与讨论 (Results and discussion)46-59
3.3.1 添加不同浓度的各种金属离子对细胞生长和灵芝酸产量的影响 (Effects of different metal ions in medium on cell growth and GA production)46-50
3.3.2 不同时间点添加各种金属离子对细胞生长和灵芝酸产量的影响 (Effects of addition time of different metal ions on cell growth and GA production)50-53
3.3.3 金属离子添加对胞内外相应离子的浓度及胞内外钙离子浓度的影响(Effects of metal ions addition on the intracellular and extracellular concentrations of corresponding metal ion as well as the intracellular and extracellular Ca~(2+)concentration)53-57
3.3.4 钙离子、钠离子和锰离子组合添加对灵芝酸产量的影响 (Effects of combined addition of Ca~(2+), Na+and Mn~(2+)on GA productions)57-59 3.4 小结 (Conclusion)59-60第四章 钙调磷脂酶信号对灵芝酸生物合成的影响 (Chapter. 4 Imapcts ofcalcineurin signals on GA biosynthesis)60-81 4.1 前言 (Introduction)60 4.2 实验材料与方法 (Materials and methods)60-64
4.2.1 试剂与仪器 (Reagents and equipment)60-61
4.2.2 灵芝培养 (Cultivation of G. lucidum)61
4.2.3 分析方法 (Analytic methods)61
4.2.4 钙调磷脂酶信号抑制剂添加对灵芝酸合成的影响 (Effects of calcineruin signal inhibitors on GA biosynthesis)61
4.2.5 Fluo-3/AM 法检测胞内钙离子 (Measurement of intracellular Ca~(2+) levels by Fluo-3/AM)61
4.2.6 孢子取样和孢子计数 (Spore sampling and counting)61-62
4.2.7 总 RNA 提取 (Total RNA extraction)62
4.2.8 反转录 (Reverse transcription)62
4.2.9 灵芝钙调磷脂酶信号途径 cam，cna 和 crz1 基因片段的克隆 (Gene cloning of cam, cna and crz1 in calcineurin signaling pathway of G. lucidum)62-63
4.2.10 基因表达的 qRT-PCR 检测 (Detection of gene transcription by qRT-PCR)63-64 4.3 实验结果与讨论 (Results and discussion)64-80
4.3.1 钙调磷脂酶信号对灵芝细胞生长、孢子数和灵芝酸合成的影响 (Effects of calcineurin signals on cell growth, spore number and GA biosynthesis)64-67
4.3.2 钙调磷脂酶信号对胞内钙离子的影响 (Effects of calcineurin signals on the levels of intracellular Ca~(2+))67-69
4.3.3 CaM，Cna 和 Crz1 基因片段的克隆与分析 (Gene cloning and sequence analysis of cam, cna and crz1)69-73
4.3.4 钙调磷脂酶信号对钙交换体、钙感应蛋白和灵芝酸生物合成基因的转录水平的影响 (Effects of calcineurin signals on the gene transcriptional levels of Ca~(2+)exchangers, Ca~(2+)sensors and GA biosynthesis)73-80 4.4 小结 (Conclusion)80-81第五章 高表达灵芝 HMGR 基因对灵芝酸生物合成的影响 (Chapter 5Effects of overexpressing hmgr gene on GA accumulation by G. lucidum)81-93 5.1 前言 (Introduction)81-82 5.2 实验材料与方法 (Materials and methods)82-86
5.2.1 试剂与仪器 (Reagents and equipment)82
5.2.2 菌种和质粒 (Strains and plasmids)82
5.2.3 HMGR 高表达质粒 pJW-HMGR 的构建与转化 (Construction and transformation of HMGR overexpressing plasmid pJW-HMGR)82-84
5.2.4 转化子的 PCR 和 Southern blot 验证 (Identification of transformants by PCR and Southern blot)84
5.2.5 灵芝菌丝体培养 (Mycelia cultivation of G. lucidum)84
5.2.6 分析方法 (Analytic methods)84-86 5.3 实验结果与讨论 (Results and discussion)86-92
5.3.1 HMGR 基因高表达的灵芝工程菌株的获得与鉴定 (Identification of HMGR overexpressed strains)86-88
5.3.2 高表达 HMGR 基因对灵芝酸和中间代谢物积累的影响 (Effects of overexpression of HMGR gene on the accumulations of GA and intermediates)88-91
5.3.3 高表达 HMGR 基因对灵芝酸合成基因转录水平的影响 (Effects of overexpression of HMGR gene on the transcriptional levels of the GA biosynthetic genes)91-92 5.4 小结 (Conclusion)92-93第六章 结论与展望 (Chapter 6. Conclusions and perspectives)93-96 6.1 全文结论 (Conclusions)93-94 6.2 本文的特色与创新点 (Highlights)94 6.3 展望 (Perspectives)94-96参考文献(References)96-107附录 (Appendix)107-130攻读博士学位期间发表的论文(Publication List)130-132致谢132-134
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富硒?灵芝菌丝体营养冲剂
品名：富硒?灵芝菌丝体营养冲剂配料：灵芝菌丝体粉 有机硒 菜芙蓉花等营养成分：灵芝多糖 三萜类 灵芝腺苷 多肽 有机硒 单体生物异黄酮、全价蛋白质、高聚糖胶、膳食纤维、微量元素硒、锌、多种不皂化物等含量：每5克含“灵芝多糖” ≥1000mg 灵芝酸100≥mg 生物黄铜30≥mg&&有机硒≥20μg等生物活性物质规格：(5gx20袋x6盒)/套用法：每次5g，一日3次。取一袋放入杯中，用开水冲调，搅拌即可。 生产许可证：QS &&&&&&&& 执行标准：Q/JXHK001S 保质期：常温下24月&&&&&&& 产地：浙江 嘉兴
有机硒的主要作用： &&&&<FONT style="COLOR: #73年世界卫生组织宣布，硒是人体必需的微量元素。我国有72%的县（市）低硒或缺硒。硒是谷胱甘肽氧化酶的必需组成成分，即没有硒存在这个酶就没有活力，人体就会患各种疾病。硒具有提高人体的免疫力、清除自由基、保护视神经、保护心脏和肝脏、防止体内产生毒性物质等重要功能，人类的克山病、肝病、盆血、冠心病、大骨节病、糖尿病、癌症等四十多种疾病与缺硒密切相关。我公司研发生产的富硒灵芝菌丝体营养冲剂，运用现代生物技术，将优质野生灵芝纯种在液体发酵时，添加适量的微量元素硒，硒与灵芝菌丝体蛋白相结合，形成有机硒蛋白，更有利于人体消化吸收。一般人体每日硒需要量为60-120μg，最高摄入量400μg每日。硒经肠道吸收后很快被肝脏和血红细胞摄取。硒被血红细胞还原后释入血浆内，借其硫醇基非特异性地与血浆蛋白相给结合，运输到人体组织细胞而发挥作用。 &&&&一、硒有保护机体免受氧化损害的功能：研究证明，物质在人体代谢过程中会产生许多强氧化力的产物，如过氧化氢、超氧阴离子等。这些产物在体内可氧化脂肪酸和蛋白质(尤其是膜蛋白)，从而对生物膜包括细胞膜的结构与功能产生一定的影响。而硒有抗氧化作用，能有效地保护和稳定细胞的工作水平。具体有以下功能：①参与心肌代谢、维持心血管的完整性。硒参与心肌的能量代谢及心肌有关辅助酶的合成。同时硒也是与电子传递相关的细胞色素的成分。如上面所述，硒对红细胞及亚细胞膜都有保护作用。另据实验研究表明，低硒状态容易出现轻度的线粒体变性、心肌纤维坏死、心肌小动脉及毛细血管损伤，与之相关的疾病有克山病、缺血性心脏病等。②抗癌。研究发现，某些癌症患者血硒水平降低，而且血液中硒浓度与癌症的死亡率呈负相关。 &&&&二、增强免疫功能 参与免疫球蛋白的合成，刺激抗体的生成，增强吞噬细胞的吞噬能力，对提高机体抵抗力有一定的作用。 &&&&三、硒具有抗氧化作用，是“自由基”的清除剂，具有抗衰老的功效。人体内抗氧化作用差又不能及时清除“自由基”时，细胞衰老的速度也明显加快。硒能保护细胞膜免受自由基的攻击与过氧化损伤，可以使脂褐素的出现推迟：人体内自由基使脂质过氧化，损害细胞膜，使细胞膜上的不饱和脂肪酸交联成脂褐素，使结缔组织中胶原蛋白失去弹性，而硒在细胞内通过谷胱甘肽过氧化物酶的作用破坏机体中存在的过氧化物，防止有害自由基的形成及其对不饱和脂肪酸的攻击，这不仅对全身细胞有作用，同样对表皮细胞及皮下组织也有作用，可以延缓皮肤细胞的衰老死亡；所以硒有一定的防止细胞衰老和增加皮肤弹性，从而有美容作用。此外，硒还能解除有害金属物质的毒性，特别是硒可降低铅的毒性作用，这对减少一些含铅化妆品的毒性作用具有重要意义。 &&&&总之，硒是使人长寿的独一无二的微量元素。如果得不到足够的硒，体内的细胞则要遭受病毒、癌症及早衰等折磨。科学家们建议：要长寿，就要适量的补硒。
“植物大熊猫”――菜芙蓉花 &&&&菜芙蓉花属珍稀植物（俗称植物大熊猫），含有多种生物活性物质，其生物黄酮 含量高达6%（比目前被广泛应用的银杏、大豆等含量高近百倍），是目前已知植物资源中含量最高的，还含全价蛋白质、高聚糖胶、膳食纤维、微量元素硒、锌等生物活性物质。 &&&&目前，国际上以银杏、大豆为主要原料的商品化生产的生物黄酮纯度多在40%， 价约为1100元/公斤，纯度为60-80%的价达元，单体异黄酮则已卖到了每克10000元，而菜芙蓉花中的异黄酮恰好就是比金子还贵的单体异黄酮。 菜芙蓉花之生物黄铜的主要作用： & 1、润肠、排毒、抗氧化、美容、养颜； & 2、调节人体内分泌，减轻更年期综合症的临床症状； & 3、调节免疫功能，增强机体的抗病能力； & 4、降血脂、降血糖和调节血压； & 5、改善微循环，提高大脑神经细胞和心肌的耐缺氧能力；& 6、消炎、镇痛，抗过敏； & 7、改善腰肌劳损之疼痛及神经血管性头痛； & 8、防癌抗癌。