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宫颈周围支持韧带内交感神经的分布研究
手术发展至今历经100余年，从1905年Wertheim[1] 提出经腹广泛性子宫切除术(radical hysterectomy, RH)及盆腔淋巴清扫术起，RH就成为宫颈癌手术治疗的经典术式，但该术式术后并发症较多且多不可恢复，如膀胱感觉缺失，压力性、排尿困难等膀胱功能损伤；肛门括约肌松弛、里急后重等直肠功能障碍；及性生活时阴道润滑度、充血度下降等性功能障碍[2]。究其原因是盆腔自主神经(pelvic autonomic nerve, PAN)损伤所致[3]。因此，系统保留PAN 的广泛性子宫切除术(systematic nerve sparing radical hysterectomy, SNSRH)成为各国妇瘤医生研究的重点[4]。SNSRH与RH的区别在于其术中对PAN的保护，然而PAN的术中确认却成为制约该手术开展的关键。本研究对宫颈周围支持韧带内交感神经的分布进行探讨，进一步明确宫旁组织内PAN解剖。1& 材料与方法1.1& 材料3具经10%福尔马林固定的成年女性尸体（由苏州大学医学院解剖教研室提供，符合医学实验研究使用的一切科研、法律、伦理等规范），具备以下条件：年龄在65岁以下，无盆腔手术史且宫颈支持韧带完整者。兔抗人多克隆TH抗体原液、PV-9000二步法免疫组化检测试剂盒及3,3-二氨基联苯胺（DAB），均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。1.2& 方法1.2.1& 切取宫颈支持韧带并制作石蜡块打开盆腹腔，切除宫颈内口以上的宫旁结缔组织，分离输尿管外侧的直肠旁间隙及膀胱旁间隙，暴露主韧带，贯通上述两间隙，游离出整条主韧带，紧贴宫颈及盆壁将其切取；打开子宫直肠返折腹膜，分离输尿管内侧的直肠旁间隙及直肠阴道隔，暴露出宫骶韧带内侧面，贯通上述两间隙，游离出整条宫骶韧带，紧贴宫颈和骶骨将其切取；打开膀胱宫颈返折腹膜，下推分离出膀胱宫颈间隙，同时钝性分离膀胱阴道间隙，暴露出两间隙间的致密结缔组织，即膀胱宫颈韧带，予完整切取。用长线头结扎标记每条韧带的宫颈端，短线头标记其同侧头侧，各韧带以左侧距宫颈0cm、右侧距宫颈0.5cm为起点，每隔1cm进行分段（图1），室温下经脱水、透明、浸蜡后共制成30块石蜡块。&图 1 &宫颈周围支持韧带分段图A：右侧主韧带；B：左侧宫骶韧带；C：左侧膀胱宫颈韧带1.2.2& 免疫组化染色（1）切片（厚3&m），入48℃温水浴，展平，捞片，室温下放置24小时干燥，二甲苯脱蜡5分钟×3次，梯度酒精中脱二甲苯，蒸馏水洗片2分钟×2次。（2）将组织切片放入0.3%H2O2去离子水孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗，2分钟×3次。（3）滴加一抗TH（1:400稀释液），37℃孵育2小时，PBS冲洗，2分钟×3次，滴加PV-9000二步法免疫组化检测试剂，PBS冲洗，应用DAB溶液显色，根据显色效果适时用PBS洗涤终止反应，复染、脱水、透明、封片。1.2.3& 观察：染色后的切片分别在40倍及100倍显微镜下观察，摄片。2& 结果2.1& 主韧带内交感神经走行分布主韧带平均长5cm，距宫颈4.5cm（图2A）、4.0cm 、3.5cm、3.0cm（图2B）、2.5cm、2.0cm（图2C）处均未见TH阳性纤维；距宫颈1.5cm（图2D）处可见TH阳性纤维束，位于韧带中部；距宫颈1.0cm（图2E）、0.5cm处切面内TH阳性纤维束分布于韧带尾侧，靠近韧带腹侧面处数量密集。观察主韧带不同位置切面内TH阳性纤维分布情况，我们发现交感神经主要集中在主韧带宫颈端的中下部，由背侧面向腹侧面走行、集聚且神经纤维直径粗细不一。&图 2 &免疫组织化学染色主韧带各段切面内TH阳性纤维分布情况（×40）A：右侧距子宫颈4.5cm处；B：左侧距子宫颈3.0cm处；C：左侧距子宫颈2.0cm处；D：右侧距子宫颈1.5cm处；E：左侧距子宫颈1.0cm处。箭头所指均为TH标记阳性染色的神经纤维。2.2& 宫骶韧带内交感神经走行分布宫骶韧带平均长6.5cm，距宫颈6.0cm、5.5cm（图3A）处可见大量TH阳性纤维分布，主要集中于韧带的头侧及内侧面，多为直径较小纤维束，无明显粗大纤维束；距宫颈5.0cm（图3B）、4.5cm、4.0cm、3.5cm处，TH阳性纤维分布在韧带的中部，纤维束粗细不等；距宫颈3.0cm（图3C）、2.5cm、2.0cm（图3D）处TH阳性纤维束主要位于韧带中下部并向外侧靠近，纤维束稍粗且直径较均匀；距宫颈1.5cm、1.0cm 、0.5cm（图3E）处，TH阳性纤维束渐变粗大，分布于韧带的尾侧及外侧面。由此我们观察到宫骶韧带内交感神经分布情况大致如下：在宫骶韧带的盆壁侧，神经纤维束分布于韧带的头侧及内侧面，向宫颈端走行过程中逐渐偏向韧带的外侧及尾侧面，且神经束直径逐渐变大。&图 3 &免疫组织化学染色宫骶韧带各段切面内TH阳性纤维分布情况（×40）A：右侧距子宫颈5.5cm处；B：左侧距子宫颈5.0cm处；C：左侧距子宫颈3.0cm处；D：左侧距子宫颈2.0cm处；E：右侧距子宫颈0.5cm处。箭头所指均为TH标记阳性染色的神经纤维。2.3& 膀胱宫颈韧带内交感神经走行分布膀胱宫颈韧带平均长2.3cm，距宫颈2.0cm、1.5cm、1.0cm、0.5cm处切面内均见大量TH阳性纤维束，集中于膀胱宫颈韧带深层，密集分布在膀胱静脉内侧，为均一细小纤维束，无粗大纤维束（图4A-4D）。观察膀胱宫颈韧带各段切面内TH阳性纤维分布情况，可见交感神经在膀胱宫颈韧带内自宫颈前外侧至膀胱底壁均走行在膀胱宫颈韧带深层的膀胱静脉内侧，且膀胱底壁处纤维束数量渐增多，直径变细小，呈散在分布。&图 4& 免疫组织化学染色膀胱宫颈韧带各段切面内TH阳性纤维分布情况（×40）A：左侧距宫颈2.0cm处；B：右侧距宫颈1.5cm处；C：左侧距宫颈1.0cm处；D：右侧距宫颈0.5cm处。V：膀胱静脉（Vesical Vein）。箭头所指均为TH标记阳性神经纤维。E：右侧距子宫颈1.5cm处（×100）。3& 讨& 论宫颈癌是女性主要恶性肿瘤之一，发病逐渐年轻化，Jemal等【5】统计发现每年全世界有46.6万宫颈癌新发病例，2009年美国新增病例11270人，死亡4070人。随着宫颈癌早期筛查及手术技术的提高，早期宫颈癌患者经手术治疗5年生存率达90%以上，但如何降低术后并发症、改善患者术后生存质量成为妇瘤专家的新挑战[6]。Kobayashi提出术中识别和保护PAN的手术理念[7]，即SNSRH，但并不普及，原因是目前对PAN分布走行不明确，术中PAN的寻找、辨认及保护复杂困难，保留标准也不统一。神经纤维由神经元的轴突或树突、髓鞘和神经膜组成，多数交感神经纤维的节后纤维释放神经递质去甲肾上腺素，而TH是去甲肾上腺素合成的限速酶，利用TH抗体对组织切片进行免疫组化的方法可广泛地用于交感神经节后神经纤维的检测[8]。臧荣余等[9]研究发现主韧带内神经包含来自盆内脏神经(pelvic splanchnic nerves, PSN)的副交感神经及来自骶交感干的交感神经节后纤维。Kato等[10]通过S-100对新鲜尸体标本进行研究发现PSN在直肠旁间隙底部走行于主韧带背侧。陈春林等【11】发现主韧带内分布有交感和副交感神经纤维及神经节，但未详述两种神经的分布走行。本研究在靠近盆壁侧主韧带内未发现交感神经，而在宫颈端主韧带内发现交感神经密集分布，主要集中于韧带中下部，靠近腹侧面。这一结果与Marc Possover等[12]采用的保留PAN手术方式具有一致性，他们用腹腔镜放大7倍分离主韧带，保留膀胱副交感神经走向治疗38例Ibl一Ⅲa期宫颈癌，与未保留神经者相比（n=28），留置导尿管的时间明显缩短。之后他们通过改进方法进行研究，提出对保护膀胱功能而言，保留PSN要比腹下神经更为重要，原因是副交感神经是主韧带的主要神经，既是膀胱平滑肌的运动神经，又是其括约肌的抑制神经，因而保留副交感神经对膀胱功能恢复起重要作用。不过根据盆腔神经丛的解剖及妇瘤专家在实践中的体会[13]，宫颈癌治疗失败最关键的问题是主韧带切除不足，如何确当、充分切除主韧带又保全PSN，需要进一步技术上的探索和病例资料的随访。本研究发现宫骶韧带内大量TH阳性纤维密集分布，自盆壁侧韧带的头侧及内侧面向前向外向下走行至宫颈处韧带的尾侧及外侧面。这一结果与以往研究[9]腹下神经为双侧对称的交感神经纤维，主要分布于宫骶韧带及直肠阴道韧带的外侧面并与之紧贴相一致。Butler Manuel等[14]利用免疫组化方法对切除标本进行研究，发现宫骶韧带内的神经密度比主韧带内更大，他们强调在SNSRH中要注意宫骶韧带侧面的切除范围，目的是避免腹下神经的损伤。Francesco等 [15]利用超声吸引器吸取主韧带中的淋巴、脂肪、结缔组织后，自盆壁切断主韧带，但刻意保护宫骶韧带的后部以保护其内腹下神经，在其研究的23例中有21例在术后7天内拔除尿管自行排尿，残尿均小于100mL。另外，患者性生理研究显示, 腹下神经在性活动时对阴道润滑和高潮产生起关键作用。膀胱宫颈韧带为一对结缔组织束，厚薄不一，连接于阴道前壁、子宫颈前外侧壁和尿道后壁、膀胱底壁之间。本研究发现膀胱宫颈韧带内TH阳性纤维主要分布于膀胱宫颈韧带深层的膀胱静脉内侧，且膀胱宫颈韧带距膀胱底壁较近部位内神经纤维纤细，没有明显粗大纤维束。在广泛和次广泛子宫切除术中需切断膀胱宫颈韧带，其内交感神经丛末梢部位被切断而引起性功能障碍。Katahira等[16]也发现膀胱宫颈阴道韧带深层中包含丰富的自主神经节细胞。Kuwabara等[17]采用电刺激的方法解剖膀胱宫颈阴道韧带时预先将测压器置入膀胱，用微电极刺激膀胱宫颈阴道韧带深层的外侧组织进行识别膀胱静脉周围神经组织，如膀胱内的感应器有反应，则证实有盆丛膀胱支的走行，并且他们用免疫组化方法在5例行传统根治术患者的膀胱子宫韧带中定位膀胱神经分支，其结果与我们的研究基本一致。SNSRH因其可降低术后膀胱、下尿道、肛门、直肠、外阴及阴道功能障碍等各种并发症的发生率，提高患者生存质量而成为各国妇瘤专家、学者等的研究热点。明确PAN在宫旁各组织内的分布走行，特别宫颈周围各支持韧带内神经分布，对保留神经的宫颈癌根治术有重要的指导意义。本研究主要针对尸体标本，存在一定局限性，因此寻找更简单、方便、可行、有效的神经识别方法对保留PSN的手术开展有临床指导意义，是今后研究和探讨的重点。参& 考& 文& 献[1] &Wertheim E. The extended abdominal operation for carcinoma uteri (based on 500 operative cases). Am J Obstet Dis Women Child, 9-232.[2] &Ranee T, Abdul HS. Hysterectomy and pelvic organ dysfunction.Best Practice & Research Clinical Obstetrics and Gynecology, 3-418.[3] &Fujii, S. Anatomic identification of nerve-sparing radical hysterectomy: a step-by-step procedure. Gynecol Oncol, : S33-41.[4] &Dursun P, Ayhan A, Kuscu E. Nerve-sparing radical hysterectomy for cervical carcinoma. Crit Rev Oncol Hematol, 5-205.[5]& Jemal A, Siegel R, Ward E, et al. Cancer statistics, 2009. CA Cancer J Clin ): 225-249.[6] &Likic IS, Kadija S, Ladjevic NG, et al. Analysis of urologic complications after radical hysterectomy. Am J Obstet Gynecol, : 644.[7]& Samlal RAK, van der Velden J, Ketting BW, et al. Disease-free interval and recurrence pattern after the Okabayashi variant of Wertheim’s radical hysterectomy for stage Ib and IIa cervical carcinoma[J]. 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Pelvic nerve plexus trauma at radical hysterectomy and simple hysterectomy: the nerve content of the uterine supporting ligaments[J]. Cancer, ): 834-841.[15] &Francesco R, Antonino D, Rosanna F, et al. Nerve-sparing radical hysterectomy: a surgical technique for preserving the autonomic hypogastric nerve[J]. Gynecol Oncol, 7-314.[16]& Katahira A, Niikura H, Ito K, et al. Vesicouterine ligament contains abundant autonomic nerve ganglion cells: the distribution in histology concerning nerve-sparing radical hysterectomy. Int J Gynecol Cancer, -38.[17]& Kuwabara Y, SuzukiM, Hashimoto M, et al. New method to prevent bladder dysfunction after radical hysterectomy for uterine cervical cancer[J]. J Obstet Gynaecol Res, ): 1-8.
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