丹参糖蛋白的分离纯化与生物活性研究--《陕西师范大学》2007年硕士论文
丹参糖蛋白的分离纯化与生物活性研究
【摘要】：
丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)系鼠尾草属植物，是一味常用中药，以其干燥根茎入药，可用于治疗冠心病、中风、微循环障碍等疾病。丹参中脂溶性有效成分为丹参酮类，具有抗菌作用；水溶性有效成分为酚酸类，具有抗氧化，改善心肌缺血等药理作用。目前对于丹参活性成分的研究仅限于以上两类小分子物质，而对于极具开发前景的活性多糖及糖蛋白类物质的研究报道较少。为了进一步开发利用丹参资源，本课题选取丹参为材料，采用现代分离分析技术对丹参糖蛋白组分进行了分离、纯化，并对纯化组分进行了组成及结构测定，采用现代功能评价方法对粗提物的体外抗氧化活性和对小鼠的免疫调节活性进行了初步研究，试验主要结论如下：
1．采用热水浸提法提取丹参糖蛋白，正交试验得出最佳提取条件为：料液比1：20、浸提温度70℃、浸提时间4h、NaCl浓度0.1mol／L，糖蛋白得率为4.68％。
2．采用超声辅助法提取丹参糖蛋白，正交试验得出最佳提取条件为：超声功率250W、超声处理20 min、NaCl浓度0.05mol／L、料液比为1：20，糖蛋白得率为6.89％。
3．丹参糖蛋白精制的最佳条件为：Sevage法去除游离蛋白7次，80％的乙醇沉淀，糖蛋白得率为5.03％。
4．丹参糖蛋白精制品为(CSGP)糖含量51.24％，蛋白质含量37.34％的不含淀粉、还原糖、多酚类物质的酸性物质，利用气相色谱法、氨基酸自动分析仪、紫外光谱法、红外光谱法对该提取物的单糖、氨基酸组成、光谱学特征进行了研究，结果表明该提取物含有17种已测定的氨基酸和8种单糖，存在大量的O-糖肽键，初步获得了该提取物的光谱学特征图谱。
5．丹参糖蛋白精制品(CSGP)经DEAE-52离子交换纤维素柱层析和SephadexG-200凝胶柱层析分离出CSGP-1-a、CSGP-1-b、CSGP-3′、CSGP-4′四种组分，其纯度鉴定分别采用琼脂糖凝胶电泳和Sepharose CL-6B凝胶柱层析法，结果表明四种组分均为均一组分。
6．气相色谱、紫外光谱、红外光谱、理化特性分析结果表明，CSGP-1-a糖含量为95.4％，α、β糖苷键同时存在，是主要由葡萄糖组成的硫酸化多糖，分子量87.6kD，比旋光度+52.3°；CSGP-1-b、CSGP-3′、CSGP-4′均是酸性糖蛋白，糖含量分别为89.5％，79.3％，92.5％，蛋白质含量分别为2.5％、19.6％，7.9％；分子量分别为65.4kD、55.8kD、42.3kD，比旋光度分别为+89.6°、+132.5°、+99.5，在三种组分中葡萄糖、半乳糖含量均较高，且均存在O-糖肽键；其中CSGP-3′、CSGP-4′含有少量磺酸基和硫酸基。
7．氨基酸分析结果表明，除CSGP-1-a未检测出氨基酸外，CSGP-1-b、CSGP-3′、CSGP-4′均含有所测定的17种氨基酸，其中天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸含量均较高，构成植物糖蛋白O-糖肽键的丝氨酸、酪氨酸含量也较高。
8．丹参糖蛋白(CSGP)对NADH／PMS体系产生的超氧阴离子自由基，对Fenton反应体系产生的羟基自由基均有显著的清除作用，并呈一定的剂量效应关系，对DPPH自由基具有一定的清除作用，无明显剂量效应关系；其中对超氧阴离子自由基、羟基自由基的清除率与同浓度Vc相当。
9．丹参糖蛋白(CSGP)的乙醇分级组分CSGP-A、CSGP-B、CSGP-C对超氧阴离子自由基、羟基自由基均有不同程度的清除作用，以半数清除率浓度(IC_(50))进行比较，对两种自由基的清除能力的强弱顺序均为：CSGP-A＞CSGP＞CSGP-B＞CSGP-C，其中CSGP-A组分对自由基的清除效果最好，对·OH和O_2~-·的半数清除率浓度分别为0.0970 mg·mL~(-1)和0.0716 mg·mL~(-1)，是CSGP中抗氧化的强效组分。
10．通过建立环磷酰胺所致免疫抑制小鼠模型来考察丹参糖蛋白(CSGP)的免疫调节功能，结果表明丹参糖蛋白能刺激免疫抑制小鼠免疫器官的增长(P＜0.01)，增强免疫抑制小鼠的巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力(P＜0.01)；促进免疫抑制小鼠血清溶血素的生成(P＜0.01)，提高免疫抑制小鼠抗体生成细胞的活力(P＞0.05)；显著提高脾淋巴细胞的增殖能力(P＜0.01)，提示丹参糖蛋白具有免疫调节作用。
研究表明，糖蛋白在丹参中不仅有较高的含量，而且有较高的生物活性，是一种极具开发前景的天然活性成分。
【关键词】：
【学位授予单位】：陕西师范大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2007【分类号】：TQ461【目录】：
Abstract5-11
第一章 文献综述11-35
1 丹参的研究进展11-16
1.1 丹参的植物学特征与生药学鉴别特征11-13
1.2 丹参的化学成分13-14
1.3 丹参的药理研究14-16
1.4 丹参的临床应用16
1.5 丹参的膳食应用16
2 糖蛋白的研究进展16-33
2.1 糖蛋白的研究现状16-17
2.2 糖蛋白的结构17-20
2.3 糖蛋白的生物活性20-23
2.4 糖蛋白的研究方法23-33
3 本课题研究的内容和意义33-35
3.1 本课题研究的主要内容34
3.2 本课题研究的目的和意义34-35
第二章 丹参糖蛋白的提取精制工艺研究35-54
1 试验材料、试剂及仪器35
1.1 试验材料35
1.2 试剂35
1.3 仪器35
2 试验方法35-39
2.1 丹参糖蛋白检测方法的建立35-36
2.2 原料预处理36
2.3 丹参糖蛋白提取精制工艺流程36
2.4 热水浸提法提取丹参糖蛋白工艺条件的研究36-37
2.5 超声波辅助法提取丹参糖蛋白工艺条件的研究37-38
2.6 丹参糖蛋白的精制条件研究38-39
2.7 丹参糖蛋白精制品(CSGP)的理化性质测定39
3 结果与分析39-53
3.1 丹参糖蛋白得率的计算39-40
3.2 热水浸提丹参糖蛋白的工艺研究40-44
3.3 超声波辅助提取丹参糖蛋白工艺研究44-48
3.4 丹参糖蛋白的精制条件研究48-50
3.5 丹参糖蛋白精制品(CSGP)理化性质50-53
4 讨论53-54
第三章 丹参糖蛋白的分离纯化及结构分析54-75
1 试验材料、试剂及仪器54-55
1.1 试验材料54
1.2 试验试剂54
1.3 试验仪器54-55
2 试验方法55-57
2.1 糖蛋白的分级纯化55
2.2 糖蛋白的纯度鉴定55
2.3 糖蛋白纯品的分子量测定55-56
2.4 糖蛋白纯品的理化性质测定56
2.5 糖蛋白的组成及结构分析56-57
3 结果与分析57-73
3.1 糖蛋白精制品(CSGP)的DEAE-52纤维素柱层析57-58
3.2 三种级分的SephadexG-200凝胶柱层析58-60
3.3 糖蛋白纯度鉴定60-62
3.4 糖蛋白纯品的分子量测定62-63
3.5 糖蛋白纯品的理化性质63
3.6 糖蛋白纯品中糖和蛋白质含量63-64
3.7 糖蛋白纯品紫外光谱图解析64-66
3.8 糖蛋白纯品红外光谱图解析66-68
3.9 糖蛋白纯品的组成68-73
4 讨论73-75
第四章 丹参糖蛋白的生物活性研究75-88
1 试验材料、试剂及仪器75
1.1 试验材料75
1.2 试验试剂75
1.3 试验仪器75
2 试验方法75-80
2.1 活性试验用丹参糖蛋白的制备方法75-76
2.2 丹参糖蛋白的体外抗氧化活性评价76-77
2.3 丹参糖蛋白对小鼠免疫功能评价77-79
2.4 统计学处理79-80
3 结果与分析80-86
3.1 体外抗氧化试验结果80-83
3.2 小鼠体内免疫活性试验结果83-86
4 讨论86-88
创新之处90-91
参考文献91-102
致谢102-103
攻读学位期间的研究成果103
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文竹生物 丹参提取物 丹参水提物
丹参素&丹参提取物&&& 丹参又名赤参，紫丹参，红根等。为双子叶植物唇形科鼠尾草属多年生直立草本植物。主产安徽、甘肃、陕西、河南等地。其根是一种中药。性味苦，微寒。归心、肝经。有祛瘀止痛，活血通经，清心除烦之功效。用于月经不调，经闭痛经，症瘕积聚，胸腹刺痛，热痹疼痛，疮疡肿痛，心烦不眠;肝脾肿大，心绞痛。&&& 丹参素是中药丹参的水溶性成分，又称丹参酸甲，结构为&-（3,4-二羟基苯基）乳酸钠，具有扩张血管、增加冠脉血流量等作用。&产品名称：丹参素产品来源：唇形科丹参的干燥根及根茎产品规格：5%&98%产品性状：棕黄色粉末CAS NO. ：分 子 量：198.17分 子 式：C9H10O5&产品功效：丹参素可抑制血小板合成，提高心肌耐缺氧能力，保护心肌，增加冠脉流量。这些药理作用是丹参注射液治疗冠心病、心肌缺血的主要机制。&1、对心肌的作用：丹参素具有缩小心肌梗死范围和减轻病程的作用，同时对心肌缺血&再灌注损伤具有保护作用。2、抑制血小板聚集及抗凝作用：丹参素能明显抑制血小板的聚集，并明显增加血小板膜的流动性，提示其对冠心病有效。3、抗菌消炎及增强机体免疫作用：丹参素阻止钙离子内流，能显著抑制由内毒素诱导的肿瘤坏死因子(TNF&）、IL-1、IL-6、IL-8因子的大量分泌，具有抗炎及增强机体免疫作用。在临床上对感染性休克患者应用丹参素，可望提高生存率。4、抗动脉粥样硬化及降血脂作用：丹参素抑制细胞内源性胆固醇的合成，还具有抗脂质蛋白氧化作用，降低血胆固醇，因此具有保护血管屏障，防止脂质沉积及动脉粥样硬化(AS)作用。5、抗血栓形成作用：丹参素具有钙拮抗作用，通过抑制红细胞膜上的电压依赖通道，抑制红细胞的钙内流，使细胞内钙水平降低，使红细胞变形能力增强。它还可提高红细胞的负电荷,使彼此不易聚集；降低全血粘度，激活纤溶酶系统。由于丹参素在心、肾、脑的分布浓度高，连同对血液的这些影响，提示丹参素可预防血栓的发生。6、防止创面的过度愈合，对增生性疤痕的治疗作用：丹参素可以通过改善微循环、改变伤口局部微环境、提供能量代谢物质、促进代谢产物的清除，从而对肉芽组织中的成纤维细胞有抑制作用，可防止创面的过度愈合。7、扩张冠状动脉作用：丹参素能明显扩张冠状动脉，使冠状动脉的血流量显著增加，并能对抗吗啡、心得安等的缩冠脉效应。8、治疗肝损伤的作用：丹参素可明显改善肝细胞线粒体的功能，减轻肝细胞的损伤、坏死。9、抗脑缺血损伤作用：丹参素可明显缩小脑梗死面积，改善神经功能缺损，并减少脑水含量。10、丹参素对肺心病的治疗：丹参素具有扩张动脉的作用，并且可抑制血小板释放收缩物质。11、丹参素抗肿瘤作用：丹参素的抑癌作用可能是其抗癌作用的原因之一。12、丹参素对高原病的防治：丹参素能提高血液的携氧能力，延长机体耐受缺氧的能力，有效的减轻低氧所致的心脑肾肺等重要器官的损伤，为高原病的防治提供了依据。13、丹参素对银屑病的治疗作用：丹参素可通过降低粘附分子的表达治疗银屑病。&&储存条件：1、1kg铝箔真空袋/25kg纸板桶；2、亦可根据客户要求包装；3、贮存于干燥阴凉处,避免阳光照射和高温保 质 期：原包装24个月有效
西安文竹生物科技有限公司是一家专业从事天然植物提取物、医药中间体、化学合成原料研发、生产、销售的高新技术产业，其产品广泛应用于功能性食品饮料、保健品、化妆品和制药等领域。公司本着“诚信、合作、共赢”的原则，为人类的健康事业服务。公司位于西安高新技术产业园内，凭借高新产业园的人才、技术和科研优势以及优越的地理环境为企业的良好发展提供了有利空间；秦巴山脉的天然植物资源为产品的研发和生产提供了有利的自然条件。公司经过多年精心的经营，现以发展成多学科、全方位、高层次的技术、管理精英团队，曾多次承担国家、省、市级科研项目并取得骄人成绩。
&现在随着经济和技术的发展，人类对健康和长寿越来越重视，也促使企业对技术的要求越来越高。本公司立足高起点，高标准、高质量的经营理念。因此，公司不仅要有高层次的技术人才，还拥有完善的提取、分离、精制干燥设备和技术、严格的质量控制体系和完善的售后服务体系。
在全体员工的共同努力下，公司严把质量关、为客户提供及时的市场信息、提供有效的技术指导和完善的售后服务，公司凭借着优良的产品和优质的服务受到国内外顾客的一致好评，产品远销美国、欧洲、日本及东南亚等国家和地区。
&我们坚信’诚信’是公司的生存资本，满足顾客的需求就是我们服务的宗旨。望与各界朋友通力合作，互惠互利共谋发展。
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加热与常温渗漉-层析提取工艺对丹参水提物的影响
摘　要：分别采用渗漉-层析耦合和不同温度下加热提取工艺，从同一批丹参中提取水溶性成分丹酚酸，并采用高效液相色谱分析产物，研究提取工艺和温度对丹参水提物中丹酚酸B的含量、提取率及产物色谱谱图的影响。结果表明，用渗漉-层析耦合工艺得到的丹参水提物中的丹酚酸B含量最高且小分子酚酸类化合物很少；采用加热提取工艺时小分子酚酸类化合物种类及含量随温度（60～100℃）的升高而增加，丹酚酸B含量及提取率随提取温度的升高呈现由高到低又增高的规律、两者在100℃时达到最大值。研究表明应根据对丹参水提物及其制剂的质量与安全性要求选择合适的工艺及工艺条件。
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