METHOD FOR INDUCTION OF CILIATED CELL DIFFERENTIATION
WIPO Patent Application WO/
The object is to identify a substance that is suspected to be contained in FBS that inhibits the differentiation of a differentiated cell into a ciliated cell, and to provide a method which can induce the ciliated cell differentiation even in a conventional culture system with a serum such as FBS that has been used in conventional culture systems by suppressing the signal of the substance or forcibly expressing a gene involved in the ciliated cell differentiation. The ciliated cell differentiation be induced in a conventional culture system with a serum by suppressing a BMP signal or expressing Foxj1 (a cilia-related gene) or Foxa2 that is essential for the respiratory system differentiation.
Inventors:
ASASHIMA, Makoto (3-40-9, Otsuka Toshima-k, Tokyo 05, 17000, JP)
浅島 誠 (〒05 東京都豊島区大塚３－４０－９ Tokyo, 17000, JP)
Application Number:
Publication Date:
09/11/2009
Filing Date:
03/02/2009
Export Citation:
Japan Science and Technology Agency (Kawaguchi Center Building, 4-1-8 Honcho, Kawaguchi-sh, Saitama 12, 33200, JP)
独立行政法人 科学技術振興機構 (〒12 埼玉県川口市本町４－１－８ 川口センタービル Saitama, 33200, JP)
ASASHIMA, Makoto (3-40-9, Otsuka Toshima-k, Tokyo 05, 17000, JP)
International Classes:
C12N15/09; C12N5/10; C12Q1/02; G01N33/15; G01N33/50
View Patent Images:
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Domestic Patent References:
WOA1N/AWOA2N/A
Foreign References:
Other References:
NISHIMURA, Y. ET AL.: 'Ciliated Cells Differentiated from Mouse Embryonic Stem Cells' STEM CELLS vol. 24, no. 5, 2006, pages 1381 - 1388
YOU, Y. ET AL.: 'Role of f-box factor foxjl in differentiation of ciliated airway epithelial cells' AM J PHYSIOL vol. 286, no. 4, 2004, pages L650 - L657
ZHANG, Y. ET AL.: 'A Transgenic FOXJ1-Cre System for Gene Inactivation in Ciliated Epithelial Cells' AM J RESPIR CELL MOL BIOL vol. 36, no. 5, 2007, pages 515 - 519
Attorney, Agent or Firm:
ABE, Masahiro (Dia Palace Tsudanuma
Maebara-nishi 2-chom, Funabashi-shi Chiba 25, 27408, JP)
血清を含む培地で未分化細胞から形成された胚様体を培養する工程において、未分化細胞におけるBMPシグナルを抑制することによって、該未分化細胞から繊毛細胞へ分化誘導する方法。
Smad6及び/又はSmad7遺伝子を未分化細胞に導入し、該遺伝子を強制発現させることによりBMPシグナルを抑制する、請求項1記載の方法。
未分化細胞におけるSmad6及び/又はSmad7遺伝子の発現を増強させることによりBMPシグナルを抑制する、請求項1記載の方法。
Smad6及び/又はSmad7遺伝子が哺乳動物由来である、請求項3記載の方法。
血清を含む培地で未分化細胞から形成された胚様体を培養する工程において、繊毛細胞の分化に関わる遺伝子の発現を増強させることによって、該未分化細胞から繊毛細胞へ分化誘導する方法。
繊毛細胞の分化に関わる遺伝子がFoxj1及び/又はFoxa2遺伝子である、請求項5記載の方法。
Foxj1及び/又はFoxa2遺伝子を未分化細胞に導入し、該遺伝子を強制発現させることを含む、請求項6記載の方法。
Foxj1及び/又はFoxa2遺伝子が哺乳動物由来である、請求項7記載の方法。
未分化細胞が胚性幹細胞である、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
未分化細胞がヒトに由来するものである、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
血清が牛胎仔血清である、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
請求項1~11のいずれか一項に記載の方法で分化誘導された繊毛細胞。
脳室の繊毛細胞である、請求項12記載の繊毛細胞。
請求項12又は13記載の繊毛細胞を用いる、繊毛を再生又は阻害させる薬剤のスクリーニング方法。
Description:
繊毛細胞の分化誘導方法
本発明は、血清を含む培地で未分化細胞から形成された胚様体を培養する工程を含む、該未分化細胞から繊毛細胞へ分化誘導する方法、該方法で分化誘導された繊毛細胞、及び、該繊毛細胞を用いる、繊毛を再生又は阻害させる薬剤のスクリーニング方法等に関する。
2004年以前には、胚性幹細胞 (embryonic stem cell, ES細胞)等の未分化細胞から繊毛細胞を誘導する方法は知られていなかった。この状況を解決することを目的にして、本発明者は、市販の細胞培養液であるKnockout Serum Replacement (KSR) を用いた特殊な培養系により、ES細胞等の未分化細胞から繊毛細胞を誘導する方法を開発した(特許文献1)。しかしながら、一般的に細胞培養に使用されている牛胎仔血清 (Fetal Bovine Serum, FBS) には繊毛細胞への分化を抑制する作用があり、FBSを用いた一般的な培養系ではES細胞等の未分化細胞から、繊毛細胞を分化することができなかった。
特開号公報
従って、本発明の主な目的は、未分化細胞から、繊毛細胞への分化を阻害するFBSに含まれると思われる物質を特定し、そのシグナルを抑制することや、繊毛細胞の分化に関わる遺伝子を強制発現させることで、通常の培養系で使用されるFBS等の血清を用いた一般的な培養系でも、繊毛細胞を分化誘導
できる方法を提供することである。
骨形成タンパク質(Bone morphogenetic protein:BMP)は分泌性の増殖因子であり、トランスフォーミング増殖因子のスパーファミリーに属する。BMPは骨形成以外にも、形態形成及びその他の多様な作用を有する。BMPシグナルはBMPにより活性化されたレセプターが、細胞内シグナル伝達分子であるSmad1またはSmad5、
Smad8をリン酸化し、Smad4とヘテロダイマーを形成し核内へ移行することで下流の遺伝子発現を制御する。一方、Smad6又はSmad7は抑制型Smadとして知られており、BMPシグナルを抑制する。 本発明者は、Smad6またはSmad7を利用してBMPシグナルを抑制することにより、これまで繊毛細胞の分化が起こらなかったFBS等の血清を含む培地においても繊毛細胞を分化誘導できることを見出した。 更に、本発明者は、繊毛形成に必須の遺伝子であるFoxj1または呼吸器上皮の分化に重要な働きを持つFoxa2を発現させることでFBS等の血清を含む培地においても繊毛細胞を分化誘導できることを見出した。以上の知見に基づき本発明を完成した。
即ち、本発明は以下の各態様に係るものである。
[態様1]血清を含む培地で未分化細胞から形成された胚様体を培養する工程において、未分化細胞におけるBMPシグナルを抑制することによって、該未分化細胞から繊毛細胞へ分化誘導する方法。
[態様2]Smad6及び/又はSmad7遺伝子を未分化細胞に導入し、該遺伝子を強制発現させることによりBMPシグナルを抑制する、態様1記載の方法。
[態様3]未分化細胞におけるSmad6及び/又はSmad7遺伝子の発現を増強させることによりBMPシグナルを抑制する、態様1記載の方法。
[態様4]Smad6及び/又はSmad7遺伝子が哺乳動物由来である、態様3記載の方法。
[態様5]血清を含む培地で未分化細胞から形成された胚様体を培養する工程において、繊毛細胞の分化に関わる遺伝子の発現を増強させることによって、該未分化細胞から繊毛細胞へ分化誘導する方法。
[態様6]繊毛細胞の分化に関わる遺伝子がFoxj1及び/又はFoxa2遺伝子である、態様5記載の方法。
[態様7]Foxj1及び/又はFoxa2遺伝子を未分化細胞に導入し、該遺伝子を強制発現させることを含む、態様6記載の方法。
[態様8]Foxj1及び/又はFoxa2遺伝子が哺乳動物由来である、態様7記載の方法。
[態様9]未分化細胞が胚性幹細胞である、態様1~8のいずれか一項に記載の方法。
[態様10]未分化細胞がヒトに由来するものである、態様1~9のいずれか一項に記載の方法。
[態様11]血清が牛胎仔血清である、態様1~10のいずれか一項に記載の方法。
[態様12]態様1~11のいずれか一項に記載の方法で分化誘導された繊毛細胞。
[態様13]脳室の繊毛細胞である、態様12記載の繊毛細胞。
[態様14]態様12又は13記載の繊毛細胞を用いる、繊毛を再生又は阻害させる薬剤のスクリーニング方法。
繊毛細胞を分化誘導するためにKSRを用いた特殊な培養系をこれまでに開発されていたが、本発明によって、通常の細胞培養で利用されるFBS等の血清を用いた一般的な培地においても、BMPシグナルを抑制することや、繊毛関連遺伝子Foxj1や呼吸器系分化に重要であるFoxa2を発現させる
ことにより繊毛細胞を分化誘導することが可能になった。 更に、本発明による分化誘導で得られる繊毛細胞は、繊毛を再生または阻害させる薬剤のスクリーニングに使用できる。
Smad7により分化した繊毛細胞のbeta-tubulin IVの免疫染色図。 Smad7により分化した繊毛細胞のbeta-tubulin IVとMusashi1の免疫染色図。 Real-time PCRによる、Foxj1、beta-tubulin IV、及びCentrin4の発現を示すグラフ(*P&0.05)。 Foxj1により分化した繊毛細胞のbeta-tubulin IVの免疫染色図。 Foxa2により分化した繊毛細胞のbeta-tubulin IVの免疫染色図。 Foxj1を発現させたときのReal-time PCR法による、Foxj1、beta-tubulin IV、及びCentrin4の発現を示すグラフ(*P&0.05)。 Foxa2を発現させたときのReal-time PCR法による、Foxj1、beta-tubulin IV、及びCentrin4の発現を示すグラフ(*P&0.05)。
本発明の第一の態様は、血清を含む培地で未分化細胞から形成された胚様体を培養する工程において、未分化細胞におけるBMPシグナルを抑制することによって、該未分化細胞から繊毛細胞へ分化誘導する方法に係る。 未分化細胞におけるBMPシグナルを抑制する為の具体的な手段としては、例えば、Smad6及び/又はSmad7遺伝子を未分化細胞に導入し、該遺伝子を強制発現させることによりBMPシグナルを抑制したり、又は、未分化細胞における内在性のSmad6及び/又はSmad7遺伝子の発現を増強
させる等の方法により達成することが可能である。これによって、未分化細胞から繊毛細胞への分化を抑制する血清の作用が阻害され、該未分化細胞から繊毛細胞へ分化誘導が促進される。 更に、本発明の第二の態様は、血清を含む培地で未分化細胞から形成された胚様体を培養する工程において、繊毛細胞の分化に関わる遺伝子の発現を増強させることによって、該未分化細胞から繊毛細胞へ分化誘導する方法に係る。繊毛細胞の分化に関わる遺伝子としては、当業者に公知の任意の遺伝子、例
えば、Foxj1及びFoxa2遺伝子を挙げることができる。 このような遺伝子の発現を増強させるための具体的な手段としては、例えば、Foxj1及び/又はFoxa2遺伝子を未分化細胞に導入し、該遺伝子を強制発現させることを挙げることができる。
本明細書において、「未分化細胞」は未分化状態にある細胞を広く意味し、例えば、胎性幹細胞(ES細胞)の他、造血幹細胞、神経幹細胞、皮膚組織幹細胞等、様々な組織性幹細胞等を包含する概念である。更に、マウス及びヒト等由来の各種体細胞等の分化した細胞又は各種の幹細胞若しくは前駆細胞等に、
Oct3/4, Klf4, c-Myc 及びSox2等の遺伝子を導入したり、或いは、その他の薬剤処理等によって誘導された、人工多能性幹細胞(Induced Pluripotent Stem Cell)も本明細書における「未分化細胞」に含まれる(特許第4183742号、特開号公報、Takahashi K. et al., Cell, 2007 Nov. 30:131(5):861-72) 又、受精卵の胎児へと成長していく過程の一つに胚盤胞と呼ばれる状態がある。胚盤胞は、球状の形をしており、外側の細胞層である栄養外胚葉と将来的に身体を形成する内部細胞塊を含む胞胚腔とから構成されている。ES細胞等の未分化細胞を浮遊状態で培養すると、周辺部が内皮様に分化した胞胚腔に
類似する大きな細胞集塊を形成する。本発明では、この細胞集塊を胚様体(embryoid bodies)という。 胚様体は、従来公知の技術にしたがって調製することができる。胚様体を構成する細胞は、胚様体を形成することができる程度に未分化な細胞であれば特に制限されることはないが、好ましくは、ES細胞又は体性幹細胞であり、特に好ましくはES細胞である。例えば、ES細胞を出発材料として、ウシ胎
仔血清等を含む血清培地又は無血清培地中で浮遊培養してES細胞の集合体である胚様体を調製することができる。 本発明に用いることができる未分化細胞は、哺乳類に由来する細胞であれば特に制限されることはないが、好ましくは、マウス等のげっ歯類又は霊長類に由来する細胞であり、特に好ましくは、ヒトに由来する細胞である。 未分化細胞及び上記核遺伝子が導入された形質転換体の培養は、当業者に公知の任意の方法で行うことが出来る。例えば、未分化細胞は、必要に応じ、フィーダー細胞上に播種することによって培養することができる。フィーダー細胞としては、X線、γ線、マイトマイシンC等で処理することによって生存
はするが増殖しない状態にした細胞を用いることができる。例えば、マウス由来ES細胞のフィーダー細胞としては、マイトマイシンCで処理したマウス胎児繊維芽細胞を用いることができる。なお、典型的には、培地は毎日交換し、かつ、継代培養を3日間おきに行う。
培養した未分化細胞を、トリプシン処理によって単一細胞懸濁液とし、得られた懸濁液を、培養用の容器に播種して、CO 2
インキュベーター内で培養する。この操作により、フィーダー細胞は培養面に付着するが、未分化細胞は培養面に付着せずに浮遊したままとなる。そこで培養上清を回収し、遠心分離することによって、未分化細胞をフィーダー細胞と分離することができる。
次に、得られた未分化細胞を、傾けた低付着性の培養用容器中で一晩浮遊培養し、次に容器を水平状態にして、さらに培養を2~3日間継続して胚様体を調製する。また、ミネラルオイル上に形成させた液滴中に未分化細胞を懸垂状態とさせて、培養することによっても胚様体を調製することができる。この
胚様体調製用培地としては、ウシ胎仔血清を含む培地又は無血清培地を用いることができる。 得られた胚様体は、付着性容器を用いて血清培地又は無血清培地の中で培養することによって、培養容器の底面に付着させることができる。 本発明においては、こうして得られた胚様体を、従来の特殊な無血清培地を使用することなく、通常の血清含有培地の中で培養することによっても、無数の繊毛様構造を有する細胞を分化誘導することができる。ここで、「血清」の種類?由来等に特に制限はなく、各種細胞、特に未分化細胞及びそれからの
各種分化細胞の培養培地に通常使用されるものが含まれる。その例として、ウシ等の各種動物由来の血清、特に、ウシ胎仔血清等を挙げることができる。 繊毛上皮細胞とは、繊毛様構造を有する細胞であり、繊毛特有の「あおり運動」を行い、脳室、気管上皮及び輸卵管などの繊毛に特有な軸糸の配列構造である9+2構造を有し、さらに、軸糸を構成するタンパク質であるチューブリン(β-チューブリンIV)や同じく繊毛に特有なタンパク質(マーカータ
ンパク質)の遺伝子であるFoxj1を発現する。従って、例えば、抗原染色法を用いて、軸糸の構成タンパク質であるβ-チューブリンIVを検出すること、また、RT-PCR法を用いて、Foxj1の発現を同定することによって、繊毛上皮細胞の誘導を確認することができる。尚、繊毛上皮細胞は、生体
内においては、気管上皮や輸卵管などに存在する。
Smad6、Smad7、並びにFoxj1及び Foxa2等の繊毛細胞の分化に関わる遺伝子は、哺乳動物、特に、げっ歯類及びヒトを含む霊長類由来のものが好ましい。例えば、ヒト由来のこれら遺伝子のアミノ酸配列等は公知であり、以下のID番号に基づき各公的機関のデータベースを参照することが出来る:
Smad6: NM_005585、Smad7: NM_005904、Foxj1: NM_001454、Foxa2: BC011780。
更に、上記各遺伝子として、
(a) 各遺伝子がコードする公知のアミノ酸配列において、1個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列から成り、かつ、該公知のアミノ酸配列が示す生物学的活性を蛋白質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸;
(b) 該公知のアミノ酸配列と90%以上、好ましくは93%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは99%以上の相同性を有するアミノ酸配列から成り、かつ、該公知のアミノ酸配列が示す生物学的活性を蛋白質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸;又は、
(c) 該公知のアミノ酸配列をコードする塩基配列から成る核酸と相補的な塩基配列から成る核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、該公知のアミノ酸配列が示す生物学的活性を蛋白質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸;
も各遺伝子と同様に本発明で使用することが可能である。
本発明の方法において、上記各遺伝子は、導入する幹細胞と同じ生物種又は異なる生物種由来のもののいずれでも良いが、出来るだけ互いに近縁種であることが好ましく、特に、同じ生物種由来であることが好ましい。 ここで、「相同性」とは、ポリペプチド配列(あるいはアミノ酸配列)又はポリヌクレオチド配列(あるいは塩基配列)における2本の鎖の間で該鎖を構成している各アミノ酸残基同志又は各塩基同志の互いの適合関係において同一であると決定できるようなものの量(数)を意味し、二つのポリペプチド配
列又は二つのポリヌクレオチド配列の間の配列相関性の程度を意味するものである。相同性は容易に算出できる。二つのポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列間の相同性を測定する方法は数多く知られており、「相同性」(「同一性」とも言われる)なる用語は、当業者には周知である (例えば、Lesk, A. M. (Ed.), Computational Molecular Biology, Oxford University Press, New York, (1988);Smith, D. W. (Ed.), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Academic Press, New York, (1993); Grifin, A. M. & Grifin, H. G. (Ed.), Computer Analysis of Sequence Data: Part I, Human Press, New Jersey, (1994);von Heinje, G., Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press,New York, (1987); Gribskov, M. & Devereux, J. (Ed.), Sequence Analysis Primer, M-Stockton Press, New York, (1991) 等) 。二つの配列の相同性を測定するのに用いる一般的な方法には、Martin, J. Bishop (Ed.), Guide to Huge Computers, Academic Press, San Diego, (1994);Carillo, H. & Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: ) 等に開示されているものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。 本発明の核酸(遺伝子)は、上記の蛋白質をコードするものである。ここで、「コードする」とは、本発明の蛋白質をその活性を備えた状態で発現させるということを意味している。また、「コードする」とは、本発明のタンパク質を連続する構造配列(エクソン)としてコードすること、又は本発明の蛋白
質を適当な介在配列(イントロン)を介してコードすることの両者を含んでいる。 「核酸」とは、リボ核酸、デオキシリボ核酸、又はいずれの核酸の修飾体をも含む。また、核酸は、一本鎖又は二本鎖のDNAを含んでいる。 本明細書において、「ストリンジェント(stringent)な条件」とは、前記のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドと、ゲノムDNAとの選択的かつ検出可能な特異的結合を可能とする条件である。ストリンジェント条件は、塩濃度、有機溶媒(例えば、ホルムアミド)、温度、およびその他
公知の条件の適当な組み合わせによって定義される。すなわち、塩濃度を減じるか、有機溶媒濃度を増加させるか、またはハイブリダイゼーション温度を上昇させるかによってストリンジェンシー(stringency)は増加する。更に、ハイブリダイゼーション後の洗浄の条件もストリンジェンシーに影響
する。この洗浄条件もまた、塩濃度と温度によって定義され、塩濃度の減少と温度の上昇によって洗浄のストリンジェンシーは増加する。 従って、「ストリンジェントな条件」とは、各塩基配列間の相同性の程度が、例えば、全体の平均で約80%以上、好ましくは約90%以上、より好ましくは約95%以上であるような、高い相同性を有する塩基配列間のみで、特異的にハイブリッドが形成されるような条件を意味する。具体的には、例えば
、温度60℃~68℃において、ナトリウム濃度150~900mM、好ましくは600~900mM、pH 6~8であるような条件を挙げることが出来る。ストリンジェントな条件の一具体例としては、5 x SSC (750 mM NaCl、75 mM クエン酸三ナトリウム)、1% SDS、5 x デンハルト溶液50% ホルムアルデヒド、及び42℃の条件でハイブリダイゼーションを行い、0.1 x SSC (15 mM NaCl、1.5 mM クエン酸三ナトリウム)、0.1% SDS、及び55℃の条件で洗浄を行うものである。
ハイブリダイゼーションは、例えば、カレント?プロトコールズ?イン?モレキュラー?バイオロジー(Current protocols in molecular biology(edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987))に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。 本発明の遺伝子は、上記文献又は当業者に公知の公的機関のデータベース又は本明細書に記載の塩基配列に基づき作製したプライマー又はプローブ等を用いて、当業者に公知の任意の方法で調製することが出来る。例えば、各種のPCR、並びに、その他のNASBA(Nucleic acid sequence based amplification)法、TMA(Transcription-mediated amplification)法及びSDA(Strand Displacement Amplification)法等の当業者に公知の任意DNA増幅技術を用いることにより、該遺伝子のcDNAとして容易に得ることが可能である。 或いは、上記遺伝子は当業者に周知の方法により、本明細書に記載のcDNAライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。更に、該遺伝子のcDNAに、当業者に公知の部位特異的突然変異誘発に基づき、市販のミューテーションシステム等を用いて塩基変異を導入して調製する
ことも可能である。 又、上記遺伝子は、公知の方法(例えば、Carruthers(1982)Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411-418;Adams(1983)J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov(1997)Nucleic Acid Res. 25:; Frenkel(1995)Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers(1994)Biochemistry 33:; Narang(1979)Meth. Enzymol. 68:90; Brown(1979)Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage(1981)Tetra. Lett. 22:1859; 米国特許第4,458,066号)に記載されているような周知の化学合成技術により、in vitroにおいて合成することもできる。また、本発明のポリヌクレオチドを適当な制限酵素で切断する等の方法によって作製することもできる。 本発明の遺伝子は、当業者に公知の任意の方法で未分化細胞に導入し、該細胞を形質転換し、或る条件下(例えば、テトラサイクリン制御)で各遺伝子が強制発現されるれた形質転換体を得ることが出来る。例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、トランスフェリン受容体を使用する方法、ペネ
トラチン等の膜透過性ペプチドを使用する方法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション及びパーティクルガン等の物理的方法、更には、レトロウイルス及びアデノウイルス等の適当なウイルスを用いる方法を挙げることが出来る。 上記の各種形質転換法に応じて、各遺伝子は、そのまま単独の形態(例えば、mRNA又はcDNA分子)、又は適当なベクター(同じベクター又は別のベクター)に組み込んで作製した発現用組換えベクターの形態で導入される。例えば、このようなベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウ
イルスベクター、及びアデノ随伴ウイルスベクター等の各種ウィルスベクター、非ウィルス型ベクター又は混成型ベクター等を挙げることが出来る。このようなベクターには、発現調節配列には、適当なプロモーター、エンハンサ、転写ターミネータ、タンパク質をコードする遺伝子における開始コドン(すなわ
ちATG)、イントロンのためのスプライシングシグナル、ポリアデニル化部位、及びストップコドン等の各種の遺伝子発現調節配列、クローニング部位、薬剤耐性遺伝子等の各種要素が適宜含まれており、当業者に公知の任意の方法で作製することができる。 更に、本発明の第三の態様として、異常の本発明方法で分化誘導された繊毛細胞に係る。このようにして得られた繊毛細胞は、例えば、繊毛を再生又は阻害させる薬剤のスクリーニング方法に有利に使用することが出来る。 本発明のスクリーニングは当業者に公知の任意の方法で行うことが出来る。本発明のスクリーニング方法により、繊毛を再生又は阻害させる薬剤(化合物)を同定することが出来る。該化合物は、ヒト等の生体内に元来含まれている物質、又は人工的に合成された物質でもよい。
本発明のスクリーニング方法は、例えば、以下の工程で実施することが出来る。
(a)繊毛細胞に被検化合物を接触させる工程、
(b)該繊毛細胞における繊毛の状態を観察又は測定する工程、及び
(c)該繊毛を再生又は阻害させる化合物を選択する工程、を含む前記方法。
上記スクリーニング方法においては、上記工程 (a)における繊毛細胞との接触は、該細胞の培養系に被検化合物を添加すること等の当業者に公知の任意の手段によって、これらを接触させることによって実施することが出来る。尚、繊毛の状態は、実施例に示したように、繊毛運動の観察、又は、繊毛を構成するタンパク質であるチューブリン(β-チュー
ブリンIV)や同じく繊毛に特有なタンパク質(マーカータンパク質)の遺伝子であるFoxj1の発現を測定すること等によって行うことが出来る。 以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例の記載によって何ら限定して解釈されるものではない。又、特に記載のない場合には、以下の実施例は、免疫染色及びReal-time PCR法を含む当該技術分野における常法及び当業者に公知の標準的な方法、例えば、Sambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New
York, N.Y, 1995等に記載されている遺伝子工学及び分子生物学的技術に従い実施した。又、本明細書中に参考文献などとして引用された文献の記載内容は本明細書の開示内容の一部を構成するものである。
以下、実施例に則して本発明を更に詳しく説明する。尚、本発明の技術的範囲はこれらの記載によって何等制限されるものではない。尚、本明細書中で引用される技術文献の内容は、本明細書の開示内容の一部と見なされる。
1.テトラサイクリン制御によるSmad6、Smad7、Foxj1、Foxa2発現ES 細胞の作製
テトラサイクリン制御による導入遺伝子発現ES細胞の樹立はMasuiらの論文に従った(Masui, S., Shimosato, D., Toyooka, Y., Yagi, R., Takahashi, K. and Niwa, H. (2005). An efficient system to establish multiple embryonic stem cell lines carrying an inducible expression unit. Nucleic Acids Res 33, e43.)。この発現系ではテトラサイクリンが存在する場合には導入遺伝子は発現せず、存在しない場合のみに発現する。本発明ではテトラサイクリン制御によるSmad6、Smad7、Foxj1、Foxa2発現ES 細胞を樹立した。
2.Smad6、Smad7、Foxj1、Foxa2-ES細胞の維持
Smad6、Smad7、Foxj1、Foxa2を発現するES細胞はそれぞれ薬剤耐性のマウス胚性繊維芽細胞[MEF(DR4;ATCC No. SCRC-1045)]上で維持した。MEFは10 μg/mlマイトマイシンC (Sigma) で2時間処理して細胞分裂を止めた後、0.1%ゼラチン (Sigma) コートした培養皿に 2×10 6
/10 cm培養皿の濃度で播種した。維持培地には15%の牛胎仔血清 (FBS; ES Invitrogen)、0.1 mMの非必須アミノ酸 (Sigma)、0.1 mMの b-メルカプトエタノール(sigma)、100 U/mlの ペニシリン (Sigma)、100 U/mlのストレプトマイシン (Sigma)、1,000 U/ml 白血病抑制因子 (LIF; Chemicon)、1.5 μg/ml ピューロマイシン (Sigma)、1 μg/mlテトラサイクリン (Sigma) を添加した高グルコースのDMEM (Invitrogen) を用いた。培地は毎日交換し、3日間ごとに継代を行った。
3.胚様体の形成および繊毛細胞の分化誘導
繊毛細胞へ分化させるためES細胞から胚様体を形成させた。胚様体とはin vitroでES細胞の細胞塊を形成させることで三胚葉に分化させたものである。胚様体を形成させるため、未分化維持したES細胞のコロニーを0.1%トリプシンおよび0.5 mg/mlのEDTAを含むリン酸緩衝液で処理し、解離させた。解離した細胞を培養皿に播種し、30分間培養した。この操作によってMEFは培養皿に接着するが、ES細胞は浮遊したままの状態になる。この培養上清のみを回収することによりES細胞とMEF(マウス胚性繊維芽細胞)を分離することが
できる。得られたES細胞を丸底の低接着性の96穴プレートに1穴あたり2000細胞になるように播種し、3日間培養し胚様体を形成させた。培地には10%のFBS (Invitrogen)、100 U/mlのペニシリン, 100 U/mlのストレプトマイシン、1.5 μg/ml ピューロマイシン、1 μg/mlのテトラサイクリンを添加した低グルコースのDMEM (Invitrogen) を用いた。この時点ではSmad6、Smad7、Foxj1、Foxa2を発現させていない。形成させた胚様体をゼラチンコートした培養皿に移し、接着培養を行った。培地には10%のFBS、100 U/mlのペニシリン, 100 U/mlのストレプトマイシン、1.5 μg/ml ピューロマイシンを添加した低グルコースのDMEM (Invitrogen) を用いた。この接着培養時からSmad6、Smad7、Foxj1、Foxa2を発現させた。
4.繊毛細胞の分化(BMPシグナルの阻害)
Smad6またはSmad7でBMPシグナルを抑制したところ、これまで繊毛細胞の分化が起こらなかったFBSを含む培地においても繊毛細胞を分化誘導することができた(図1)。
分化誘導された繊毛細胞では繊毛運動が観察された。免疫染色法にて分化誘導された繊毛細胞は繊毛の構成タンパク質であるbeta-tubulin IVを発現することが確認できた(図1および図2左)。また、分化誘導された繊毛細胞は脳室の繊毛細胞で発現することが知られているMusashi1を発現していたことから、脳室の繊毛細胞であることが示された(図2右)。更に、Smad7でBMPシグナルを抑制したところ、Real-time PCR法で繊毛細胞に特有な遺伝子であるFoxj1やbeta-tubulin IV、Centrin4の著しい発現上昇が認められた(図3)。
5.繊毛細胞の分化 (Foxj1, Foxa2) の発現
繊毛形成に必須の遺伝子であるFoxj1又は呼吸器上皮の分化に重要な働きを持つFoxa2を発現させたところ、これまで繊毛細胞の分化が起こらなかったFBSを含む培地においても、繊毛細胞を分化誘導することができた(図4、5)。更に、Real-time PCR法でFoxj1やbeta-tubulin IV、Centrin4の著しい発現上昇が認められた(図6,7)。
本発明に従い、FBSを用いた培養系ではBMPシグナルを抑制することにより、脳室特異的な繊毛細胞を分化誘導することが出来る。脳室の繊毛細胞は脳脊髄液を循環させる働きを持っており、機能が阻害されると水頭症を発症する。BMPシグナルの阻害によって誘導された脳室の繊毛細胞は移植するこ
とで水頭症を治療できる可能性がある。 更に、Foxa2は呼吸器系上皮で発現する遺伝子であり、Foxa2によって誘導された繊毛細胞は呼吸器系である可能性がある。呼吸器系の繊毛細胞は異物を排出する働きを担っており、機能が阻害されると気管支拡張症などの重篤な疾患が引き起こされる。気管支拡張症の根本的な治療法は確立されて
いないが、本発明で誘導された繊毛細胞を移植することで根本的な治療を行うことができる可能性がある。
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