脑脊液单核细胞内PPD和ESAT-6抗原检测对结核性脑膜炎诊断价值的探讨--《河北医科大学》2010年硕士论文
脑脊液单核细胞内PPD和ESAT-6抗原检测对结核性脑膜炎诊断价值的探讨
【摘要】：
目的:结核性脑膜炎(tuberculous meningitis,TBM),约占肺外结核的7-10% [1],是由结核杆菌引起的中枢神经系统感染性疾病,致残率和致死率较高,其预后与早期诊断及时治疗密切相关。但结脑的诊断,尤其是早期诊断比较困难,因为结脑患者的脑脊液(CSF)中结核杆菌的数量很少,脑脊液涂片抗酸染色阳性率很低约为10%,而结核菌培养所需时间(4～8周)较长,且阳性率仅20～30%[2],对临床早期诊断价值有限。相关性研究表明结核抗原存在可以作为结核菌存在的证据[3],因而检测脑脊液(cerebrospinal fluid CSF)中的结核抗原对TBM的诊断很有价值。免疫组化法检测脑脊液单核细胞内结核菌素纯蛋白衍生物(protein purified derivative, PPD)实验,对临床诊断TBM具有一定的参考价值,但此抗原尚有一些不足之处。PPD为成分不明确的复合抗原(多克隆),存在一定的假阴性和假阳性,因此寻找一种独特的抗原对TBM的诊断非常必要。早期分泌性抗原靶6 (6Kd early secretory antigenic target ,ESAT-6)为结核分枝杆菌感染早期所分泌的蛋白,具有高度的分布特异性和良好的免疫原性,当结核杆菌在感染的单核巨噬细胞内生长时, ESAT-6抗原表达量明显提高,因此采用单克隆抗体(免疫组化法)检测脑脊液单核细胞内ESAT-6可能会增加诊断结脑的敏感性和特异性。本课题研究的目的是将ESAT-6与PPD对结核性脑膜炎的诊断价值进行比较,为结核性脑膜炎的诊断提供有效的方法。
方法:将2009年1月～2009年7月神经内科住院的40例病人分为两组,一组为结脑组:入选标准参考Ahuja[3]的临床诊断标准,共20例,男8例,女12例,年龄2-59岁,中位值年龄24.5岁,其中单纯结脑16例,合并颅外结核者4例。另一组为对照组:共20例,男9例,女11例,年龄1-59岁,中位值年龄26岁。根据第五版神经病学诊断标准入选,其中化脓性脑膜炎5例,新型隐球菌脑膜炎2例,病毒性脑膜炎8例,脑囊虫病1例,脑肿瘤2例(听神经瘤1例,肺癌脑转移1例),脊髓炎1例,布氏杆菌病1例。对所有患者均进行脑脊液常规、生化、细胞学检查(MGG染色)和阿利新兰染色。取脑脊液1ml,用Therm-4 Shandon Cytospin型玻片离心机(购自英国)离心玻片3张,用免疫组化的方法检测单核细胞内的PPD和ESAT-6抗原。将沉淀有细胞的玻片放入中性甲醛中固定10分钟,然后用蒸馏水冲洗,0.01MPBS浸泡5分钟,3%H2O2去离子水孵育10分钟,以消除内源性过氧化物酶活性。滴加封闭用山羊血清工作液室温孵育15分钟倾去。一张玻片滴加适当比例稀释的单克隆鼠抗人ESAT-6抗体(购自美国ADL公司),另一张滴加兔抗结核分枝杆菌多克隆抗体(购自美国Abcom公司),以PBS缓冲液代替一抗为阴性对照。4℃冰箱孵育过夜。PBS冲洗3次每次3分钟。滴加生物素化二抗(购自中杉金桥公司)工作液室温孵育15分钟,PBS冲洗3次,每次3分钟,滴加辣根酶标记的链酶卵白素工作液, 37℃孵育15分钟,PBS冲洗3次每次3分钟,显色剂显色(DAB)5分钟,流水冲洗10分钟。苏木素染色3分钟,自来水冲洗浮色。光学显微镜(OLYMPUS-BX41日本)下观察,脑脊液图文分析仪(MCDS-2020重庆)采图判读结果,单核细胞胞浆呈棕色为阳性结果,单核细胞胞浆无色为阴性结果。
1临床资料:结脑组患者发热及意识障碍发生率分别为100%, 65%,对照组为70%, 25%,两组之间差异显著,而头痛、恶心呕吐、颅高压、脑膜刺激征、脑局灶体征、脑电图两组无明显差别。
2脑脊液常规、生化:结脑组白细胞数3～14000个/mm3,平均为952.5±3086个/mm3,糖0.8～4.1 mmol/L,平均为1.76±0.735mmol/L;蛋白含量0.61～2.39 g/L,平均为1.35±0.53/L;氯化物96～122.4 mmol/L,平均为110.9±8.46mmol/L;对照组细胞数0～2980个/mm3,平均为352±717.02个/mm3;糖0.09～4.7 mmol/L,平均为2.866±1.089 mmol /L;蛋白0.08±4.95 g /L,平均为0.973±1.356 g /L,氯化物由106～142.0 mmol/L,平均为120.96±9.45 mmol/L。结脑组较对照组糖和氯化物明显降低,而白细胞数和蛋白无明显差别。
3细胞学表现:结脑组脑脊液细胞学20例全部为混合细胞反应,均未见肿瘤细胞且阿利新兰染色阴性。对照组中混杂细胞学9例,淋巴样细胞反应5例,正常细胞学反应2例,激活单核细胞样细胞学反应2例,中性粒细胞反应2例,隐球菌脑膜炎者细胞学及阿利新兰染色均找到隐球菌。脑囊虫病嗜酸性粒细胞明显增多。肿瘤患者找到肿瘤细胞且激活单核细胞增多。在动态观察中显示结脑病人随治疗好转中性粒细胞逐渐减少,但持续较长时间,同时激活的淋巴细胞、单核细胞逐渐增加,浆细胞出现,这与结脑动态变化相符。
4单核细胞内ESAT-6抗原:可在脑脊液中检测到单核细胞内的ESAT-6,大多数单核细胞都有较强的胞浆染色,且多次检测可持续阳性,激活单核细胞较少染色或染色较浅。20例TBM患者中14例ESAT-6抗原阳性,6例阴性,对照组中仅1例病毒性脑膜炎患者阳性,此方法诊断TBM敏感性为70%,特异性为95%,约登指数0.65。在20例TBM病人中,最早发病5天,最晚发病120天可检测出胞内ESAT-6。
5单核细胞内PPD抗原: 20例TBM患者中13例PPD抗原阳性,7例阴性,对照组中2例病毒性脑膜炎患者阳性,18例阴性。此方法诊断TBM敏感性为65%,特异性为90%,约登指数0.55。
6 ESAT-6及PPD诊断TBM比较:敏感性P0.05,特异性P0.05,二者之间敏感性和特异性均无统计学差异。
1结脑患者临床表现较重,常伴有发热及意识障碍。结脑患者临床表现复杂多样与其他神经系统疾病较难鉴别。
2脑脊液生化可为结脑诊断提供一定依据,但脑脊液常规意义较小。
3脑脊液细胞学对结脑的诊断和鉴别诊断具有重要参考价值。
4结脑患者脑脊液单核细胞内存在ESAT-6抗原。TBM组与对照组比较ESAT-6阳性率差异显著,说明该方法对诊断和鉴别诊断TBM方面有意义。
5检测单核细胞内单克隆ESAT-6抗原与检测单核细胞内多克隆PPD抗原相比其敏感性、特异性无显著差别,可能是病例数少所致。但ESAT-6抗原的约登指数高于PPD抗原的检测,两种方法的优劣有待于扩大病例数进一步比较。
【关键词】：
【学位授予单位】：河北医科大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2010【分类号】：R529.3【目录】：
中文摘要4-7
英文摘要7-12
研究论文 脑脊液单核细胞内PPD和ESAT-6抗原检测对结核性脑膜炎诊断价值的探讨12-31
材料与方法13-16
参考文献27-31
个人简历41
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结核性脑积水的诊疗分析 【神经外科讨论版】
探索结核性脑积水的诊断与治疗。方法
回顾性分析本科自2000年6月～2005年5月收治41例结核性脑积水治疗病例。临床表现头昏、头痛、恶心、呕吐41例，发热41例，视物不清15例，肢体无力9例，意识障碍9例。脑脊液检查抗酸染色阳性8例，蛋白升高39例，单核细胞升高41例，糖含量减少32例；所有病例行异胭肼、利福平、乙胺丁醇或异胭肼、利福平、吡嗪酰胺三联抗痨治疗 资料来源 :医 学 教 育网 。抗结核治疗时间为半年到1年。25例（60%）加用激素治疗。对34例交通性脑积水和3例梗阻性脑积水行手术治疗。交通性脑积水采用脑室-腹腔分流或脑室外引流术；对结核球导致阻塞性脑积水，采用结核球切除+脑室-腹腔分流术。结果
单纯药物治疗轻症患者4例，3例缓解（75%），脑积水药物+手术治疗37例患者，24例（64.8%）缓解,12例（32.4%）无变化，1例死亡。结论
结核性脑积水诊断主要依据临床表现、病史、影像学表现，脑脊液抗酸染色检查。在MRI成像中脑膜增强，颅底结核渗出物增强为特征性表现。脑脊液抗酸染色单次不易找到抗酸杆菌，故应反复查找。毛玻璃样脑脊液为结核感染脑脊液特征性表现。脑脊液检查以单核细胞数均升高为主，大多生化检查高蛋白、低糖、低氯化物改变。结核性脑积水早期获得诊断，给予正规抗结核治疗的同时给予分流手术有利于改善预后。对于颅压升高不明显病人，可单纯药物治疗。对脑积水严重，颅压升高病人，在正规抗结核的前提下，应积极手术治疗。　　【关键词】
中枢神经系统；
治疗分析 　　结核性脑膜炎是致死率、致残率高的中枢神经系统疾病，占神经系统各部位结核病的70％左右。而由此所导致脑积水更应引起高度重视。本文回顾性分析了本科自2000年6月～2005年5月收治41例结核感染所致脑积水病例，就其发病机制探讨、治疗、预后报道如下。　　1
资料与方法　　1.1
资料来源 :医 学 教 育网 　　41例脑积水患者（男20例，女21例），均经脑脊液常规、生化检验证实，8例经脑脊液涂片抗酸染色确诊，并经头颅CT或MRI检查，38例为交通性脑积水，3例为阻塞性脑积水。我们将病变阻碍或阻断脑脊液循环发生在脑室系统之内视为阻塞性脑积水, 阻塞发生在脑室系统外即第四脑室以下, 而且阻断脑脊液的循环通路视为交通性脑积水。本组患者年龄2～53岁，病程为半个月～3年。　　1.2
　　全部病人均有头晕、头痛、恶心、呕吐、发热表现，伴肢体活动障碍9例，意识障碍9例，视物模糊15例，伴活动性肺结核者15例。　　1.3
实验室检查
　　腰穿提示20例颅内压&200mmHg，21例在正常范围。全部41例患者均行反复脑脊液离心后涂片找抗酸杆菌，其中8例呈阳性。脑脊液清澈透明者15例，毛玻璃样26例。腰穿CSF蛋白含量0.37～7.3g/L，升高者39例；全部41例患者单核细胞数均升高，为9.6×106／L ～6.4 ×109／L，其中1.5 ×109／L以上17例；糖定量低于2.25mmol／L者32例，低于1.12mmol／L以下17例，正常9例；37例氯化物低于120mmol／L。　　1.4
影像学检查
　　结核性脑膜炎在MRI表现和CT基本相似，主要表现为基底池渗出及颅内结核瘤形成［1］。头颅CT平扫时可见脑室扩张，同时19 例表现颅底各池、外侧裂模糊，边界欠清，和由于室管膜结核渗出物形成的脑室旁软化灶，提示存在缺血性脑梗死。增强可见脑膜增强，最常见于蛛网膜下腔基底池、大脑纵裂及脑干周围。在MRI成像中，可出现脑神经增厚，颅底结核渗出物增强。阻塞性脑积水2例阻塞部位在中脑水管，1例为小脑结核球压迫第四脑室所致。　　1.5
治疗方法　　1.5.1
　　30例（73%）行异胭肼、利福平、乙胺丁醇三联抗痨治疗。11例（27%）口服异胭肼、利福平、吡嗪酰胺三联抗痨治疗。25例（60%）行激素治疗。抗结核治疗时间为半年～1年。　　1.5.2
　　共37例，包括34例交通性脑积水和3例梗阻性脑积水患者。21例（61%）交通性脑积水采用脑室-腹腔分流术（V-P分流），13例（39%）行脑室外引流术；3例结核球导致阻塞性脑积水患者中，2例采用V-P分流+结核球切除术，1例行结核球切除术+侧脑室外引流术+后颅窝去骨瓣减压术。 　　1.6
　　为观察治疗前后脑室扩张的变化及CSF 的改变情况, 全部患者在治疗后第2周～6个月时复查脑CT 或MRI，13例行腰穿或分流泵穿刺取CSF进行常规、生化及涂片镜检。　　2
结果 & 单纯药物治疗轻症患者4例，3例缓解（75%），1例（25%）无明显变化。其中头昏、头痛、恶心、呕吐等高颅压症状缓解75%，发热缓解75%，脑室扩张缓解约75%。脑积水药物+手术治疗37例患者，24例（64.8%）缓解,12例（32.4%）无变化，1例死亡。其中高颅压症状缓解73.5%，发热缓解76.4%，神经功能障碍缓解43.3%。脑脊液抗酸染色缓解率为100%，蛋白含量恢复正常范围率为66.6%，单核细胞数恢复正常率为64.7%，糖含量恢复正常率为64.2%，氯化物恢复正常率为68.7%。脑室扩张缓解率为70.5%。治疗前后患者临床表现见表1。表1
结核性脑积水患者治疗前后临床表现（略）备注：括号前为治疗前有此表现人数，括号内为治疗后有此表现人数　　3
讨论　　结核性脑膜炎是特异性炎症性病变，对脑膜、脑实质、脑血管均有炎症刺激和损害作用，使其出现组织充血、渗出、水肿及变态反应。脉络丛受炎性刺激，分泌量增多，含有大量纤维蛋白的炎性脑脊液进入脑室及蛛网膜下腔，阻塞室间孔、中脑导水管或结核球压迫第四脑室致阻塞性脑积水。初期结核瘤增生性结核结节，以后中心出现干酪坏死并有不同程度液化，周围炎性细胞浸润和形成包膜从而形成结核性脑脓肿［2］。而炎性脑脊液可导致脑蛛网膜粘连及蛛网膜粒阻塞，脑脊液回吸收障碍，导致交通性脑积水发生。在本组病例中，我们将病变阻碍或阻断脑脊液循环发生在脑室系统之内视为阻塞性脑积水, 阻塞发生在脑室系统外即第四脑室以下, 而且阻断脑脊液的循环通路时视为交通性脑积水。长期脑积水脑室扩张压迫周围脑组织和脑静脉，静脉回流障碍加重脑间质水肿，动脉供血减少造成脑缺血缺氧、ATP大量消耗，神经细胞钠泵障碍导致细胞性脑水肿。不仅影响大脑的营养代谢，而且颅压增高易压迫颅底神经，致脑实质萎缩。从而出现临床常见的面瘫、失明、眼球外展不能、智力低下、失语、肢体瘫痪等症。 &
由于结核性感染后炎性渗出物中的纤维蛋白在蛛网膜粒堆积，造成脑脊液循环通路梗阻，进入到脑脊液中的抗痨药物浓度低，不能达到治疗效果，因此结核性脑膜炎患者一旦出现脑积水表现，为减低颅内压、避免脑疝形成，同时也为了使抗痨药物进入脑内起到更好的杀灭细菌的作用，一般需要在充分药物抗痨的基础上辅以手术治疗。对于常采用的手术治疗方法是脑室外引流术和脑室-腹腔分流术（V-P分流）。脑室-腹腔分流能迅速解除脑积水，降低颅内压，避免脑疝，消除血管源性脑水肿，有利于患者安全地度过严重的颅内高压期，降低结核性脑膜炎的病死率。但有人认为，处于急性期或抗痨治疗不充分的情况下，顾虑到炎症易扩散和分流管易阻塞，不应主张行脑室-腹腔分流术，而应先行脑室外引流术。本组病例采取了两种手术方式。对于病情急，处于结核急性期，抗痨不充分者（刚开始甚至还未开始）或来院时颅内压可能已经很高的病例，我们主张急症行脑室外引流术，以解除可能出现的脑疝，降低死亡率。而对于病程相对较长，病情允许的情况下，我们先选择足量、正规三联抗痨治疗，等一般情况稳定后择期行脑室-腹腔分流术。Ersahin［3］等认为高浓度脑脊液蛋白可以导致分流系统阻塞，有人［4］用基础实验证明，脑脊液高蛋白并不导致分流无效的产生。我们对21例患者采取了V-P分流术，术后2例患者由于分流管腹腔端阻塞进行了第2次分流手术，术后恢复通畅。未见顽固性阻塞病例。　　本组病例中，我们对4例病程短、脑积水轻的患者采取了单纯药物抗痨治疗，病情均很快得到控制，半年以后复查头部CT或MRI发现3例患者脑积水明显改善，1例无明显变化，CSF常规、生化检查3例恢复正常。对于轻症结核性脑积水，予单纯抗结核治疗，有助于缓解颅内炎症，减少炎性渗出，故我们采用单纯抗结核治疗。对于病情进展快，病情较重的患者，因已形成蛛网膜下腔堵塞，故我们对于13例患者采取了脑室外引流术，其中8例患者治疗反应良好，高颅压症状明显改善，实验室检查及影像学检查与临床表现一致。1例于手术后3天时死亡，尸检大体标本可见脑干腹侧大量炎性渗出，脑水肿明显，脑积水基本缓解，分析其死因为炎症严重，脑干功能衰竭有关。21例患者采取了V-P分流术，术后14例患者各种临床指标均明显改善，7例无改善，其中2例患者由于分流管腹腔端阻塞进行了第2次分流手术，术后恢复通畅，均未出现结核腹腔播散病例。所有手术病例均在术前或术后进行足量、正规抗痨治疗。因此，我们认为对于结核性脑积水，在抗结核的同时，积极给予手术治疗，有助于改善预后。　　对于颅内炎症未能切实控制之前即采取脑室-腹腔分流术，历来存在很多争议，焦点集中在这种手术会不会引起炎症播散，形成腹腔内和手术走行路径中的结核病灶。故有人［5］建议分期脑室-腹腔分流术治疗结核性脑积水。国外文献报道［6］，结核脑膜炎病人抗结核治疗12个月后有33%的患者，从脑脊液分离出结核分支杆菌。在我们进行脑室-腹腔分流术的21例病例中有15例患者在术后行腰穿脑脊液离心涂片镜检出抗酸染色，但经过术后积极地抗痨治疗，最终无一例出现结核播散症状。其原因考虑为以下两方面: （1） 结核杆菌多粘附于脑膜上,存活在脑脊液中较少; （2）大多数抗结核药物在血中的浓度是脑脊液中浓度的2～4 倍,使少量因分流术而到达腹腔的结核杆菌较在脑内容易被杀灭。因此,在保持血中有效的抗结核药物浓度情况下, 分流术后一般不会并发结核性腹膜炎。Kawajiri也有类似报道:对于结核性脑膜炎活动期的脑积水,在抗结核药物治疗的基础上行脑脊液分流术是可行的。　　【参考文献】　　1
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潭毓玲. 南印度经治儿童结核性脑膜炎远期随访.国外医学?神经病学神经外科学分册，.　　作者单位： 1 400802 重庆，重庆市南桐总医院外一科　　　　　　　　2 400038 重庆，第三军医大学西南医院神经外科。