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淫羊藿苷对大鼠骨髓间充质干细胞迁移作用的影响
摘要：目的 探讨淫羊藿苷调控大鼠骨髓间充质干细胞（MSC）迁移作用机制。方法 CCK-8法检测细胞增殖。建立体外细胞缺糖缺氧模型，Hoechst33342染色观察细胞凋亡。Western blot检测淫羊藿苷处理后MSC表面基质细胞衍生因子l（SDF-1）受体趋化因子受体4（CXCR4）的蛋白表达。Transwell小室跨膜实验观察淫羊藿苷对MSC迁移的作用。结果 0.01、0.1、1 μmol/L淫羊藿苷可明显促进MSC增殖，10 μmol/L淫羊藿苷抑制MSC增殖。经体外缺糖缺氧处理后，0.1、1 μmol/L淫羊藿苷可明显抑制MSC凋亡。淫羊藿苷可显著促进MSC CXCR4的蛋白表达，同时可提高MSC跨膜迁移的数量。加入CXCR4拮抗剂AMD3100后，各组间细胞迁移数量无明显差异。结论 一定浓度淫羊藿苷可促进MSC的增殖、存活和迁移，SDF-1/CXCR4信号通路参与淫羊藿苷调控MSC迁移的作用。
　　关键词：淫羊藿苷；骨髓间充质干细胞；存活；迁移；信号通路 　　DOI：10.3969/j.issn.17.02.013 　　中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：（4-05 　　干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的原始细胞。在一定条件下，干细胞可以分化成多种功能细胞，成为治疗损伤性疾病极具潜力的疗法。在心 　　血管领域，近年来的临床研究表明，干细胞移植在一定程度上有利于心功能的恢复[1]。我们的研究发现，骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）移植可降低大鼠心肌梗死后梗死面积，促进血管新生和旁分泌[2-3]。然而，心肌梗死后局部微环境不利影响干细胞的存活，也限制了干细胞的迁移[4]。淫羊藿苷（icariin）是一种从淫羊藿中提取的异黄酮类化合物，可补肾壮阳、延缓衰老，增加心脑血管血流量、强心、降血压和抗心律失常[5]。淫羊藿苷不仅可诱导胚胎干细胞向心肌细胞分化[6]，还可以促进细胞增殖和抑制细胞凋亡[7-8]。最近的研究发现，淫羊藿苷可促进血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPC）的迁移，但其具体作用机制尚不明确[9]。基质细胞衍生因子l（stromal cell derived factor-l，SDF-l）/趋化因子受体4（CXCL receptor 4，CXCR4）信号通路在干细胞归巢、迁移和募集过程中发挥重要的调控作用[10]。因此，本研究探讨SDF-1/CXCR4信号通路在淫羊藿苷调控MSC迁移中的作用机制，为临床应用干细胞移植治疗心肌梗死等损伤性疾病提供实验数据。 　　1 实验材料 　　1.1 动物 　　SPF级雄性SD大鼠10只，体质量（200±50）g，上海中医药大学实验动物中心，动物许可证号SYXK（沪），购入后直接用于原代MSC培养。 　　1.2 主要试剂和仪器 　　胰酶、多聚赖氨酸、AMD3100和牛血清白蛋白（美国Sigma 公司），高糖DMEM和无糖DMEM培养基（美国Gibco公司），胎牛血清（美国Hyclone公司），CCK-8试剂盒、Hoechst33342、PMSF和RIPA裂解液（上海碧云天生物技术有限公司），Transwell小室和24孔板（美国Corning Costar公司），SDF-1α （美国PeproTech公司），CXCR4抗体、GAPDH抗体和HRP标记二抗（美国CST公司）。电泳仪和转膜仪（美国Bio-Rad公司），IX53显微镜（日本Olympus），细胞培养箱（美国Thermo Fisher公司）。 　　2 实验方法 　　2.1 骨髓间充质干细胞培养 　　将成年雄性SD大鼠脱颈处死，无菌条件下分离双侧股骨和胫骨。剪开骨两端的干骺端，暴露骨髓腔，用含有肝素的0.01 mol/L PBS冲洗骨髓腔至10 mL离心管内，1000 r/min离心8 min。吸去上清液，用含15%FBS DMEM培养液混悬沉淀，均匀接种至培养瓶中，37 ℃、5%CO2条件下培养。当细胞达到70%～80%汇合时，进行传代培养。 　　2.2 CCK-8法检测细胞增殖 　　取第5代MSC，用0.01 mol/L PBS漂洗后，经0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合消化液消化，收集细胞悬液，1000 r/min离心8 min，弃去上清液，加入新鲜培养液重新混悬沉淀后将细胞以5×104个/mL接种至96孔板中。用不同浓度的淫羊藿苷对MSC进行刺激，分为0.001、0.01、0.1、1、10 μmol/L淫羊藿苷组，未加淫羊藿苷处理的作为对照组。加入不同浓度淫羊藿苷处理48 h后，CCK-8法检测各组细胞吸光度（OD）值。取各组细胞，每孔加入10 μL CCK-8溶液，于细胞培养箱内继续孵育1 h后，于酶标仪波长450 nm处测定OD值。 　　2.3 体外缺糖缺氧模型建立 　　参照Hori O等[11]方法自制缺氧盒，并加以改进。在有机塑料盒的2个侧面各建立1个通气孔，分别用于进气和排气，将95% N2和5% CO2的混合气体通过进气孔通入缺氧盒中，通过排气孔将盒内气体抽空和连接测氧仪。实验分为对照组（未加淫羊藿苷）和0.01、0.1、1 μmol/L淫羊藿苷组。将细胞接种至24孔板内的灭菌盖玻片上，培养24 h后从培养箱内取出24孔板，吸去培养液，用0.01 mol/L PBS漂洗3次，更换无糖无血清的DMEM，淫羊藿苷组分别添加相应浓度的淫羊藿苷进行处理。然后将24孔板放入自制无菌缺氧盒中，密封盒盖，关闭通气孔。通过排气孔用50 mL注射器将缺氧盒中的气体尽可能抽空。然后密封排气孔，经通气孔通入体积分数为5% CO2和95% N2的混合气体，并通?^测氧仪检测盒中的氧气含量。当缺氧盒内氧浓度低于1%时迅速密封通气孔，然后将缺氧盒置于37 ℃下继续培养。
　　2.4 Hoechst33342染色 　　各组细胞经体外缺糖缺氧处理24 h后，弃去培养液，用0.01 mol/L PBS漂洗3次，加入4%多聚甲醛固定20 min，0.01 mol/L PBS漂洗3次后加入Hoechst33342染色液，室温孵育10 min，0.01 mol/L PBS漂洗3次，磷酸甘油封片，荧光显微镜下观察细胞核的形态。每孔随机选取5个视野，分别计数凋亡和全部细胞数。实验重复5次，计算细胞凋亡率。细胞凋亡率（%）=凋亡细胞数÷细胞总数×100%。 　　2.5 Western blot检测CXCR4蛋白表达 　　实验分为对照组和0.01、0.1、1 μmol/L淫羊藿苷组。将MSC接种至6孔板中，不同浓度淫羊藿苷处理48 h，吸去上清液，经0.01 mol/L PBS漂洗3次，每孔加200 μL预冷的含PMSF的RIPA裂解液，充分裂解细胞后12 000 r/min离心15 min，取上清液。BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。取各组蛋白30 μg，加入5×SDS上样缓冲液，于沸水中煮5 min使蛋白变性。上样后行电泳，至溴酚兰刚跑出时终止电泳，经半干转转膜仪转膜，20 V条件下转印60 min，使胶内蛋白充分转移至PVDF膜上。将膜用PBST浸湿后，移至含5%脱脂奶粉的平皿中，室温脱色摇床上摇动封闭1 h。加入CXCR4抗体（1∶2000）、GAPDH抗体（1∶5000），4 ℃脱色摇床上孵育过夜。PBST室温清洗3次，每次10 min。加入HRP标记的二抗（1∶10 000），室温脱色摇床上摇动孵育2 h。PBST清洗3次后，ECL发光，化学发光成像仪上直接成像并拍照。 　　2.6 Transwell小室跨膜实验 　　实验分对照组和0.01、0.1、1 μmol/L淫羊藿苷组及0.01 μmol/L淫羊藿苷+1 μg/mL AMD3100组、0.1 μmol/L淫羊藿苷+1 μg/mL AMD3100组。Transwell小室（8 μmol/L）检测细胞迁移。培养时Transwell小室置于24孔板，将600 μL含100 ng/mL SDF-1α的DMEM添加到小室的下池。将各组MSC（1×105）混悬于200 μL含0.1%BSA的DMEM中，加入培养小室内，置5% CO2培养箱培养24 h。弃去孔中DMEM，用棉签小心将小室膜上表面细胞擦去，用4%多聚甲醛固定10 min，结晶紫常温染色10 min，蒸馏水充分洗涤后，显微镜下观察并拍照，计数表面细胞的数量。 　　3 统计学方法 　　采用SPSS21.0统计软件进行分析。实验结果以―x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。 　　4 结果 　　4.1 淫羊藿苷对骨髓间充质干细胞增殖的影响 　　0.001 μmol/L淫羊藿苷对MSC的增殖无明显影响。0.01、0.1、1 μmol/L淫羊藿苷均可促进MSC增殖（P<0.01），其中1 μmol/L淫羊藿苷促进MSC增殖的作用最明显，与0.01、0.1 μmol/L组比较，差异均有统计学意义（P<0.01）。10 μmol/L淫羊藿苷则对MSC具有一定的细胞毒性作用，可显著抑制MSC的增殖。结果见图1。 　　4.2 淫羊藿苷对骨髓间充质干细胞凋亡的影响 　　经缺血缺氧处理24 h后，对照组中有大量的MSC细胞核表现出典型的凋亡形态，染色质发生固缩或断裂为大小不等的片段，有的出现凋亡小体，镜下可见细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染。加入不同浓度淫羊藿苷可减少凋亡MSC的数量。0.01 μmol/L淫羊藿苷组与对照组比较，凋亡细胞数量无明显差异，而0.1 μmol/L或1 μmol/L淫羊藿苷可明显抑制MSC的凋亡（P<0.05，P<0.01）。1 μmol/L淫羊藿苷组发生凋亡的MSC数量最少，与0.1 μmol/L淫羊藿苷组比较差异有统计学意义（P<0.05）。 　　4.3 淫羊藿苷对骨髓间充质干细胞CXCR4蛋白表达的影响 　　与对照组比较，0.01 μmol/L或0.1 μmol/L淫羊藿苷组CXCR4的蛋白表达有升高趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）。1 μmol/L淫羊藿苷可促进CXCR4蛋白表达，明显高于对照组和0.1 μmol/L淫羊藿苷组（P<0.05，P<0.01）。 　　与对照组比较，0.01 μmol/L淫羊藿苷处理不能提高MSC跨膜迁移的数量。0.1、1 μmol/L淫羊藿苷组迁移细胞数量均明显高于对照组（P<0.05，P<0.01）。与0.1 μmol/L淫羊藿苷组比较，1 μmol/L淫羊藿苷组迁移细胞数量增加明显（P<0.01）。加入AMD3100后，0.1、1 μmol/L淫羊藿苷促进MSC迁移能力被削弱。各浓度淫羊藿苷+AMD3100组之间细胞迁移数量无明显差异。与1 μmol/L淫羊藿苷组比较，1 μmol/L淫羊藿苷+AMD3100组迁移细胞数明显减少（P<0.01）。 　　5 讨论 　　干细胞领域的兴起与快速发展为心肌梗死等缺血性心肌病的治疗带来曙光。通过中药复方或有效成分处理可促进干细胞增殖、存活、迁移和分化等，为解决干细胞移植面临的问题提供思路和方向。淫羊藿具有补肾阳、坚筋骨、强心的功效。淫羊藿苷作为淫羊藿的主要活性成分，在心血管方面具有多种药理活性。研究表明，淫羊藿苷不仅对异丙肾上腺素所致大鼠急性心肌缺血具有一定的保护作用[12]，还可以保护缺血再灌注引起的心肌损伤，缩小心肌梗死面积[13]。本研究发现，一定浓度的淫羊藿苷可明显促进MSC的增殖，但高浓度的淫羊藿苷却对MSC的活性有明显的抑制作用，这与文献[7]报道一致。10 μmol/L淫羊藿苷对MSC活性的抑制作用可能是该浓度淫羊藿苷具有较大的细胞毒性。我们以前的研究也发现，高浓度的丹酚酸B对MSC也有一定的细胞毒性，明?@抑制MSC的增殖[2]。因此，在选择中药或其有效成分处理干细胞时，首先要考虑不同浓度对细胞活力的影响。
　　干?胞移植后在移植部位停留和存活是治疗成功与否的关键所在。绝大部分的干细胞在移植到心肌局部缺血缺氧环境后出现凋亡、坏死或直接丢失，这也是目前制约干细胞治疗的瓶颈所在。淫羊藿苷可通过抑制活性氧依赖的JNK/NF-κB减少H9c2大鼠心肌细胞凋亡[14]。本实验通过体外建立缺糖缺氧模型，研究淫羊藿苷对大鼠骨髓MSC抗缺血缺氧的保护作用。经缺血缺氧处理24 h后，对照组大量MSC细胞核表现出明显的凋亡形态变化。而在0.1 μmol/L或1 μmol/L淫羊藿苷组，大部分细胞仍保持较好的形态，凋亡细胞数目明显减少。以上结果提示，缺糖缺氧处理可导致MSC产生细胞凋亡，而适当浓度的淫羊藿苷有助于细胞对抗缺血缺氧微环境，提高其存活能力。有研究表明，淫羊藿苷可显著抑制H2O2诱导的EPC凋亡，其机制可能与上调mTOR、p70S6K和4EBP1磷酸化水平和下调ATF2和ERK1/2蛋白表达水平有关[9]。然而，淫羊藿苷促进MSC存活的具体作用机制尚需进一步研究。干细胞存活后向梗死部位的迁移和募集也是影响干细胞移植效果的主要问题。干细胞移植后如在梗死部位或梗死边缘区域成簇存在，不仅不利于新生心肌细胞与宿主心肌之间的偶联，还有可能造成心律失常[15]。淫羊藿苷可以在体外增加EPC增殖和跨膜迁移的能力[9]。本研究发现，一定浓度的淫羊藿苷可以提高MSC的迁移能力。进一步研究发现，淫羊藿苷可以促进MSC表达趋化因子SDF-1的受体CXCR4，经CXCR4阻断剂AMD3100处理后跨膜迁移的MSC数显著降低，提示淫羊藿苷可通过SDF-1/CXCR4信号通路调控MSC的迁移。SDF-l与CXCR4特异性结合后，通过激活下游的二级信使，调控细胞迁移、凋亡、黏附等多种功能。SDF-l/CXCR4轴在组织缺血损伤和心肌再生修复中发挥重要作用，它参与调节组织缺血损伤后的血管新生和心肌梗死后的干细胞募集，在干细胞的动员、归巢、黏附、血管穿透和在靶器官内的增殖、存活的整个过程中发挥着重要作用。有研究表明，MSC在体外培养后，其表面受体CXCR4的表达水平逐渐降低，导致MSC向心肌组织的募集减少。研究发现，对急性大脑中动脉梗死大鼠灌胃低剂量淫羊藿苷可显著提高脑组织中SDF-1和CXCR4的表达，促进大鼠脑缺血后的神经功能恢复[16]。因此，移植淫羊藿苷预处理的MSC可能会提高干细胞治疗心肌梗死的效果。 　　综上所述，一定浓度的淫羊藿苷可促进MSC的增殖、存活和迁移。SDF-1/CXCR4信号通路参与淫羊藿苷调控MSC迁移的作用。本研究可为临床应用干细胞移植治疗心肌梗死等损伤性疾病提供实验数据参考。 　　参考文献： 　　[1] BEHFAR A， CRESPO-DIAZ R， TERZIC A， et al. Cell therapy for cardiac repair-lessons from clinical trials[J]. Nat Rev Cardiol， ）：232-246. 　　[2] GUO H D， CUI G H， TIAN J X， et al. Transplantation of salvianolic acid B pretreated mesenchymal stem cells improves cardiac function in rats with myocardial infarction through angiogenesis and paracrine mechanisms[J]. Int J Cardiol，（2）：538-542. 　　[3] GUO H D， WANG H J， TAN Y Z， et al. Transplantation of marrow-derived cardiac stem cells carried in fibrin improves cardiac function after myocardial infarction[J]. Tissue Eng Part A，/2）：45-58. 　　[4] ANVERSA P， NADAL-GINARD B. Myocyte renewal and ventricular remodelling[J]. Nature，（6868）：240-243. 　　[5] 王东芝，李东万，张守刚.淫羊藿在心血管疾病方面的研究进展[J].浙江中医药大学学报，）：107-110. 　　[6] LIANG X， HONG D， HUANG Y， et al. Icariin promotes expression of junctophilin 2 and Ca2+ related function during cardiomyocyte differentiation of murine embryonic stem cells[J]. Pharmazie， ）：804-809. 　　[7] FAN J J， CAO L G， WU T， et al. The dose-effect of icariin on the proliferation and osteogenic differentiation of human bone mesenchymal stem cells[J]. Molecules，）：. 　　[8] WANG Y K， HUANG Z Q. Protective effects of icariin on human umbilical vein endothelial cell injury induced by H2O2 in vitro[J]. Pharmacol Res，）：174-182.
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推荐： 　　　&&&&&&&&&&&&&&
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: &&&&DOI: 10.3969/j.issn.15.23.002
骨髓干细胞 bone marrow stem cells
p53抑制剂对扩增晚期人骨髓间充质干细胞活力的影响
贺泽斌，赵云鹤，杨桂姣，陆& 利
山西医科大学人体解剖学教研室，山西省太原市& 030001
Effect of p53 inhibitor on viability of human bone marrow mesenchymal stem cells in late-phase amplification&
He Ze-bin, Zhao Yun-he, Yang Gui-jiao, Lu Li &
Department of Human Anatomy, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
参考文献(0)
人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSCs)是间充质来源的多潜能干细胞，在不同的诱导条件下，可分化为神经细胞、心肌细胞和骨及软骨组织等[1-3]，因其易获得、易培养和低免疫原性，在组织工程学研究方面倍受关注。然而，新近的研究证明在体外扩增培养过程中人骨髓间充质干细胞出现复制性衰老[4]，限制了人骨髓间充质干细胞的临床应用，其潜在的调控机制亟待阐明。p53基因是一种抑癌基因，编码的P53蛋白能诱导激活下游P21蛋白，p53-p21通路在蛋白激酶CKⅡ抑制剂引起的细胞衰老过程中起关键作用[5]，那么p53基因是否与人骨髓间充质干细胞复制性衰老相关？为验证这一推测，作者比较了早、晚期人骨髓间充质干细胞衰老相关基因p53、p21和p15的表达差异，并检测p53抑制剂PFT-&对晚期人骨髓间充质干细胞的影响，寻求延缓人骨髓间充质干细胞衰老进程的有效手段。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：；骨髓干细胞；造血；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；
&设计：细胞学体外观察。
时间及地点：于/在山西医科大学解剖学实验室及中心实验室完成。
p53抑制剂干预后晚期人骨髓间充质干细胞活力检测所用主要试剂及仪器：
试剂及仪器&
胎牛血清&&&&&&
DMEM&&&&&&&&&
0.25%胰蛋白酶&&&&&&
PFT-&，&-半乳糖苷酶染色试剂盒，TUNEL检测液
碧云天生物技术研究所
RNAiso PLUS提取试剂盒，5&PrimeScript& RT Master Mix，SYBR&Premix Ex TaqTM试剂盒
TAKARA公司
CCK-8试剂盒&&&&&&&&&
酶标仪&&&&&&&&&
德国Thermo公司
倒置荧光显微镜&&&&&&
日本Olympus公司
人骨髓间充质干细胞购自 ScienCell Research Laboratory，标本采集自38岁健康男性青年捐献者。
实验方法：
细胞体外培养：人骨髓间充质干细胞接种于含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液，于37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱培养。在Olympus倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况，待贴壁细胞生长至90%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化，进行传代。依据体外传代次数将人骨髓间充质干细胞分为早期组(第3代或第4代)与晚期组(&10代)。
传代扩增晚期人骨髓间充质干细胞依照处理条件不同分为PFT-&组和二甲基亚砜对照组，其中PFT-&组每天用 20 &mol/L PFT-&作用4 h，连续2周，对照组加入等体积二甲基亚砜。
&qPCR检测衰老相关基因的表达：选取早期和晚期人骨髓间充质干细胞，按照 RNAiso PLUS提取试剂盒说明书提取细胞内总RNA，分光光度法检测RNA浓度和纯度，5&PrimeScript& RT Master Mix冰浴反转500 ng RNA，取 2 &L反转录产物cDNA，采用SYBR&Premix Ex TaqTM试剂盒配置反应体系，StepOnePlusTM System进行Real Time PCR扩增，采用??CT法进行相对定量分析。内参GAPDH引物序列为F：5&-GCA CCG TCA AGG CTG AGA AC-3&，R：5&-TGG TGA AGA CGC CAG TGG A-3&；目的基因p53引物序列为F：5&-GGA CCC TGT CAC CGA GAC CCC-3&，R：5&-GGG AGG AGA GTA CGT GCA CAT AAC AG-3&；目的基因p21引物序列为F：5&- GGA TGT CCG TCA GAA CCC AT-3&，R：5&- CCC TCC AGT GGT GTC TCG GTG-3&；目的基因p15引物序列为F：5&-TCT CCG TTG GCC GGA GGT CA-3&，R：5&-TGG CAG GGT CTG CGC AGT TG-3&，引物设计合成均由华大基因完成。
衰老相关&-半乳糖苷酶(SA-&-Gal)染色和衰老细胞计数：传代扩增晚期PFT-&组和二甲基亚砜组人骨髓间充质干细胞，制备细胞爬片，经PBS洗涤后，每孔加入1 mL &-半乳糖苷酶染色试剂盒固定液，室温固定15 min，弃去细胞固定液，PBS洗涤细胞3次，每次3 min，每孔加入1 mL染色工作液，37 ℃孵育过夜，普通光学显微镜下观察并计数胞浆被染成深蓝色细胞(即衰老细胞)的百分数。
TUNEL染色检测凋亡细胞：传代扩增晚期PFT-&组和二甲基亚砜组人骨髓间充质干细胞，用PBS洗涤细胞1次，40 g/L多聚甲醛固定细胞30-60 min，PBS洗涤后加入含0.1% Triton X-100的PBS冰浴孵育2 min，PBS洗涤2次，加50 &L TUNEL检测液，37 ℃避光孵育60 min，PBS洗涤3次，用抗荧光淬灭封固液封固后荧光显微镜下观察。
CCK-8法检测抗氧化应激损伤能力：传代扩增晚期PFT-&组和二甲基亚砜组人骨髓间充质干细胞，按照CCK-8试剂盒的操作步骤检测细胞的存活能力，将人骨髓间充质干细胞按1&103/孔接种于96孔板中，24 h后加入300 &mol/L H2O2作用30 min，随后更换为含10 &L CCK-8检测试剂的培养液，37 ℃培养箱孵育4 h，测定450 nm处吸光度。
主要观察指标：①倒置显微镜观察细胞形态。②实时荧光定量PCR技术检测衰老相关基因p53，p21，p15的表达水平。③传代扩增晚期PFT-&组和二甲基亚砜组人骨髓间充质干细胞的衰老细胞和凋亡细胞阳性率以及抗氧化应激损伤的能力。
统计学分析：结果采用SPSS 17.0软件进行统计分析，实验数据采用两独立样本t 检验，以x(_)&s表示，P & 0.05为差异有显著性意义。
人骨髓间充质干细胞是具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，广泛存在于全身结缔组织和器官间质中，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞[6]，并具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤后修复[7-8]。然而，组织工程需要高浓度细胞进行移植接种，源自体内的人骨髓间充质干细胞存在数量上的局限性，需经体外扩增后用于移植治疗[9-12]。伴随体外扩增传代次数增多，人骨髓间充质干细胞出现老化现象，细胞增殖和分化潜能下降，为细胞治疗的临床应用带来了困难[13-14]。因此，探索人骨髓间充质干细胞衰老的分子机制，研究开发延缓人骨髓间充质干细胞衰老的药物，维持人骨髓间充质干细胞活性将为衰老等相关疾病的防治提供理论基础和实验依据。
p53在细胞周期调节、分化、衰老、凋亡等多种生物过程中发挥重要作用[15]。Liu等[16-18]的研究结果表明p53基因沉默能够延缓细胞衰老进程，而p53基因过表达可引起细胞胞体增大、衰老标志物&-Gal活性上调、细胞增殖能力下降等老化征象。近期Peng等[19]研究发现成体皮肤干细胞等生长停滞、衰老、凋亡和功能障碍与p53基因信号的改变相关。本实验运用qPCR检测发现晚期人骨髓间充质干细胞中p53、p21、p15表达较早期组显著增高[20]，提示人骨髓间充质干细胞衰老，细胞活力降低可能与p53及其相关基因p21、p15激活有关。应用p53抑制剂PFT-&能够有效降低晚期人骨髓间充质干细胞中衰老标志物SA-&-Gal阳性细胞率，提示p53信号通路在人骨髓间充质干细胞复制性衰老中发挥关键性作用，抑制p53活性可延缓细胞老化。
氧化损伤是导致细胞衰老的重要因素。正常情况下，细胞内具有清除自由基的酶系统，氧化和抗氧化维持平衡[21-23]。氧化应激状况下，活性氧产生过多，过多的氧自由基攻击细胞膜上的多不饱和脂肪酸、蛋白、核酸等，引起严重DNA损伤，基因组不稳定和继发突变，促使细胞老化甚至凋亡[24-27]。本实验用300 &mol/L H2O2处理人骨髓间充质干细胞30 min，CCK-8法观察PFT-&对细胞抗氧化应激损伤的影响。实验结果发现，PFT-&组人骨髓间充质干细胞的细胞活力较二甲基亚砜组明显增高，表明PFT-&可提高细胞抗氧化应激损伤能力，从而有效延缓细胞衰老。细胞凋亡是基因调控的细胞程序性死亡，与细胞衰老密切相关。近期Li等[28-29]研究发现，降低p53活性可抑制DNA损伤和染色体突变，提高多能诱导干细胞生存率。Gu等[30]研究表明p53-p21通路与非肥胖型糖尿病小鼠来源的骨髓间充质干细胞凋亡相关，但本研究显示抑制p53活性对晚期人骨髓间充质干细胞凋亡无明显影响，提示晚期人骨髓间充质干细胞凋亡可能受多因素多信号通路调控，其原因有待进一步研究探讨。
研究结果表明p53信号通路激活可能是导致人骨髓间充质干细胞衰老的重要因素，应用p53抑制剂PFT-&能够增强晚期人骨髓间充质干细胞抗氧化应激损伤能力，从而延缓人骨髓间充质干细胞衰老进程，对维持干细胞活力推动其临床应用具有重要意义，但其具体分子机制仍有待深入研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：；骨髓干细胞；造血；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；
骨髓间充质干细胞的研究热点目前集中在解决其数量的稀缺性上，即如何快速、高效的进行体外扩增，同时保持干细胞的增殖活力及干性。大量研究表明人骨髓间充质干细胞体外扩增时出现复制性衰老的现象，极大的限制了这一种子细胞的临床应用。基因损伤、氧自由基的参与均为复制性衰老的机制提供理论支持，同时，也无法全面的解释这一现象的发生。因此，研究复制性衰老的机制及调控，阐明相关基因的作用途径，可为进一步抑制复制性衰老的发生奠定基础。P53作为衰老相关基因，已经成为突破这一技术瓶颈的重要备选靶点之一。本实验着重探讨p53抑制剂对扩增晚期人骨髓间充质干细胞活力的影响，为寻找延缓人骨髓间充质干细胞复制性衰老的关键靶点奠定一定的实验基础。
杂志出版内容重点：；骨髓干细胞；造血；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；
研究亮点: 1 运用qPCR方法检测比较了早、晚期人骨髓间充质干细胞中p53、p21、p15表达水平，发现人骨髓间充质干细胞衰老和活力降低可能与p53及其相关基因p21、p15激活有关。
2 p53抑制剂能否直接干预骨髓间充质干细胞活力及其可能的机制尚不完全清楚，实验应用p53抑制剂PFT-&能够有效降低晚期人骨髓间充质干细胞中衰老标志物SA-&-Gal阳性细胞率，增强晚期人骨髓间充质干细胞抗氧化应激损伤能力，表明抑制p53活性可延缓人骨髓间充质干细胞衰老进程，为进一步阐明衰老机制提供依据。&
杂志出版内容重点：；骨髓干细胞；造血；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；
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2.1& 体外扩增培养人骨髓间充质干细胞衰老相关基因的表达变化& 见图1。
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运用qPCR比较早、晚期人骨髓间充质干细胞衰老相关基因p15、p21、p53的表达变化，结果显示扩增晚期人骨髓间充质干细胞p15、p21、p53表达水平较早期显著增高，其中晚期人骨髓间充质干细胞p15 mRNA表达水平较早期细胞显著增高(1.45&0.23)倍(P & 0.05)，差异有显著性意义；晚期人骨髓间充质干细胞p21 mRNA表达水平较早期细胞显著增高(1.51&0.14)倍(P & 0.001)，晚期人骨髓间充质干细胞p53 mRNA表达水平较早期细胞显著增高(1.78&0.14)倍(P & 0.001)，差异有非常显著性意义。
2.2& p53抑制剂PFT-&对人骨髓间充质干细胞SA-&-Gal活性的影响& SA-&-Gal染色结果显示二甲基亚砜组阳性细胞着色较深(图2A)，阳性细胞率为(63&7)%(图2C)，而PFT-&组阳性细胞着色浅淡(图2B)，阳性细胞率为(41&5)%(图2C)，显著低于二甲基亚砜组(P & 0.05)，提示抑制p53活性能够延缓人骨髓间充质干细胞衰老进程。
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2.3& p53抑制剂PFT-&对人骨髓间充质干细胞凋亡的影响& TUNEL染色结果显示PFT-&组阳性细胞率(57.45&10.4)%与二甲基亚砜组(48.42&7.2)%相比较差异无显著性意义 (P & 0.05)，提示抑制p53活性并未影响晚期人骨髓间充质干细胞的凋亡(图3)。
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2.4& p53抑制剂PFT-&增强人骨髓间充质干细胞抗氧化应激损伤能力& 二甲基亚砜组与PFT-&组分别应用300 &mol/L H2O2处理30 min，CCK-8检测结果显示，PFT-&组细胞吸光度值是二甲基亚砜组的(1.27&0.13)倍(P & 0.001)，表明抑制p53活性能够增强人骨髓间充质干细胞抗氧化应激损伤能力(图4)。
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