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为兴趣而生，贴吧更懂你。或5现代免疫学62008年第28卷第3期#177#
M1和M2型巨噬细胞表型的比较分析
李 康,郭 强,王翠妮,陈 敏,徐 薇,熊思东
(复旦大学免疫生物学研究所,复旦大学上海医学院免疫学系上海200032)
摘要:通过对M1和M2型巨噬细胞表型相关指标的比较分析,评价各鉴定巨噬细胞类型的表型指标及其意义。按常规方法以IFN2C及LPS将骨髓来源巨噬细胞诱导成M1型巨噬细胞,以IL24诱导出M2型巨噬细胞。分别以RT2PCR和酶活性定量方法检测精氨酸代谢相关酶的表达和活性;以ELISA检测IL212和IL210的分泌;以FACS检测巨噬细胞膜分子的表达。结果显示:M1型巨噬细胞诱导性一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase,iNOS)表达和活性水平较未刺激组明显升高,IL212产生显著增加,CD16/32表达上调;而M2型巨噬细胞I型精氨酸酶(arginase1,Arg21)的表达水平和酶活性较未刺激巨噬细胞显著提高,IL210分泌轻度增加,并且表达高水平的CD206和DECTIN21。表型比较分析结果表明,iN2OS表达和活性、IL212的分泌和膜蛋白CD16/32可用于鉴定M1型巨噬细胞,而Arg21、CD206和DECTIN21是鉴定M2型巨噬细胞较为理想的表型指标。
关键词:M1型巨噬细胞;M2型巨噬细胞;表型分析中图分类号:R392.12
文献标识码:A
文章编号:08)
巨噬细胞作为一种具有可塑性和多能性的细胞群体,在体内外不同的微环境影响下,表现出明显的功能差异[1,2]。目前根据活化状态和发挥功能的不同,巨噬细胞主要可分为M1型即经典活化的巨噬细胞(classicallyactivatedmacrophage),和M2型即替代性活化的巨噬细胞(alternativelyactivatedmacrophage)[3,4]。在体外培养条件下,通过IFN2C及脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)诱导产生M1型巨噬细胞和通过Th2型细胞因子(如IL24、IL213等)诱导产生M2型巨噬细胞,具有与体内极化的巨噬细胞相似的表型和功能,已成为研究巨噬细胞异质性的重要手段。
在机体不同生理和疾病状态下,巨噬细胞表现出不同的类型,通过表型分析鉴定巨噬细胞类型已成为研究巨噬细胞功能多样性的主要方法。已有文献主要从精氨酸代谢途径、细胞因子分泌和表面分子的表达[9,10]等方面区分M1型与M2型巨噬细胞。然而,到目前为止,关于M1和M2型巨噬细胞的表型特征尚未统一。为了评价各种表型
收稿日期:基金项目:新缰医科
作者简介:李 康(19832),男,硕士,主要从事巨噬细胞免疫调节方面的研究。
通讯作者:熊思东(E2mail:);
指标及其意义,我们参照公认的经典的方法在体外诱导了M1型和M2型巨噬细胞,对M1和M2表型相关指标进行检测,进而相对量化地比较各表型指标,以期为体内外鉴定巨噬细胞类型时表型指标的选择提供实验依据。
1 材料与方法
1.1.1 实验动物 C57BL/6小鼠(H22b、4~6周龄,雌性),体重16~20g,购自上海斯莱克实验动物有限公司。清洁级饲养于复旦大学实验动物科学部。
1.1.2 主要试剂 细胞培养基RPMI1640(GibcoBRL公司),小牛血清(GibcoBRL公司),L2谷氨酰胺(L2Glutamine)(政翔化学试剂研究所),双抗(氨卞青霉素钠、硫酸链霉素)(上海第四制药厂),胰酶(华美生物工程公司);小鼠重组IFN2C(Pep2rotech公司),LPS(Sigma公司),小鼠重组IL24(Peprotech公司);TaqDNA多聚酶、dNTP等PCR试剂(Biostar公司),TRIzol(北京鼎国生物公司),DEPC(Genetimes公司),M2MuLVReverseTranscriptase(MBI公司);A2异亚硝基苯丙酮(A2isonitrosopropiophenone)(Sigma公司),Arginine(鼎国生物技术有限责任公司),NO检测试剂盒(Cayman公司);小鼠IL210ELISA检测试剂盒
[5,6][7,8]
共同通讯作者
#178#5现代免疫学62008年第28卷第3期
(eBioscience公司),小鼠IL212ELISA检测试剂盒(eBioscience公司);FITC标记的大鼠抗小鼠F4/80抗体(CALTAGLaboratories公司),PE标记的驴抗大鼠IgG(H+L)抗体(eBioscience公司),PE标记的抗小鼠CD16/32(FcCIII/FcCII受体,2.4G2)抗体(BDPharmingen公司),未标记大鼠抗小鼠CD206抗体(Serotec公司),未标记大
鼠抗小鼠MGL抗体由荷兰Erasmus医学中心Pi2eterLeenen教授惠赠,未标记大鼠抗小鼠DEC2TIN21抗体由南非CapeTown大学GordonBrown教授惠赠。
1.1.3 引物 由北京赛百盛公司合成,本实验所用引物见表1。
表1 引物序列
引物序列(F:正义链
PCR片段(bp)
退火温度(e)
F:52CTGCAGCACTTGGATCAGGAACCTGR:52GGAGTAGCCTGTGTGCACCTGGAAF:52CAGAAGAATGGAAGAGTCAGR:52CAGATATGCAGGGAGTCACCF:52CTGCACCACCAACTGCTTAGR:52GTCTGGGATGGAAATTGTGA
Arg2125059
GAPDH66056
1.2.1 骨髓来源巨噬细胞的诱导 改进的Vats
等[11]的方法,将小鼠颈椎脱臼处死后,无菌分离股骨和胫骨,用无菌2.5ml注射器吸入L929条件培养基(含有20%小鼠成纤维细胞株L929培养3d的上清、20%小牛血清、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素和2mmol/L谷氨酰胺的DMEM培养液),吹下骨髓内容物入一无菌平皿,并将细胞充分吹匀,在L929条件培养基中培养,7d后去除非贴壁细胞,再培养于完全RPMI1640培养基(含10%小牛血清、1000U/ml青霉素、100mg/ml链霉素和2mmol/L谷氨酰胺)中,1d后收集的贴壁细胞即为骨髓来源的巨噬细胞。
1.2.2 巨噬细胞的体外刺激 以0.25%胰蛋白酶消化收集诱导成熟的巨噬细胞,根据各实验要求铺于24孔或6孔细胞培养板中,参照Vats等的方法,以IFN2C(100U/ml)和LPS(5ng/ml)共同刺激培养24~96h,诱导出M1型巨噬细胞;参照Odegaard等的方法,以IL24(10ng/ml)刺激培养24~96h诱导出M2型巨噬细胞。
1.2.3 总RNA抽提及RT2PCR 提取方法参照试剂盒说明书进行,向刺激24h的细胞(约1@10)中加入1000LlTRIzol,立即用1ml注射器抽打5次;然后加入200Ll氯仿,混匀,室温静置15min后12000@g高速低温离心20小心将上层水相移至1.5ml离心管中加入500Ll异丙醇,振荡混匀。220e放置30min沉淀RNA,12000@g高速低温离心10小心弃去上清,
再在离心管中加入1ml75%乙醇,振荡片刻,8000@g低温离心5小心弃去上清,室温静置5~10min使RNA沉淀恰好干燥,加水溶解。将TRIzol抽提的细胞总RNA,以逆转录进行cDNA第一链的合成:1~5Lg总RNA中加1LlOligo(dT)15,70e5min,于冰上加入5@缓冲液3Ll,dNTP2Ll,RNasin0.5Ll,逆转录酶200U,加水至总体积15Ll,42e延伸60min后,70e10min。然后以cDNA为模板扩增iNOS和Arg21的基因编码片段,以鼠GAPDH为内参照,扩增条件如下:94e预变性594e变性30s,59e退火30s,72e延伸30s,30个循环;72e延伸10min。
1.2.4 iNOS活性测定 收集刺激后24h的培养上清,按照NO检测试剂盒(硝酸还原酶法)操作说明,取200Ll培养上清,加入100LlGriessRea2gentR1,再加入等体积GriessReagentR2,混匀室温静置10min,于540nm处检测各样品吸光度(D值),以亚硝酸钠(NaNO2)建立标准曲线。1.2.5 Arg21活性测定 参照Lumeng等[8]的方法,以100Ll0.1%TritonX2100裂解刺激48h后的细胞,加入100Ll50mmol/LTris2HCl和10mmol/LMnCl2,56e温育10min,加入100Ll0.5mol/LArginine,37e温育30min,加入800LlH2SO4/H3PO4终止。随后加入50Ll9%A2异亚硝基苯丙酮(A2isonitrosopropiophenone),95e温育30540nm波长检测吸光度(D值),以尿素(Urea)建立标准曲线。
M1和M2型巨噬细胞表型的比较分析#179#
1.2.6 ELISA检测细胞因子分泌 分别收集刺激后24h(IL212)和48h(IL210)的培养上清。按照试剂盒说明操作,1B250稀释包被抗体200Ll,4e包被过夜,洗板3次,加入培养上清100Ll,室温孵育1h后洗板3次,加入1B250稀释的生物素标记检测抗体100Ll,室温孵育1h后洗板3次,加入1B200亲和素标记辣根过氧化物酶100Ll,室温孵育30min后洗板7次,加入底物液100Ll,室温避光15min后加入2mol/LH2SO4终止,450nm波长检测吸光度(D值)。
L929培养上清培养7d后,发现诱导分化的巨噬细胞的纯度高达92%,适用于后续实验(图1)
1.2.7 流式细胞术检测细胞膜蛋白表达 按上述方法诱导培养7d的骨髓细胞或刺激后的细胞,胰酶消化计数,5@105
/管,PBS洗1次,100LlPBS重悬,加入1LgFITC标记的大鼠抗小鼠F4/80抗体和1LgPE标记的抗小鼠CD16/32抗体,4e共育30min,用PBS洗去游离的抗体,用0.3mlPBS重悬后,用流式细胞仪FACSCalibur(BD公司)检测细胞表面F4/80和CD16/32的表达。CD206、MGL和DECTIN21采用间接免疫荧光染色方法,取5@105
刺激后的巨噬细胞,PBS洗1次,100LlPBS重悬,分别加入0.5Lg未标记的大鼠抗小鼠CD206抗体、1Lg未标记的大鼠抗小鼠MGL抗体或0.5Lg未标记的大鼠抗小鼠DEC2TIN21抗体,4e共育30min,用PBS洗去游离的抗体,100LlPBS重悬后,加入0.25LgPE标记的驴抗大鼠IgG(H+L)抗体,4e共育30min,用PBS洗2次,用0.3mlPBS重悬后用流式细胞仪FACSCalibur检测。根据实验组抗体的荧光标记,分别选择FITC标记和PE标记的抗小鼠IgG2b同型抗体作为阴性对照,未与抗体作用的巨噬细胞作为空白对照。
1.3 统计学分析 采用GraphPadPrism4.0软件或SPSS11.5软件对数据进行统计分析,两组间差异比较采用Studentpst检验,多组间差异比较采用单因素方差分析,P&0.05视为差异具有显著性,P&0.01视为差异具有显著性。
2.1 原代巨噬细胞的诱导和鉴定 首先在体外诱导骨髓细胞分化成熟为巨噬细胞。采集骨髓细胞,利用小鼠成纤维细胞系L929自发分泌单核巨噬细胞定向分化所需的巨噬细胞集落刺激因子(macro2phage2colonystimulatingfactor,M2CSF),加入
图1 骨髓来源巨噬细胞F4/80的表达
2.2 M1和M2型巨噬细胞精氨酸代谢关键酶表达和活性的变化 在体外培养条件下,参照经典方法以IFN2C及LPS将骨髓来源巨噬细胞诱导成M1型巨噬细胞,以IL24诱导将其诱导成M2型巨噬细胞[10,11]。不同类型巨噬细胞的功能差异与精氨酸代谢有关,两种代谢途径关键酶iNOS和Arg21相互竞争,分别介导抗感染和损伤修复的功能。因此首先通过RT2PCR研究了iNOS和Arg21的表达水平,而后通过二者的活性功能来评价M1和M2型巨噬细胞。结果发现:M1型巨噬细胞iNOS的表达(图2A)和活性(图2B)较未刺激M0型巨噬细胞显著增加(P&0.01),而M2型巨噬细胞高表达Arg21(图2A)且酶活性(图2B)显著升高(P&0.01)。
2.3 M1和M2型巨噬细胞细胞因子分泌水平的检测 M1和M2型巨噬细胞可通过分泌不同细胞因子,发挥免疫调节的作用,其中IL212和IL210分别介导了正向和负向调节功能,因此我们检测了巨噬细胞这两种细胞因子的分泌水平,结果如图3所示,IFN2C和LPS刺激巨噬细胞分化为M1后其IL212水平显著上升,其IL210的分泌略有增加(P&0.05);IL24使巨噬细胞分化为M2后其IL210分泌水平明显增加(P&0.05),而IL212水平很低。
2.4 M1和M2型巨噬细胞表面分子表达的检测 巨噬细胞膜蛋白表达的差异是鉴定不同类型巨噬细胞的重要方法。我们也对已报道M1型巨噬细胞的标志CD16/32(FcCIII/FcCIIreceptor)和M2型巨
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