用于定量高密度脂蛋白胆固醇的方法
专利名称用于定量高密度脂蛋白胆固醇的方法
技术领域本发明涉及一种方法，该方法用少量样本，通过简单的操作，并且无需进行离心等操作，即可有效地仅与非高密度脂蛋白(HDL)的脂蛋白的胆固醇分开地定量HDL胆固醇。
背景技术 胆固醇等脂质在血清中与脱辅蛋白质配合生成脂蛋白。根据物理性质的不同，脂蛋白分为乳糜微粒、极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)等等。在这些脂蛋白中，LDL已知是致病性物质之一，包括动脉硬化，而HDL已知显示抗动脉硬化活性。
在流行病学上，HDL胆固醇的水平已知与动脉硬化性疾病发生频率呈反比。当前，HDL胆固醇的测量广泛用于预防或诊断缺血性心脏病。已知用于测量HDL胆固醇的方法例如，用离心分离法从其他脂蛋白中分离HDL，然后进行胆固醇测量；另一种方法是用电泳法从其他脂蛋白中分离HDL后，将其脂质染色，再测量显色强度。不过，这些方法尚未成为常规方法，因为它们牵涉一个或多个这样的问题，即操作是令人厌烦的，不能处理大量样本。
目前，普遍和广泛用于临床试验的HDL胆固醇的测量方法是沉淀法，在该方法中，向样本中加入沉淀剂以凝集除HDL以外的脂蛋白，离心除去所得凝集物，然后测量如此分离到的仅含有HDL的血清胆固醇。该方法比超速离心或电泳简单，但是由于包括了加入沉淀剂和进行分离的操作，这就要求每份样本的用量较大，牵涉产生分析误差的潜在问题，也不可能使整个分析步骤完全自动化。
另一方面，已对HDL胆固醇的酶分级定量方法进行了研究。已知的方法例如包括在一种胆汁盐和一种非离子型表面活性剂的存在下进行酶催反应(JP 63-126498A)。该方法利用了这样一个事实，即在反应的最初阶段，酶催反应与LDL浓度成比例进行，然后与HDL胆固醇浓度成比例进行。不过仍然存在准确度问题，因为不能完全区分开与HDL胆固醇的反应和与其他脂蛋白胆固醇的反应。
已知的方法还包括预先使除HDL以外的脂蛋白凝集，使HDL胆固醇单独进行酶催反应，再使酶失活，同时再次溶解凝集物，然后测量吸光度(JP 6-242110A)。不过，该方法需要至少三步操作加入试剂，因此该方法只能适用于特定的自动分析仪，实用性不够广泛。而且，由于再次溶解凝集物，使用高浓度的盐，因此从对分析设备的损害和试剂的处理观点上看，该方法也不是令人满意的。
进一步地，日本专利2600065号公开了一种方法，该方法结合使用一种用在一般的沉淀法中以沉淀除HDL以外的脂蛋白的沉淀剂和一种用于测量HDL中未沉淀的胆固醇的普通的胆固醇测量剂。不过，无论按照该专利的哪个实施例，都不可能测量HDL胆固醇。因此，该专利被认为是这样一种专利，它错误地没有包括发明的必要特征，不能用作现有技术。
发明的公开关于血清脂蛋白胆固醇的测量，本发明人以多种方式进行了研究。在研究过程中发现，当在一种能够溶解脂蛋白的特殊表面活性剂的存在下进行血清与一种胆固醇定量酶试剂之间的反应时，只有HDL胆固醇首先反应，继HDL反应之后是VLDL胆固醇反应，最后，延迟相当长时间后，LDL胆固醇反应。
进一步研究结果发现，根据需要选择测量点，能够单独测量HDL胆固醇，选择测量点以使能够测量依赖于HDL胆固醇浓度的第一个反应，通过使系统中存在一种抑制血清脂蛋白胆固醇与胆固醇定量试剂之间反应的物质，可以长时间保持仅依赖于HDL胆固醇浓度的反应，这些方法也能适用于自动分析仪，从而完成了本发明。
本发明因此提供了高密度脂蛋白胆固醇的定量方法，该方法包括向血清中加入一种选自聚氧乙烯亚烷基苯基醚和聚氧乙烯亚烷基三苄基苯基醚的表面活性剂和一种胆固醇定量酶试剂；然后在高密度脂蛋白胆固醇优先与胆固醇定量酶试剂反应的时间内测量反应量的高密度脂蛋白胆固醇。
本发明也提供了上述HDL胆固醇的定量方法，其中进一步加入一种物质，该物质具有抑制血清脂蛋白胆固醇与胆固醇定量酶试剂之间的反应的作用。
本发明也提供了定量酶和试剂盒，有利于实施上述全部方法。
附图的简要说明附图说明
图1显示由本发明方法得到的分析数据与由实施例1沉淀法得到的分析数据之间的相关性；图2阐明由本发明方法得到的分析数据与由实施例2沉淀法得到的分析数据之间的相关性。
实施本发明的最佳方式用在本发明方法中的表面活性剂(以下称为“脂蛋白溶解剂”)选自聚氧乙烯亚烷基苯基醚和聚氧乙烯亚烷基三苄基苯基醚，是一种具有溶解脂蛋白作用的表面活性剂。这些表面活性剂，作为前者的商业上可得到的实例，包括“Emulgen A-60”(花王公司产品)，作为后者的商业上可得到的实例，包括“Emulgen B66”(花王公司产品)。
这些表面活性剂既可以单用也可以合用。表面活性剂的用量因表面活性剂的种类而异，对此没有特别的限制。对于每种使用该试剂的分析仪，都能凭经验确定，以便设置分析仪的灵敏度，允许在所需测量时间内检测HDL胆固醇。一般来说，所用表面活性剂的浓度优选为0.01至5wt％。
按照本发明的定量方法可以优选在一种物质的存在下进行，该物质(以下称为“反应抑制剂”)具有抑制血清脂蛋白胆固醇与胆固醇定量酶试剂之间的反应的作用。与没有反应抑制剂存在的情况相比，反应抑制剂的存在能够使仅依赖于HDL胆固醇浓度的反应保持更长时间。
用在本发明中的反应抑制剂的例证是对脂蛋白表现出结合亲和性的物质，以及不溶解脂蛋白的表面活性剂。它们既可以单用也可以合用。
对脂蛋白表现出结合亲和性的物质(以下称为“结合物质”)实例可以包括聚阴离子与能够生成二价金属盐的物质的组合。它们也可以是与HDL配合生成沉淀的物质。聚阴离子的具体实例可以包括硫酸葡聚糖、磷钨酸和肝素，能够生成二价金属盐的物质实例可以包括二价金属氯化物，例如MgCl2、CaCl2、MnCl2和NiCl2，和它们的水合物。这些结合物质既可以单用也可以合用。结合物质的用量因其类型而异，对此没有特别的限制。不过可取的用量范围分别是，以在反应中的最终浓度表示，聚阴离子量为0.002至10wt％，能够生成二价金属盐的物质量为0.01至5wt％。
进一步地，不溶解脂蛋白的表面活性剂(以下称为“脂蛋白非溶解剂”)例如可以选自聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯-聚氧丙烯缩合物、聚氧乙烯烷基醚硫酸盐和烷基苯磺酸盐。
其中，聚氧乙烯烷基醚优选为聚氧乙烯鲸蜡基醚(商品为“Emulgen 220”(花王公司产品))；聚氧乙烯烷基苯基醚优选为聚氧乙烯壬基苯基醚(商品为“Emulgen 913”(花王公司产品))；聚氧乙烯-聚氧丙烯缩合物优选为“Pluronic F-88”(朝日电化工业株式会社产品(Asahi Denka Kogyo K.K.))；聚氧乙烯月桂基醚硫酸钠盐(商品为“EMAL 20C”(花王公司产品))；烷基苯磺酸盐优选为十二烷基苯磺酸钠。
这些脂蛋白非溶解剂既可以单用也可以合用。对其用量没有特别的限制，不过可取的用量范围是，与样本混合后的浓度量为0.01至5wt％，尤其为0.05至1wt％。
关于向血清样本中加入脂蛋白溶解剂和胆固醇定量酶试剂(以下称为“胆固醇试剂”)，既可以各自加入，也可以同时以混合物加入。另一方面，可以向脂蛋白溶解剂和胆固醇试剂之一或其混合物中加入反应抑制剂。当使用多种反应抑制剂时，它们可以一起混合，使用方式可以类似于反应抑制剂单用的情况。作为替代选择，可以分别向脂蛋白溶解剂和胆固醇试剂中各自加入它们。
可用于本发明定量胆固醇的胆固醇试剂实例可以包括已知的胆固醇试剂，例如胆固醇酯酶与胆固醇氧化酶的组合和胆固醇酯酶与胆固醇脱氢酶的组合。其中优选的是胆固醇酯酶与胆固醇氧化酶的组合。
在加入这些胆固醇试剂后，对用于最后测量反应量的胆固醇的方法没有特别的限制。例证是通过进一步使一种过氧化酶与一种发色体混合而进行的吸收光谱，和直接检测一种辅酶或过氧化氢的方法。
本发明方法中，有必要在HDL胆固醇优先与胆固醇定量酶试剂反应的时间内检测HDL胆固醇与胆固醇定量酶试剂之间的反应。可用于上述检测的例证方法可以包括动态监测在脂蛋白溶解剂、胆固醇试剂与样本混合后进行的反应；用反应终点法测量HDL胆固醇反应，测量结果用空白值校正(两点法)。当需要长时间监测HDL反应时，加入反应抑制剂可以延长仅依赖于HDL胆固醇浓度的反应，由此延迟了胆固醇检测反应。
下面是有利于实施本发明方法的试剂或试剂盒的实例(1)试剂或试剂盒，包括下列两种成分(a)和(b)(a)脂蛋白溶解剂，和(b)胆固醇试剂。
(2)下列成分(a)至(c)(a)溶解促进活性剂，(b)反应抑制剂(结合物质、脂蛋白非溶解剂)，和(c)胆固醇试剂。
这些试剂或试剂盒可以与上述溶解促进活性剂、胆固醇试剂(胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、胆固醇酯酶、胆固醇脱氢酶等)、反应抑制剂(结合物质、溶解抑制活性剂)、过氧化酶、发色体、辅酶、适当的pH缓冲液、抗氧化剂、载体和/或诸如此类的物质结合。该试剂或试剂盒的例证形态除了液体形态以外，还可以包括由该液体形态得到的其他形态。
实施例下面将通过实施例进一步描述本发明。不过应当记住，本发明决不限于这些实施例或者被这些实施例所限。
实施例1对各50份含有脂蛋白的血清样本的HDL胆固醇用本发明方法和常规沉淀法进行定量，并将测量值进行比较。
按照本发明的方法，向每份血清样本(3μl)中加入100mM MES缓冲液(第一试剂；pH 6.5)(300μl)，约5分钟后加入胆固醇定量试剂(第二试剂)(100μl)，后者的组成为1％“Emulgen B-66”、1U/ml胆固醇酯酶、1U/ml胆固醇氧化酶、5U/ml过氧化酶，和含有0.04％二磺基丁基间甲苯胺与0.004％ 4-氨基安替比林的100mM MES缓冲液(pH 6.5)。在第二试剂加入前不久和加入后五分钟，测量600nm下的吸光度(辅助波长700nm)。根据吸光度的差异，测定血清样本中HDL胆固醇的浓度(2点法)。使用已知浓度的对照血清样本作为校准物。使用日立7150型自动分析仪进行上述操作。
另一方面，在用沉淀法定量HDL胆固醇时，将含有0.3％硫酸葡聚糖和2％氯化镁的水溶液(200μl)与样本(200μl)混合，然后以3000rpm离心10分钟。收集上清液(50μl)，然后与胆固醇定量试剂(3ml)，后者的组成为1％ Triton X-100、1U/ml胆固醇酯酶、1U/ml胆固醇氧化酶、5U/ml过氧化酶，和含有0.04％二磺基丁基间甲苯胺与0.004％ 4-氨基安替比林的100mM MES缓冲液(pH 6.5)混合。所得混合物在37℃下恒温10分钟后，测量600nm下的吸光度，从而测定HDL胆固醇的浓度。
由本发明方法和沉淀法得到的结果相关性如图1所示。本发明方法虽然操作简单，但显示了与常规沉淀法极好的相关性。
实施例2对各50份血清样本的HDL胆固醇使用与实施例1相同的试剂和操作进行定量，不过在第二试剂中加入1％“Emulgen A-60”代替“Emulgen B-66”。
具体来说，向样本(3μl)中加入第一试剂(300μl)，约五分钟后，加入第二试剂(100μl)。测量从加入第二试剂后第12秒到第24秒的546nm下的吸光度变化(辅助波长660nm)，测定血清样本中HDL胆固醇的浓度。使用两份已知浓度(一低一高)的对照血清样本作为校准物。使用日立7150型自动分析仪进行上述操作。
以类似于实施例1的方式，用相同的沉淀法对相同样本的HDL胆固醇进行定量。比较这些测量值。结果如图2所示。
根据图2结果，本发明方法尽管操作简单，但显示了与常规沉淀法良好的相关性。
实施例3使用与实施例2所用相同的第二试剂和下述第一试剂，对各50份含有脂蛋白的血清样本的HDL胆固醇用本发明方法和常规沉淀法进行定量，比较测量值。顺便提及加入第一试剂A(与实施例2相同)作为对照。
第一试剂第一试剂A100mM MES缓冲液(pH 6.5)第一试剂B0.2％“Pluronic F-88”水溶液(朝日电化工业株式会社产品)第一试剂C含有0.2％磷钨酸钠和100mM氯化镁的水溶液(pH 6.4)第一试剂D含有0.2％“Pluronic F-88”、0.2％磷钨酸钠和100mM氯化镁的水溶液(pH 6.4)为了确认加入反应抑制剂的作用，用日立7150型测量在不同光谱测量时间的吸光度，也就是说，在第二试剂加入后的从第12秒到第24秒、从第12秒到第168秒和从第12秒到第312秒。
另一方面，以类似于实施例1的方式用沉淀法进行HDL的测量，在相同条件下研究它与本发明方法的相关性。相关系数如表1所示。表1
从结果可以看出，不含有任何反应抑制剂的第一试剂仅在反应最初阶段的吸光度测量中显示了良好结果。另一方面，按照使用含有一种或几种反应抑制剂的试剂作为第一试剂的测量结果，所有结果在长时间测量中显示了良好的相关性(越接近1，相关性越高)，该试剂分别是0.2％“Pluronic F-88”水溶液(朝日电化工业株式会社产品)、含有0.2％磷钨酸钠与100mM氯化镁的水溶液(pH 6.4)和含有0.2％“Pluronic F-88”、0.2％磷钨酸钠与100mM氯化镁的水溶液(pH 6.4)。因此可以确认，反应抑制剂有效地延长了依赖于HDL胆固醇量的反应。
工业实用性按照本发明，用简单操作可以有效地定量HDL胆固醇，无需离心分离等预处理。由于在具体测量时用少量样本通过简单操作是可行的，本发明能够适用于多种自动分析仪，这在临床试验领域中是极为有用的。
1.高密度脂蛋白胆固醇的定量方法，该方法包括向血清中加入一种选自聚氧乙烯亚烷基苯基醚和聚氧乙烯亚烷基三苄基苯基醚的表面活性剂和一种胆固醇定量酶试剂；然后在所述高密度脂蛋白中的所述胆固醇优先与所述胆固醇定量酶试剂反应的时间内测量所述高密度脂蛋白中的所述胆固醇的反应量。
2.高密度脂蛋白胆固醇的定量方法，该方法包括向血清中加入一种选自聚氧乙烯亚烷基苯基醚和聚氧乙烯亚烷基三苄基苯基醚的表面活性剂、一种具有抑制血清脂蛋白胆固醇与一种胆固醇定量酶试剂之间反应的作用的物质和所述胆固醇定量酶试剂；然后在所述高密度脂蛋白中的所述胆固醇优先与所述胆固醇定量酶试剂反应的时间内测量所述高密度脂蛋白中的所述胆固醇的反应量。
3.根据权利要求2的方法，其中所述的具有抑制血清脂蛋白胆固醇与所述胆固醇定量酶试剂之间所述反应的作用的物质是一种不溶解脂蛋白的表面活性剂或一种聚阴离子与一种能够生成二价金属离子的物质的组合。
4.高密度脂蛋白胆固醇的定量试剂或试剂盒，包括下列成分(a)和(b)(a)一种表面活性剂，选自聚氧乙烯亚烷基苯基醚和聚氧乙烯亚烷基三苄基苯基醚；和(b)一种胆固醇定量酶试剂。
5.高密度脂蛋白胆固醇的定量试剂或试剂盒，包括下列成分(a)、(b)和(c)(a)一种表面活性剂，选自聚氧乙烯亚烷基苯基醚和聚氧乙烯亚烷基三苄基苯基醚；(b)一种物质，具有抑制血清脂蛋白胆固醇与一种胆固醇定量酶试剂之间反应的作用；和(c)所述胆固醇定量酶试剂。
用于定量HDL胆固醇的方法,包括向血清中加入一种选自聚氧乙烯亚烷基苯基醚和聚氧乙烯亚烷基三苄基苯基醚的表面活性剂和一种用于测定胆固醇的酶试剂,以及任选的一种能够抑制血清脂蛋白胆固醇与上述酶试剂之间反应的物质,在脂蛋白中的HDL胆固醇优选与上述酶试剂反应的时间阶段内测定所反应的胆固醇的量。利用这种方法。可以方便有效地定量HDL胆固醇,无需诉诸于离心等任何预处理。因此,适用于多种自动分析仪。
文档编号G01N33/92GK808540
公开日日 申请日期日 优先权日日
发明者中西一夫, 中村光浩, 日野浩一, 真锅满久 申请人:第一化学药品株式会社(window.slotbydup=window.slotbydup || []).push({
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来源：全民体检网
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