在定性免疫测定中，确定合适的阴阳性判断值对减少假阳性和假阴性具有重要意义。处于阳性判断值定值域中的测定结果可归为可疑，即ELISA测定的“灰区”。目前国内用做传染性病原体抗原或抗体检测的ELISA试剂盒没有统一
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在定性免疫测定中，确定合适的阴阳性判断值对减少假阳性和假阴性具有重要意义。处于阳性判断值定值域中的测定结果可归为可疑，即ELISA测定的&灰区&。目前国内用做传染性病原体抗原或抗体检测的ELISA试剂盒没有统一的&灰区&设置标准，而仅仅以&阳性判断值&（Cut off Value，Co值）来判断阴阳性结果，这就会涉及到检测结果低于但接近Co值的血液是否合格的问题。根据ELISA测定的Co值来判断结果，假阳/阴性不可能完全避免，其只不过是将假阳/阴性降低到较低的比例而已。那么&灰区&范围设置多大才比较合适，我们就此问题进行了初步探讨，现报告如下。
1& 材料与方法
&&&& 1．1& 样本& 2007年5月&9月，本中心初、复检抗HCV结果不一致但复核结果为阴性的样本1 394份。2006年1月&2007年9月抗HCV阳性报废的血液样本643份，并特意收集这期间初、复检结果不一致且阴性结果协方差值（Cov值）&050的样本44份。1 NCU/ml抗HCV定值血清(批号0802)由卫生部临床检验中心提供。样本采集、保存与运输按照&全血及成分血质量要求（GB）&中&全血的质量要求&收集全血，在血液采集后4&6 h内以1 500 r/min，15 min离心取上清收集血浆并分成3份，分别用于ELISA方法 抗HCV、FQPCR方法HCV RNA检测和复核检测。-20℃下保存期为3个月、-70℃下保存期为1年，运输采用干冰。
&&&& 1．2& 试剂与仪器& 酶联免疫试剂盒初检试剂(厦门新创公司)、复检试剂（上海科华公司）、病毒核酸扩增荧光检测试剂盒（达安基因股份有限公司，批号：H10762）；（上海浩源生物科技有限公司，批号：）、复核试剂测试系统［COBAS公司 AmpliScreen HCV Test (V20)，批号：H10762］。核酸扩增实时荧光基因分析仪（达安基因股份有限公司，DA7600）、核酸自动提取系统（Chemagen公司，Magnetic Separation Module I型）、核酸提取仪（TBG公司，EZ Beads32）、PCR核酸扩增检测技术（ABI公司，7500实时PCR分析系统）、全自动样品处理机（TECAN公司，RSP200/8型）、全自动酶免分析仪（Microlab公司，FAME 24/20型）。
&&&& 1．3& 实验设计&& 初复检筛查实验采用ELISA方法，对初次具反应性的样本用相同试剂再次双孔复试，所有阴性样本再用FQPCR方法检测。对于初、复检结果不一致的样本用FQPCR方法和COBAS AmpliScreen HCV Test (V20)测试系统检测。各项试验均严格按照试剂盒操作说明书进行。
&&&& 1．4& 数据统计& 初、复检2遍检测均阳性的样本测试结果纳入阳性样本数据统计，对初、复检2遍检测结果不一致的，以HCV RNA检测结果和复核试剂结果为标准，如复核结果为阳性，ELISA结果数据均归入阳性统计，否则归入阴性数据统计。
&&&& 2．1& 常规检测初、复检结果& 结果不一致且阴性结果Cov值&050的样本44份，以30%作为&灰区范围&，处于&灰区范围&的样本共10份，ELISA检测结果见表1。对这些样本采用FQPCR方法和COBAS AmpliScreen HCV Test (V20)测试系统再次检测，其中1份HCV RNA阳性样本，而ELISA抗HCV结果不确定，Cov值为085&135。从而表明筛查试验结果处于&灰区范围&内的样本有可能就是阳性样本。
&&&&&&由表1结果可知，处于&灰区范围&内的样本共10份，占本项研究全部样本的049%（10/2037），这些样本经文中方法鉴定后的真阳性和真阴性比例分别为100%（1/10）和900%（9/10）。另外，对结果不一致的样本，分别统计2种试剂阳性结果Cov平均值、 s和Cov平均值+2s，计算值分别为219、069、358；207、084、375。总Cov平均值、s和Cov平均值+2s分别为213、077、367。从而表明结果不一致的样本多为Cov值在20左右的弱阳性样本，一般情况下Cov值＜40。
&&&& 2．2& 1394份常规检测初、复检抗HCV结果&& 结果不一致而复试结果阴性的样本，Cov值波动范围为000&155，按Cov值大小顺序排列，以005为组距，统计各组段的样本数量，计算累计频数和累计频率，制作抗HCV阴性样本Cov值频数表，结果见表2。由表2抗HCV阴性样本Cov值频数表数据，计算百分位数P25=0117、P50=0179、P75=0268、P95=0761。根据表2结果，以各组段样本数量为纵坐标，以Cov值为横坐标作图可见阴性样本Cov值呈偏态分布，见图1。
&&&& 2．3& 抗HCV阳性报废的643份血液初、复检结果&& 统计结果：Cov值波动范围在000&2200，按Cov值大小顺序排列，以050为组距，统计各组段的样本数量，计算累计频数和累计频率，制作抗HCV阴性样本Cov值频数表，结果见表3。由表3频数表数据，计算百分位数，P5=0588、P25=1628、P50=2780、P75=5163、P95=19488。根据表3数据，以各组段样本数量为纵坐标，以Cov值为横坐标作图，可见阳性标本Cov值呈偏态分布，结果见图2。
表1& 抗HCV初、复检结果不一致样本Cov值
表2& 抗HCV阴性样本Cov值频数
累计频率(%)
累计频率(%)
& & &图1& 抗HCV阴性样本Cov值频数& & &
&&&& 图2& 抗HCV阳性样本Cov值频数
&&&&& 处在Co定值域中的测定结果可归为可疑，也即ELISA测定的&灰区&。由表2、3结果可知，采用百分位数法，阴性样本以单侧95%，阳性样本以单侧5%计算，P+5=0588、P-95=0761，故由阴、阳性样本Cov值计算的灰区范围为。
&&&& 2．4& 阳性结果确证&& 采用卫生部临床检验中心1 Ncu/ml定值质控血清以及经确证结果呈阳性的12份血清分别用阴性血清稀释，同时用2种初筛试剂检测，平均值Cov&1为阳性，结果见表4。
表3& 抗HCV阳性样本Cov频数
累计频率(%)
累计频率(%)
表4& 抗HCV阳性样本稀释Cov值
&&&&& 由表4结果，分别对各样本不同稀释倍数的检测结果绘制抗HCV阳性样本稀释Cov曲线图，并对相同稀释倍数的不同样本计算平均值绘制抗HCV阳性样本稀释Cov平均值曲线图，结果见图3。由结果可知，阳性样本，经过稀释，最终使筛查实验无法检出。但是，阳性样本稀释到一定程度，虽然Cov值持续下降，结果呈阴性反应，在阳性和阴性结果转换期间，曲线总体趋势逐渐由陡峭到平坦，进入1个相对稳定的平台期。统计表4中Cov均值＜20的数据，Cov平均值=0731、s=0410、平均值+2s=1552。
&&&& 图3&& 抗HCV阳性样本稀释Cov平均值图
&&&&& 综合阴性、阳性样本和阳性稀释样本统计数据，两者灰区范围结果吻合，均在070左右，该值远高于多数阴性样本Cov值（表2结果中9448%的阴性样本Cov值＜070），足以区识阴阳性，可以作为分界线，弥补ELISA试剂盒单纯以cut off值判断阴阳性的缺陷，因此把筛查结果Cov值下浮30%范围视为&灰区&较为合适。对该区样本需要增补试验联合检测，以防漏检。
&&&&&& 把&灰区范围&设置为30%，处于该区域内的样本占本项研究全部样本的049%，&灰区范围&内的这些样本经文中方法鉴定后的真阳性率为100%。由此表明确实存在灰区样本漏检情况发生，故而有必要对这些样本进行确认。而处于&灰区范围&内的样本仅占全部样本的049%，即便增加试验联合检测，也不会过多增加工作量，在实际工作中是现实可行的。另外，结果不一致的样本，Cov平均值、s和Cov平均值+2s分别为213、077、367，从而表明结果不一致的样本多为弱阳性样本，一般情况下Cov值＜40。在常规检测过程中，可能会有一些阳性样本，由于抗体浓度较低而出现假阴性结果的现象。所以，设置1个适当的&灰区范围&，对处于该范围的样本做进一步的检测，采用多种试剂联合检测，只有当结果均为阴性时方可发出检验报告，必要时需再次取样随访调查，以避免漏检现象的发生。
&&&&& 一般而言，HCV能够诱导机体产生几乎针对所有结构蛋白和非结构蛋白的抗体应答反应，在出现临床症状的HCV感染者中，约有50%&70%的患者可检出抗HCV，且随着感染的持续而逐步增强，慢性感染者抗HCV IgG的亲和力通常较强并能持续存在［1］。在临床上也会发现抗HCV阳性，但HCV RNA为阴性的背离现象。在初筛抗HCV为反应性的情况下，HCV RNA的PCR检测结果如果为阴性，并不能证明该样本为阴性，故无法排除文中抗HCV复检为阴性是由于试剂或其他原因所致的漏检。另外，初、复检同时为反应性的样本也不一定为真阳性，文中由于方法的局限性，无法对这些样本进行确证，只能暂时依据HCV RNA检测结果来区分这些样本。
&&&&& 国产抗HCV检测试剂存在一定的漏检和误检现象，直接影响结果的准确判断。用于HCV感染诊断的试验结果必须尽可能准确，因为这牵涉到伴随HCV感染而产生的医学伦理、法律以及社会学等方面的问题，特别对于血站系统，该检测结果直接决定该份血液是否能够安全用于临床。虽然第三代抗HCV检测试剂是高灵敏，特异和可重现的，但是仍然没有能够排除假反应结果。一方面在低流行区或低危人群中，建立增补试验或联合检测方法，对初筛试验中呈反应性的样本进行确证，以控制假阳性率；另一方面，在目前情况下，设置合适的&灰区范围&，将处于&灰区范围&的样本作为可疑样本（被技术认为阴性却含有较高OD值读数的样本）进行复检，能减少假阴性结果的产生。建议有条件的血站以核酸检测方法作为增补试验，再次进行联合检测，能增强发现早期感染（血清阳转）的机会，把这些献血者尽早识别出来，以便于通知其本人或对其血清转化进程加以监测，对控制和预防HCV 的传播具有重要的意义。
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HCV的分型方法和基因分型的意义
（原作者：王拥 赵燕琴）摘要：
丙型肝炎病毒（HCV）是引起丙型肝炎的病原体。HCV感染是一个世界性的健康问题，其发病率逐年增高，且致病性强，较易转为墁性，甚至发展成肝硬化和肝细胞癌。进一步深入HCV生物学特性，尤其是基因分型的研究，对于丙型肝炎严重程度的评估；抗病毒药物敏感性的预测；提高诊断准确率以及疫苗研制和传播的地域分布特征的认识均有较大意义。
关键词：丙型肝炎病毒；基因分型；意义
【中图分类号】
R322.4+7 【文献标识码】B 【文章编号】（5-01
丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus，HCV）是引起丙型肝炎的病原体，最初于1975年在一名输血后的患者血清中被发现，当时命名为非A非B型肝炎病毒（Non-A Non-B Hepatitis，NANBH）[1]。随着分子生物学的发展，Michael Houghton的团队在1989年首次克隆其基因组[2]。同年Alter HJ等人在NANBH患者体内发现并分析了其抗体[3]，其随后旋即被命名为HCV。HCV感染是一个世界性的健康问题[4]，其发病率逐年增高，且致病性强，较易转为慢性，导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，并可发展为肝硬化和肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）。HCV主要由血液系统传播，据估计全球的HCV感染率约为3.0%，即大约有1.7亿人被感染，每年新发病例约3.5万例[6]。在我国，HCV的感染率约在2.5%～4.9%之间，有超过5000万人感染HCV。HCV感染者初期大多数无明显症状，大约有70%～80%的HCV急性感染会转为慢性感染，其中约有10%～20%的慢性感染者会转变成肝硬化，最终约有5%的慢性感染者进展为HCC[7]。
深入研究HCV基因分型，对于反映丙型肝炎疾病的严重程度；抗病毒药物敏感性的预测；辅助提高丙型肝炎的诊断准确率；以及HCV疫苗的研究和了解HCV传播的地域分布特征均有较大意义。
1 HCV分型方法
1.1 全基因组直接测序分析法：此方法是目前HCV基因分型方法中最经典、最准确的方法。该方法采用比较特异性多PCR引物扩增特定的核苷酸序列区域，直接测序后与GenBank中己上传的HCV序列进行比对后，描绘出系统进化树，根据进化距离及种系关系确定HCV的基因型。直接测序法可以最大程度的获得HCV的序列信息，结果最为可靠，是HCV基因分型的“金标准”。但此法耗时、费力且昂贵，并不适合所有的实验室使用。
1.2 型特异性引物扩增法（PCR Amplification with Sequence Specific Primers，PCR-SSP）：根据HCV不同基因型在某一特定区段（主要是C区和NS5B区）碱基序列上的差异，设计一系列型特异性引物，不同HCV基因型可通过PCR扩增出长度大小不同的片段，并以此分型。因为该方法相对简便易操作，曾是国内外学者较早普遍使用的方法。其中最先应用的Okamoto法是日本学者Okamoto根据C区的基因序列变化的规律性与HCV基因型的关系建立的。该方法的主要缺点是必须要保证HCV各型之间有较大差异，且对PCR引物的设计要求较高，每份样品需同时进行多次检测才能最终确定基因型，所以其准确性及灵敏度都较低。虽然该方法经改进后灵敏度及准确性都有所提高，但与相对于其他分型方法，分型的效果仍较差。因此未能在临床及科研中广泛应用。
1.3 限制性片段长度多态性分析法（Restrietion Fragment Length polymer- phism，RELP）：根据HCV不同基因型在某一区段个别核苷酸序列的变异直接导致某些酶切位点的改变，PCR扩增靶基因后，用多种特定的种限制性内切酶对PCR产物进行酶切，不同的基因型或亚型就可以得到长度大小不同的酶切片段。然后，根据酶切后电泳所表现的片段大小及多态性进行HCV基因分型。一般选择5’UTR或NS5B区域作为RELP分型的靶区域。该方法具有快速、经济等优点，但其缺点是仅用少数几个内切酶，检测基因型别有限，最重要的是不能发现新的基因型。
1.4 型特异性核酸探针杂交法（PCR Sequence Specific Oligonueleotide，PCR-SSO）：根据各型HCV某一区段的序列差异分别设计特异探针并固定在纤维素膜或芯片上，通过生物素或者其它类型的标记物标记引物，利用RT-PCR扩增HCV基因片段，将扩增产物与膜上特异性探针杂交，经显色反应后，检测HCV基因型。目前国内外广泛使用的线性探针杂交（Line Probe Assay，LiPA）就是型特异性核酸探针杂交分型方法。该方法操作比较简便，而且改良后的LiPA-II对HCV 1a、lb亚型及东南亚地区的6型的鉴别有较好的特异性。但是，该方法价格昂贵，不适宜所有的实验室广泛推广。
HCV RNA基因组由多个区段组成，选择哪个区段作为分型依据成为关键问题。5’UTR区域的序列是整个HCV基因组中最为保守的部分，种系间变化的程度及进化频率都很低，可用于区分主要基因型。现今市面上几乎所有商品化的HCV基因分型试剂盒，如LiPA、TRUGENE、Invader、Abbott等都是基于此区域设计的。但在我国西南地区及东南亚，部分6型和la、lb亚型在该区域序列几乎完全一致，所以还需要配合其它区域序列分析进行详细区分。NS5B区和C/El区进化变异较大，属于HCV的亚基因区及种属信息区，富含区分HCV基因型及亚型的序列信息。1993年，Simmond等选择NS5B作为主分型区域，利用核苷酸序列测序及系统进化分析，最终确立为国际通用的HCV分型命名，即将HCV分为6种主要基因型及一系列亚型。但是，由于种属信息区序列具有较高的异质性，由于引物结合失败而导致的PCR扩增失败的几率也随之增加。因此，联合两个以上的区域如5’UTR与C区、El与NSSB区或El与C区对HCV基因进行分型，则可使分析结果更加可信和真实。虽然测定部分区域也可以进行HCV分型，但是测定全基因组序列才是最可靠的方法。（原作者：王拥 赵燕琴）2 HCV基因分型的意义
2.1 反映疾病的严重程度：
血清HCV RNA水平与肝脏的炎症活动有明显相关性。HCV RNA载量变化反映了病毒复制的活跃程度和病情的进展情况。HCV基因型与HCV RNA含量有着明显的相关性，HCV基因1、2型感染者血清中HCV RNA含量显著高于HCV基因3型感染者，且病毒复制活跃，病情较易转为慢性化。不同的HCV基因型所致疾病的严重程度也有所不同，某些基因型可能会引起较严重的肝细胞损伤。血清转氨酶检测是一项评估肝病活动性的有效的生化指标。HCV基因型2感染和HCV基因2/3混合型感染很可能导致血清转氨酶异常升高。
2.2 抗病毒药物敏感性预测指标：
α干扰素（IFN-α）是丙型肝炎抗病毒治疗的首选药物，在其临床应用过程中，研究发现IFN-α的临床疗效与HCV基因型有密切关系，病毒基因型可以作为预测α干扰素治疗丙型肝炎临床疗效的重要指标。一般认为，1b型感染者血清中病毒含量高、病毒复制活跃，对干扰素反应差，临床疗效低于2a、2b和3型。现今，多数学者认为干扰素对HCV基因3型疗效较HCV基因2型好。已有的研究表明HCV基因型1、4、5、6和2、3对α干扰素联合利巴韦林治疗的持续病毒学应答（SVR）分别为30%和65%，感染1b亚型的患者对干扰素治疗效果最差。这可能是由于NS5A区域内ISDR基因突变，引起干扰素诱导的细胞抗病毒关键通路PKR途径变化所致。
2.3 辅助提高丙型肝炎的诊断准确率：
目前临床上普遍使用的第三代抗体检测HCV方法，抗原几乎都来自la亚型重组蛋白，HCV la亚型感染者的血清抗体效价明显高于其他基因型或者亚型感染者。但是不同基因型的HCV核苷酸序列之间的有比较大的差异，因此所表达出蛋白的免疫原性和抗原性也有所区别。为了提高对HCV感染的检测灵敏度，应根据本地区的HCV流行特点来选择诊断试剂和方法，以提高诊断敏感性和特异性。应该选择不同基因型的最保守区域作为检测靶位点，以保证最大限度的检出病毒，避免出现假阴性结果，为临床输血的安全性提供可靠保障。
2.4有助于HCV疫苗的研究：
预防丙型肝炎的最有效的措施应该是HCV疫苗。但是由于HCV基因的突变率非常高，导致其抗原性变异较大。因此，有效的HCV疫苗应包含大部分主要基因型的抗原表位，或根据该地HCV基因型分布特点来制备相应的预防性疫苗。
2.5 有助于了解HCV传播的地域分布特征：
HCV感染呈现全球分布，但是不同地区的HCV基因型分布却存在着较大的差异，这种差异可能是由于地域或者人群的不同造成HCV的进化和亲缘关系、HCV宿主间的免疫应答机制的不同造成的。目前非洲大陆及东南亚地区是世界上检测到HCV基因亚型最多的地区，根据系统进化理论分析认为，二三百年来HCV在各大洲间的传播很频繁，但是现在却很难确定6种HCV基因型的共同祖先、其特定的起源地理位置。另外，HCV基因分型的研究还有助于了解HCV总体的变异趋势和判断HCV的传播途径，对于预防和控制HCV感染也具有重要现实意义。
[1] Feinstone SM， Kapikian AZ， Holland PV， et al. Transfusion-associated hepatitis not due to viral hepatitis type A or B. N Engl J Med. 1975； 292（15）： 767-770.
[2] Choo QL， Kuo G， Houghton M， et al. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A，non-B viral hepatitis genome. Science. 1989； 244（4902）： 359-362.
[3] Kuo G， Choo QL， Stevens CE， et al. An assay for circulating antibodies to a major etiologic virus of human non-A， non-B hepatitis. Science. 1989； 244（4902）： 362-364.
[4] Levrero M. Viral hepatitis and liver cancer： the case of hepatitis C. Oncogene. 2006； 25（27）： .
[5] Altekruse SF， McGlynn KA and Reichman ME. Hepatocellular carcinoma incidence， mortality，and survival trends in the United States from 1975 to 2005. J Clin Oncol. 2009； 27（9）： .
[6] Global surveillance and control of hepatitis C. Report of a WHO Consultation organized in collaboration with the Viral Hepatitis Prevention Board， Antwerp， Belgium. J Viral Hepat. 1999； 6（1）： 35-47.
[7] Hoofnagle JH. Course and outcome of hepatitis C. Hepatology. 2002； 36（5 Suppl 1）： S21-S29., , , , （www.niubb.net）欢迎您转载分享，并保留本站链接地址。
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>> 我想知道丙肝，HCV RNA定量测定值为4乘以10的6次方，是不是容易导致贫血？
我想知道丙肝，HCV RNA定量测定值为4乘以10的6次方，是不是容易导致贫血？
核心提示：我想知道丙肝，HCV RNA定量测定值为4乘以10的6次方，是不是容易导致贫血？ 希望可以帮到你贫血有先天性贫血.却铁性贫血，有因为胃功能差、肝功能差、肾功能差、心脏功能差所引起的贫血。因此要治好贫血最根本的问题是先解决胃的吸收问题，再解决好……希望可以帮到你贫血有先天性贫血.却铁性贫血，有因为胃功能差、差、肾功能差、心脏功能差所引起的。因此要治好最根本的问题是先解决胃的吸收问题，再解决好五脏六腑功能的修复问题。先解决好胃的问题：所有的很难治，吃药打针只能暂时缓解，都不能解决问题，告诉你一个方法非常管用：差点做胃切除手术的患者就用以下方法治好了，以此法治好过严重患者几十例．１、定时定量，建议你把早餐的时间定为七点半，中餐时间定为十二点，晚餐时间定为十八点，定时开饭的时间尽量不要超过三分钟。２、先养好胃的办法，用胡萝卜粒煲粥，固定一个数量吃三天，三天后等人感到非常有精神再调整进食量。&&& 注：在期间除了一日三餐外其它时间不能吃任何食物、水果、饮水或其它饮料。３、如果现在很严重，吃饭都有问题的话，不用怕，先用煲烂的粥定时喝，吐了也不怕，坚持按时间和以上方 法，三餐后就会好转。&&& 注：先以这种方法使用，第四餐后明显好转，第六餐后进入正常，可以吃胃舒平或胃仙Ｕ， 按说明书服用三次。4、如有喝水习惯的人应在吃饭时一次定量喝，其它时间不能随便喝水，不能吃任何水果和食物，更不能喝任何饮料。5、以上方法一周后人会很精神，感觉没病好了一样，但是千万要小心千万不可乱食。当胃好后，逐步增加食量，只有胃好后才能解决营养吸收问题，这时可以增加补血食物。补血的食物主要有：红糖 胡萝卜 牛肝 羊肝(极品)& 马肝(极品) 羊肉(极品) 牛肉 胶类肉食 &&&&&&&&&&&&&&&& 菠菜& 蚕豆& 海带 紫菜 黑木耳 蛋黄& 龙眼肉 红枣 比较甜的瓜果类。禁食类：酸性食物，碱性食物，养殖食物。使用上述方法你的身体将有一个大的好转，如果有效再给你一个彻底根治的办法。　　延伸阅读：　　抗病毒治疗 有条件的话 注射长效干扰素 同时还要进行保肝护肝的治疗，
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