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【求助】普通PCR可以扩出来，换定量PCR为什么就扩不出来呢？
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这个帖子发布于4年零108天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
引物、试剂和参数设置都是一模一样的，同样的条件在普通PCR仪上扩增良好，电泳见到了单一的目的条带；去定量PCR仪上扩却扩不出来了，Ct值基本上35-45之间！产物电泳也什么都看不到。用的是ABI StepOne。试剂都是TAKARA的预混试剂，含SYBR Green 1染料；模板DNA按说也都没有问题。真是郁闷极了。会是什么原因呢？
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能把反应条件说一下吗？仪器设置的有没有问题呢？
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tiantian 能把反应条件说一下吗？仪器设置的有没有问题呢？1.预变性 95℃，3min；2.变性 95℃，30s；3.退火 55℃，30s；4.延伸 72℃，50s；5.延伸 72℃，10min；（step2—4，45个循环）溶解曲线：75℃——95℃，0.2℃/s。反应条件是前人在做的过程中摸索出来的，基本照搬了(和别人用的PCR仪、试剂不完全相同)；对ABI StepOne仪器虽然不甚熟悉，但是有较熟悉的同学指导，应该不会有大的问题啊。曾经在DA7600的定量PCR仪上做过预实验，内参及阴性对照、引物、体系、反应条件均可，内参及目的基因扩增Ct值25左右。在普通PCR仪上也用相同条件扩增过，产物电泳分析确为单一目的条带。当然了，每次扩增用的不是同一个模板cDNA，但是理论上相差不远。谢谢支持！求思路啊！
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我这出现过一种情况，过去能扩增的体系忽然扩增效率大降甚至扩增失败，必须添加BSA成分的buffer才能正常扩增，可以尝试添加终浓度为0.01%的BSA试试，可能跟耗材有一定关系
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既然只有仪器不同，那只能在仪器方面找原因了pcr仪器的性能主要有两点:1,温度的准确度；2，温度的升降速率这两个参数对检测影响很大，建议找厂家校准温度不同仪器建议重新摸条件还有就是感觉你发上来的条件不像是做荧光定量pcr的条件，一般荧光定量是两步法，即没有延伸这一步，因为荧光定量pcr产物一般在150bp左右，不知道你的片段多大即便是用三步法延伸这个一步只需要15’左右即可，如果50‘这得是扩多大的条带啊
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yangrui2006114 1.预变性 95℃，3min；2.变性 95℃，30s；3.退火 55℃，30s；4.延伸 72℃，50s；5.延伸 72℃，10min；（step2—4，45个循环）溶解曲线：75℃——95℃，0.2℃/s。反应条件是前人在做的过程中摸索出来的，基本照搬了(和别人用的PCR仪、试剂不完全相同)；对ABI StepOne仪器虽然不甚熟悉，但是有较熟悉的同学指导，应该不会有大的问题啊。曾经在DA7600的定量PCR仪上做过预实验，内参及阴性对照、引物、体系、反应条件均可，内参及目的基因扩增Ct值25左右。在普通PCR仪上也用相同条件扩增过，产物电泳分析确为单一目的条带。当然了，每次扩增用的不是同一个模板cDNA，但是理论上相差不远。谢谢支持！求思路啊！每次扩增用的不是同一个模板cDNA，但是理论上相差不远。没有理论吧，要确保模板质量没问题哦。
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seuzsl 既然只有仪器不同，那只能在仪器方面找原因了pcr仪器的性能主要有两点:1,温度的准确度；2，温度的升降速率这两个参数对检测影响很大，建议找厂家校准温度不同仪器建议重新摸条件还有就是感觉你发上来的条件不像是做荧光定量pcr的条件，一般荧光定量是两步法，即没有延伸这一步，因为荧光定量pcr产物一般在150bp左右，不知道你的片段多大即便是用三步法延伸这个一步只需要15’左右即可，如果50‘这得是扩多大的条带啊嗯，最早是没有用荧光定量PCR的，只在普通PCR扩增，目的条带大约200bp；后来在原先的实验基础上做了部分改进，但是改过之后需要用定量PCR，现在设置的条件是在之前条件基础上稍作修改的；因为已有前人做过，所以没有再做修改。或许是模板的问题，我们提取的总RNA没有问题，但是反转录之后就不清楚了啊。昨天换了一个cDNA重新做，终于看到扩增曲线，虽不甚完美，也心安了许多。谢谢支持！我们今后会注意探索反应条件，对荧光定量PCR知识真的了解太少了，学习！
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sdhjw2008 每次扩增用的不是同一个模板cDNA，但是理论上相差不远。没有理论吧，要确保模板质量没问题哦。嗯，是啊，虽然确定了所提的RNA没有问题，可是反转录过程就不好说了……昨天我们换了一个模板，居然扩出来了，不是很完美的结果，但也过得去，很是开心啊！只是很不明白，为什么那份cDNA就不行，RNA是没问题的，反转录我们也做了那么多次了，误差应该很小的……如果找不到那份cDNA异常的原因，以后就还可能出现这样的问题啊。
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轩辕顽童 我这出现过一种情况，过去能扩增的体系忽然扩增效率大降甚至扩增失败，必须添加BSA成分的buffer才能正常扩增，可以尝试添加终浓度为0.01%的BSA试试，可能跟耗材有一定关系嗯，因为买的是比较省事的试剂盒，想着一般试剂盒里的东西都是比较好用不必操心的；我们用的pcr反应管倒真是很便宜的，担心会影响荧光信号检测，打算换进口的好一些的管子
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关于丁香园荧光定量PCR完全攻略&(转)
PCRPCRPCRPCRPCR
nPCR100%PCRDNA2Y= X(1+E)n E E =
1105n30E n&30EY
PCRPCRPCRPCRPCR
Tn=Tn-11+En [0
EnTnnPCRTn-1n-1PCRT0PCR(K1010)CPcrossing point,K= T01+ECP
T0+CP*lg(1+E)
1/lg(1+E)*lg T0 +lgk/lg(1+E)
PCREKCPlg T0y=kx+b,- 1/lg(1+E)lgk/lg(1+E)PCRRT-PCR
PCR(Slope)- 1/lg(1+E)E=10-1/Slope-1 ,Slope=-3.337,E=101/3337-1=0.99,(1+E)EE=10-1/SlopeE122PCR10PCRN2=N0En2, N3=(10*N0)En3,N2=N3En2-n3=10,ngE=1, E=101/nE=2n=3.32; E=1.8n=3.91.
SYBR Green I
SYBR Green
Green IPCRDNASYBR Green I 497nm520nmPCR94557240
SYBR Green
I SYBR Green
SYBR Green ISYBR Green IDNA
PCRPCR-ELISAPCR1PCRPCR2cDNAPCRmimic3PCRPCR96PCR96PCR
2PCRPCR301010/452396
APCRPCRPCRPCR
BPCRPCRCtPCR
2CtCtPCRTexas
PCRPCRPCRPCRPCR
1)genebankwww.ncbi.nlm.nih.gov
2)Primer5.0Oligo6.0beacon designs3.0www.
D2025bp,Tm5565GC40%60%100-250bp
B2030bpTm6570510GC40%70%
3blast(www.ncbi.nlm.nih/blast)
4FAMTexas redLC-Red640LC-Red705PCRTaqmanbeacon
6120bpPCRPCRTEDNA6.0102345107/ml106/ml105/ml104/ml103/ml
725pmol/ul2025pmol/ulul
(OD33)40000
1PCR buffer0.3-0.5pmol/ul0.10.3pmol/ul2.5-4.0mMMg2+1-2UTaq0.20.4mMdNTPs0.2-1UUNG0.3-0.6mMdUTP2-5ul2050ul
lightcycler502
blastprimer
803PCREDTAPCRKRNA
CPCR10%75%10%70%
PCRdUTPUNG4
Q-PCRPCRPCRreal-time 190Taq DNA5PCR2real-time Q-PCR
PCRDNAPCRPCRPCRPCRreal-time Q-PCRPCRPCRPCRPCRreal-time Q-PCRthresholdPCR15baseline31510CtCtCtCtCt
DNASYBR green 1Real-time Q-PCRPCRSYBR green 1SYBR green 1DNAdsDNAdsDNAdsDNAmelting curve
PCRreal-time Q-PCRTaqManPCR53FRET5PCRTaq5-353DNAPCR
molecular beaconDNAPCRPCRsunrise primesscorpion primeshybridization probe3donor5acceptorPCRFRETmelting curve
1*nRNADNAbeta-actin,3-GAPDH
CTPCRCTCT=12
DNARNA260nmDNARNA
Q-PCRmRNADNASNPsreal-time Q-PCR
MRDReal-time Q-PCRAMLt(821) (q 22q22)AML-18MTG8AML-1real-time Q-PCRMRDCMLBCR-ABLALLTEL-AML1FLt(14;18)(q32;q21)bcl-2real-time Q-PCRReal-time Q-PCR
IL-1IL-23IFN-IFN-CSFTNFTGF-MCP-1MIP-1mRNAreal-timePCRRT-PCR
ATPATP-binding cassette
superfamilyMDR-1P-P-gpMRPLRPBCRPTopoGSH-S-GSTCPKCdeoxycytidine kinasebcl-2p53c-mycMDRreal-timePCRRT-PCRmRNA
Q-PCRPCRreal-time Q-PCRmRNARNARTPCRReal-time Q-PCR12real-time Q-PCRmultiplex3real-time Q-PCR
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鸭IFN-γ mRNA实时荧光定量RT-PCR方法的建立
维普资讯 动 物医学 进展 ，０ ８ ２ （ ） １ ―０ ２ ０ ，９ ５ ：７２ 　Ｐｒ ｒ ｓ 　ｎ Ｖｅ ｅ ｉ ａ ｙ Ｍ ｅ ｉ ｉ 　 ｏｇ ｅ ｓｉ 　 ｔ ｒｎ ｒ 　 ｄ ｃｎｅ鸭 Ｉ Ｎ一 ｍＲＮＡ 实 时 荧 光 定 量 ＲＴ― Ｃ 方 法 的 建 立　 Ｆ 　 Ｐ Ｒ谢 秀 兰　 ， 。 汤　 承　 杨 发 龙　 岳　 华　 ， ，（ ． 南 民族 大 学 生 命 科 学 与 技 术 学 院 。 １西 四川 成都 ６ ０４ ；． 北 医 学 院 微 生 物 与 免 疫 学 教 研 室 ， １０ １ ２ 川 四川 南 充 ６ ７０ ） ３０ ０　摘　 要 ： 建立检 测 鸭 Ｉ Ｎ一 为 Ｆ 　ｍＲ ＮＡ 表 达的 实时荧光定 量 Ｒ Ｐ Ｒ方 法 ， 据 Ｏｅ Ｂ ｎ Ｔ― Ｃ 根 ｎ ａ ｋ中鸭 Ｉ Ｎ一 Ｆ 　基　因序 列 ， 在保 守区域 设计 并合 成 一对 引物 ， 用 Ｓ Ｒ Ｇｒｅ 　 染料 ， 立检 测 鸭 Ｉ Ｎ一 采 ＹＢ 　 ｅｎＩ 建 Ｆ 　ｍＲＮＡ 的 实 时荧光　 定量 Ｒ － Ｃ 方法 （ｅ ｌ ｉ 　 Ｔ Ｐ Ｒ 。试验 以 Ｐ Ｒ产物 为标 准 品 ， 立标 准 曲线 ， ＴＰ Ｒ ｒａ ｔ ― ｍｅＲ ― Ｃ ） Ｃ 建 随后 进 行 熔 解 曲线分　析和 稳定性研 究。结 果 Ｃ 值 线性 范 围为 １ ． ～３ ． ， 关 系数 为 ０ ９ ７ 熔 解 曲线 显 示产 物为 单特 异 峰 ， ｔ ２ Ｏ ３０ 相 ．９； 　Ｔ 为 ８ ． ±Ｏ℃； 内变异 系数 （ Ｖ ） ４ ２　 ； 间试验 无显 著差 异 （ ｍ ２５ 组 Ｃ 　 为 ．６ 纽 Ｐ＞ ０ ０ ） ． ５ 。建 立 的检 测鸭 Ｉ Ｎ 　 Ｆ 一ｍＲ ＮＡ 的 Ｒ ａ ｔ 　 ― Ｃ ｅｌ ｉ ＲＴ Ｐ Ｒ方 法具 有检 测 范围广 、 增效 率 高、 ― ｍｅ 扩 特异 性 好 、 重复性 和稳 定性 良好等 特点 。 　关 键词 ： ； 干扰 素 ； 时荧光 定量 Ｒ Ｐ Ｒ； Ｙ Ｒ Ｇ ｅｎＩ 鸭 　 实 Ｔ― Ｃ Ｓ Ｂ 　 ｒｅ 　 　中 图 分 类 号 ：８ ２ ４ ￥ ５ ． ２ ￥ ５ ． ；８ ８ ３　 文献标识码 ：　 Ａ文章 编 号 ：０ ７５ ３ （ Ｏ８ Ｏ 一０ ７Ｏ　 １ ０ ―Ｏ ８ ２ Ｏ ） ５Ｏ １一４干扰 素 （ ｔｒｅｏ ，Ｆ 具 有广 谱抗 病 毒 、 肿　 ｉ ｅｆｒ ｎ Ｉ Ｎ） ｎ 抗型和 Ⅱ型 ，Ｆ 　属 于 Ⅱ型 Ｉ Ｎ， Ｔ 淋 巴细 胞 和　 Ｉ Ｎ一 Ｆ 由瘤和 强大 的免疫 调节作 用 ， 目前 临 床 医学 、 是 肿瘤 学　 和免 疫学 等 领 域 的研 究 热点 之 一［扪。 Ｉ Ｎ 分 为 工 　 Ｆ 　收 稿 日期 ：０ ８０ － ７ ２ ０ － １０ 　Ｎ 细胞 产生 。Ｉ Ｎ一 机 体 的免 疫 应答 过 程 中起　 Ｋ Ｆ 　在着重 要 的作 用 ， 疾 病 的发 生 、 展 有着 密 切 的关　 与 发作 者 简 介 ： 秀 兰（ ９ Ｏ ） 女 （ 谢 １８ 一 ， 回族 ） 宁夏 银 川人 ， ， 助教 。 士 ， 要 从 事禽 病病 原 分 子 生 物 学研 究 。 ＊通 讯 作者　 硕 主［ ］ 裒 鸿 昌 ， 绍 基 ． 滩 地 区 血 吸 虫 病 流 行 因 素 与 优 化 控 制 策 略　 ８　 张 湖２ ―３ ． ３１ ２ ７　的研究 ［ 中国吸虫病防治杂志 ，９ ５ ７ ４ ：９―０ ． 刀． １ ９ ，（ ） １ ３２ １ 　ａ　 Ａ ｎ ｏ ｄ Ｂ　 ｅ　 １ ｍｂ ｎ ｄ ｍｉ ｒ ― ［ ］ Ｋａ ｓｍ　 Ｏ ，Ｄｅ ｎ Ｄ　 ，Ｍ ａ ｇ ｌ 　 Ｌ， ｔａ ．Ｃｏ ｉ ｅ 　 ｃ ｏ 　 ９　 ｓ ｉ Ｏ　 ａ ｔ ｇ ａ ｈ ｃ ａ 　ｈ ｓ ｏ ａ ｈ ｌ ｇ ｃ ａ ａ ｙ ｉ　 ｆ ｔ ｅ ｆ ｔ 　 ｆ ｈ ｌ ｕ ｏ ｒ ｐ ｉ 　 ｎｄ ｉｔ ｐ ｔ ｏ ｏ ｉ　 ｎ ｌ ｓｓ ｏ 　 ｈ 　 ａ ｅ ｏ 　ｃ ａ ― 　ｌ ｎ ｅ Ｓ ｈｉｔ ｓ ｍａ ｎ ｎ ｏ ￣ ｓ ｈ ｓ ｏ ｏ ｕ ａ ｎ ｍ ｉｅ ｍｍｕ ｉ ｅ 　 ｅ ｇ 　 ｃ ｓ ｏ ｏ 　ｒ ａ ｓ ｎ ｃ ｉｔ ｓ ｍ ｌ　ｉ 　 ｃ 　ｉ ｎｚ ｄ［Ｏ Ａｈ ａｌｈ　 Ｍ，Ｂ ｎａｅ 　 １］ ｄｌ ｉ ａ Ｏ　 ｅ ｓｌｍ Ｈ，Ａｕ ｉｒＲ，ｔａ． ｇｎ ｓ　ｘ　 ｇｅ　 ｅ　１Ａｒｉａｅｅ ―ｐ ｅ ｓｏ 　 ｎ ｐ ｒｔ ｎ ａ 　 ａ ｒ ｐ ａ ｅ 　 ｎ 　 ｎ ｒ ａ ｅ ｉ 　 ｉ ｃ ｌ ｔ 　 ｒ ｓ ｉ ｎ ｉ　 ｅ ｉｏ ｅ ｌｍ ｃ ｏ ｈ ｇ ｓ ａ ｄ ｉ ｃ 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法 等 ） 同 程 度 上　 Ｌ Ｓ ＭＴ 常 ―Ｃ 不７ ２℃ ５ｍｉ； 　 ｎ ４℃结 束 反应 。Ｐ Ｒ 产物经 ２　／ Ｃ ０ｇ Ｌ的　存在 着灵 敏度不 高 、 作 繁 杂 和 难 以准 确定 量 等 缺　 操点 。实 时荧 光 定 量 ＲＴ Ｐ Ｒ 技 术 （ ａ― ｍｅＲ ― ―Ｃ Ｒｅｌ ｉ 　 Ｔ 　 ｔ Ｐ Ｒ） ２ Ｃ 是 ０世 纪 ９ ０年 代 发 展起 来 的一 项 检测 核 酸　的新 技术　 ， 以其 灵 敏 、 特异 和快 速 的特 点 ， 速 被　 迅琼 脂糖凝 胶 电泳 ， Ｂ染 色 ， 外凝 胶 成 像 系统 进 行　 Ｅ 紫检 测后 ， 琼 脂 糖 凝 胶 上 切 下 目 的 片 段 ， 用 ３Ｓ 从 采 　　Ｓ ｉ　 ａｏ ｅＧｅ ＤＮＡ Ｐ ｒ ｉ ｔ ｎ Ｋｉ 剂 盒 按　 ｐｎＡｇ ｒｓ　 ｌ 　 　 ｕ ｉｃ ｉ 　 ｔ试 ｆａ ｏ说 明 书 回收 纯 化 。 以此 纯 化 的 Ｐ Ｒ 产 物作 为标 准　 Ｃ应用 于功 能基 因组 、 子 医 学 、 毒 学 、 生 物 学及　 分 病 微生 物工艺 学等 领 域 。在 细 胞 因子 的 表 达 研究 方 面 ， 　品 ，０倍 系列 稀释 后用 于建 立标 准 曲线 。 １ 　１ ３ ３ Ｒ ａ ｔ 　 ― Ｃ 条 件 的 优 化　 采 用　 ． ． 　 ｅ ｌ ｉ ＲＴ Ｐ Ｒ ― ｍｅ Ｓ Ｒ Ｇｒｅ 　 ＹＢ 　 ｅ ｎ Ｉ染 料 法 ， ｉ ｙｌｒｉ Ｍ荧 光 定 量　 在 Ｃｃ 　 ｅ 　Ｒｅｌ ｉ 　 － Ｃ 已 成 为 主 流 的 研 究 工 具 ［ 。 ａ― ｍｅＲＴ Ｐ Ｒ ｔ ８ 　 　而 目前 尚未见 用 该 方法 检 测 鸭干 扰 素一 　表达 的报　 道 。本试 验建 立基 于 Ｓ Ｒ Ｇｒｅ　 染 料 法 的检测　 ＹＢ 　 ｅｎ Ｉ 鸭 Ｉ Ｎ 　基 因 的 Ｒｅｌ ｉ 　 Ｔ Ｐ Ｒ 方 法 ， 研 究　 Ｆ 一 ａ― ｍｅＲ － Ｃ ｔ 为 鸭 Ｉ Ｎ 　在 鸭 体 对 鸭 病 原 的应 答 中 的作 用 打下 基　 Ｆ 一础。 　Ｐ Ｒ仪上 进行 扩增 和 数 据 分 析 。 由于 扩增 片段 仅　 Ｃ ８ 　 ｐ 为 缩 短 反 应 时 间采 用 两 步 法 。反 应 体 系 为　 １ｂ ，２ Ｌ， 出现 最 小 的 Ｃ 值 和最 高 的荧 光值 ， ５肚 以 ｔ 以及不　出现 非特 异 的扩 增 产 物 为 标 准 。分 别对 循 环 条件 、 　褪火 温度 、 物浓 度进 行优 化 。 引 　１ 材 料与 方法　１ １ 材 料　 ．１ ３ ４ 标 准 曲线 的建立 采用 优化好 的条件对 ＩＩ一 ．． Ｆ 　 Ｎ 进 行 Ｓ Ｂ 　 ｒｅ 　 Ｒ ａ ｔ 　 Ｔ Ｐ Ｒ， Ｃ 值为 纵　 Ｙ Ｒ Ｇ ｅｎＩ ｅｂｉ Ｒ － Ｃ 以 ｔ 　 ｍｅ 健 康樱 桃谷 肉鸭 ， 自成 都某 肉　 购 ｉ ｃ ｒｉ Ｍ Ｃｙｌ 　 ｅ ＱＴ 荧光 定 量 Ｐ Ｒ仪 ， Ｃ 　 坐标 ， 以稀释倍 数 的对 数为横坐标 ， 建立标准 曲线 。 　 １ ３ ５ 熔 解 曲线 分析　 为排 除非 特 异性 扩 增产 物　 ．．及 引物 二 聚 体 对 ｒａ ｔ 　 Ｔ― Ｃ ｅ ｌ ｉ Ｒ Ｐ Ｒ结 果 影 响 的 可　 ― ｍｅ１ １ １ 实验 动物 ．．鸭场 。 　１ １ ２ 主要 仪器 ．．凝 胶成像 系 统 Ｄｏ２ ０ ｅ０ ０为 美 国 Ｂ ｏＲ ｄ公 司产 品 ； ｉ― ａ 　 Ｔｈ ｒ 　 ｂ ｉ　 ｘ 　ｈ ｒ ｌ ｙ ｌｒＰ Ｒ仪 为 英 国　 ｅｍｏＨｙ ａｄＰ ２ｔ ｅｍａ ｃ ｃ 　 Ｃ 　 ｅＴｈ ｒ 　 ｂ ｉ 司产 品 。 ｅｍｏＨｙ ａｄ公 　 １ １ ３ 主要 试 剂　 Ｓ Ｂ 　 Ｐ ｅ ｘ Ｅｘ Ｔ ｑ Ｔ 　 ．．　 Ｙ Ｒ ｒｍｉ　 　 ａ 　Ｍ、能性 ， Ｐ Ｒ 结 束 后 进 行 熔 解 曲 线 分 析 以 确 定　 在 Ｃ Ｐ Ｒ产 物是否 为 目的片段 。温度 以 ０ ５℃／ ０Ｓ的　 Ｃ ． １　 速率 从 ５ ５℃缓慢 上升 到 ９ ４℃ ， 续测定 Ｐ Ｒ产物　 连 Ｃ的荧 光强 度 以获取熔 解 曲线 。 　ＲＮＡｉ 　 ａ ｅ ｔ Ｔ ｑＤＮ 聚合酶 、 ｓ Ｒｅｇ ｎ 、 ａ 　 Ａ ｏ ＲＮＡ Ｐ Ｒ Ｋｉ 　Ｃ 　 ｔ 　（ ＡＭＶ） ｒ ３ ０均 购 自 Ｔ ｋ ｒ Ｖｅ． ． ａ ａａ公 司 ； ｅ Ｅ ｔａ― Ｇ ｌ ｘ ｒｃ 　 　１ ３ ６ 重 复性 和稳 定性 试验　 ．．１ ３ ６ １ 组 内重 复性 ．． ． １ ３ ６ ２ 组 间重复 性 ．． ． 对 同一 样本 的 ｅ ＤＮＡ设 ２ 　 ０ 对 １ 递增 稀释 的标 准 品　 ０倍ｔ ｎＭｉｉ ｔ 自上 海华舜 生 物工 程 有 限公 司。 ｉ 　 ｎ　 购 ｏ Ｋｉ 　１ ２ 引物 设 计 及 合 成　 ．复管 同时 检测 ， 计算 其 Ｃ 值 的变 异 系数 （ ｖ ）　 ｔ ｃ 　 。 检测后 于 一２ ０℃保 存 ，０ ｄ后 重 检 ， ３　 比较 前 后 两次　 的扩增 结果 和标 准 曲线 的相关 性 。 　２ 结 果　 　 ２ １ 标 准 品 制 备　 ．参考 Ｇｅ Ｂ ｎ ｎ ａ ｋ中鸭 Ｉ Ｎ ７基 因的核 苷酸序 列 ， Ｆ － 　 根据 保守 区域 的序列 ， 计 １对 用 于荧 光 定 量 Ｐ Ｒ 设 Ｃ　的引物 ， 扩增 鸭 Ｉ Ｎ一 Ｆ 　基 因 ８　 ｐ的 片段 。引 物 由 １ｂ 　宝 生物 工 程 （ 连 ） 限 公 司 合 成 。上 游 引 物 ：　 大 有 ５一 　ＡＡＣ Ｃ Ｇ ＡＡＧＧＣ ＴＧＡＧＴ ＴＧ ＧＡＧ一 ； ３ 下游 引 物 ：　 　 ５一 　ＡＣＴＧＧＣ ＴＣ ＣＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＧＧ 一　　 ３。１ ３ 方 法　 ．　总Ｒ ＮＡ 经 反 转 录 合 成 ｅ ＤＮＡ 后 ，Ｆ 一 Ｉ Ｎ 　基 因　 进 行 Ｐ Ｒ 扩 增 ， 到 ８ 　 ｐ大小 的片 段 ， 预期 目 Ｃ 得 １ｂ 与 　的片段 大小 一致 （ １ 。 图 ）　２ ２ Ｓ Ｒ Ｇｒｅ　 ｒａ ｔ 　 － Ｃ 条 件 的 优 化　 ． 　 ＹＢ 　 ｅｎＩ ｅ ｌ ｉ ＲＴ Ｐ Ｒ 　 ― ｍｅ１ ３ １ 鸭 肝 脏 组 织 ＲＮＡ 的 提 取 与 反 转 录 用　 ．．　Ｒ ＮＡｉ 　 ｅ ｇ ｎ 提取 ＲＮＡ， 照说 明书进行 。ｃ ― ｓ Ｒ ａｅｔ ｏ 按 Ｄ　对 引 物及 退 火 温 度进 行 优 化 ， 到 的最 佳反 应　 得 体 系为 ：ＹＢ 　Ｐ ｅ ｘＥｘＴ ｑＴ １ ． 　Ｌ， 物各　 Ｓ Ｒ ｒｍｉ　 　 ａ 　Ｍ ２ ５ 引 ０ ２／ ｌＬ， 板 ２ Ｌ， ｄ Ｏ ９ ５ Ｌ； ． ￣ ／ 模 ｍｏ 　 ｄ Ｈ２ 　 ． 　 最佳 反 应　体 系为 ：５℃ ５ｍｉ ，５℃ １　 ，３ ７℃ ２　 ， 行　 ９ 　 ｎ９ ５Ｓ ６ ． ０Ｓ进４ ０个 循 环。 　ＮＡ 的合成按 ＲＮＡ Ｐ Ｒ Ｋｉ ＡＭＶ） ｒ３ ０说 明　 　Ｃ 　 ｔ （ Ｖｅ． ．书进行 。 　１３ ２ 标 准 品制备 以 ｅ ＮＡ 为模 板 ， ｈ ｒ 　 ― ．． Ｄ Ｔ ｅｍｏＨｙ　 ｂ ｉ Ｐ×２ｔｅｍａ ｃ ｃ ｒＰ Ｒ 仪 上 扩 增 Ｉ Ｎ ７基　 ａ　 ｄ 　ｈ ｒ ｌ ｙ ｌ 　 Ｃ 　 ｅ Ｆ 一维普资讯 ｆ　配　 Ｕ ｌ 　 芑时 暑　等们 ｌ１ 时 　ｔｌ 　们 　配Ｕ　谢 秀 兰 等 ： Ｉ Ｎ ７ｍＲ 鸭 Ｆ ＿　 ＮＡ 实 时荧 光 定量 Ｒ － Ｃ Ｔ Ｐ Ｒ方 法 的建 立　１　 ９２ ３ 标 准 曲 线　 ．以临界 循环 次 数 （ ｔ值 为纵 坐标 ， Ｐ Ｒ产 物　 Ｃ） 以 Ｃ 的拷 贝数的对 数 为横 坐标 ， 得标 准 曲线 （ ２和 图　 获 图 ３ 。结果 表 明 ，Ｆ － ） Ｉ Ｎ ７基 因扩 增 的线 性 范 围广 （ ７ 达 　 个 数量级 ， ｔ 在 １￣３ 之 间）相 关系数 ｒ ． ９ ￣ Ｃ值 ２ ３ ， ＝Ｏ ９ ７　２ ４ 熔 解 曲 线　 ．１５ 　 　 　 ０ ｂｐ １ 　 　 ００ ｂｐ ５０ ｂｐ―― 　 　Ｉ Ｎ一 Ｆ 　基 因片段 Ｐ Ｒ产 物 的 熔解 曲线 显 示 为　 Ｃ 单 特异 峰 ， 解 温度 Ｔｍ 值 为 ８ ． ±０℃， 明没有　 熔 ２５ 说 引物 二聚体 及非 特异 性 扩增 产物 （ ４ 。 图 ）　２ ５ 重 复性 和稳 定性 试验　 ．∞ Ｏ Ｏ Ｏ Ｏ Ｏ Ｏ Ｏ Ｏ Ｏ ０∞ 如 ∞ 　 　 　 　 　 　 　 　　 　 　 ∞ 如们 如加ｍｌ 　 ｌ 　９ 　８　 ７１ Ｍａｋｒ２ Ｉ ． ｒ ｅ ； ． ＦＮ－ ； ． ７ ３ ＮＴＣ　对 同一 ｅ ＮＡ 样 本设 ２ Ｄ Ｏ复管 检测 ， Ｎ＿ 因　 ∞ ∞ ∞∞ Ｉ 　基 Ｆ Ｃ 值变 异 系数 （ Ｖ　 ） ４ ２　 ， 增 曲线 见 图 ５　 ｔ Ｃ 为 ．６ 扩 ； 系列 稀释 标 准 品 相 隔 ３　 ０ ｄ的 两 次 检 测 结 果 ， 比　 经 较， Ｐ＞Ｏ ０ ， 明具 有 良好 和重复 性和稳 定性 。 ．５ 表 　０ ｕ 　 一ｌ∞ 　Ｉ 　 一　ｕ ｏ Ｉ０ ｌＬ －图 １ Ｉ Ｎ＿ 因 的 Ｐ Ｒ 扩 增 产 物　 　 Ｆ ７基 ＣＦｉ ． 　 ＰＣＲ　 ｒ ｄ ｃ ｓｏ 　 Ｆ ７ ｇ ｎｅ ｇ１ ｐ ｏ ｕ ｔ　 ｆ Ｉ Ｎ一 　 ｅ 　Ｃｏｒｅ ａ ｉ ｎ Ｃｏ ｆ ｉ ｉ ｎｔ ９ ７ Ｓ ｏ ｅ － ． ％　 ｒ ｌ ｔｏ 　 ｅ ｆｃ ｅ ： ７ 　 ｌ ｐ ：３ ２ ０．∞勰 　加 　ｍ 　Ｉ Ｎｗ　 Ｆ： ： 　 ： 　 。，； ｉ 　　 ；∥　ｉ： ｌ ＿ ｉ ｌ 　 ｌ 　 ｌｌ 　 ㈠ ｌ ； 　㈡ ； ｉ 　Ｉ ｔ ｒ ｅ ｔ ３ ? ８ 　 － ２％Ｘ＋３ ? ８ 　 。 Ｕ ｎ ｅ ｃ ｐ ： ７ ８ ０ Ｙ＝ ３? ７８ ０ｎ ｎ ｗｎ　 ｋ Ｏ ｓＰ ＣＲ Ｅｆｉ ｉ ｎ ｙ： ０１ １ ｆ ｃ ｅ ｃ ｌ ． ％　ｏ Ｓ ａ ａｄ 　 　 ｌ ｎｄ ｒ ｓ０　：　ｌ 　 ｌ＿　 ／ ｌｌ矿 　 　 ｌ　 ；。叠 二　 琴　 ０ｉ ＿ ｌ ￡童 　 　 　 ｌ ｌ．、 　、 － 　删 ．。 Ｙ 　、 ｄ 　　 ：　 ：　 ｊｊ 　 ， 　 ，　 ｌ 　 ￡　 。 ｔ 　 矗垂　～蠢　 ｉ 　 ｉ 　蔓 　； ． ． 　 ０　 　 ．＿　…、． 　一　 ：　 …… 　．　笔　： 蠢　＿： 　 一 一―　 ＿ － 　 １ ｉ 一 蔓 一 一 　０ 　１ 　２ 　３ 　４ 　５ 　６ 　７ 　ｌｇＳａｔ ｇＱｕ ｎｉｙｃ ｐ 　ｕ ｅ　 ｏ 　ｔｒｉ 　 ａ ｔ ，ｏ ｙｎ ｍｂ ｒ ｎ ｔ图 ２ ＩＮ－ 　 Ｆ ７基 因的 动 力 学 扩增 曲线　Ｆｉ ． 　 Ｔｈ 　 ｙ ａ ｃ ａ ｌ ａ ｉ ｎ ｃ ｒ ｅ ｏ 　 ＦＮ－ 　 ｅ ｅ ｇ２ ｅ ｄ ｎ ｍｉ　 ｍｐ ｉ ｔｏ 　 ｕ ｖ 　 ｆＩ ｃ ７ｇ ｎ　图 ３ Ｉ Ｎ ７基 因的 标 准 曲线 （一０ ９ ７　 　 Ｆ － ｒ ．９）Ｆｇ ３ Ｔｈ 　 ｔｎ ａ ｄ ｃ ｒ ｅｏ 　Ｆ ７ ｇ ｎ （ ＝ ０ ９ ） ｉ． 　 ｅｓａ ｄ ｒ 　ｕ ｖ 　 ｆＩ Ｎ－ 　 ｅ ｅ ｒ ． ９７　Ｉ Ｎ吖 　 Ｆ； 　㈠　 ； ！ ｉ 　 　 　 ： 　 　ｉ ｉ 　ｉｊｊｉ 　 ！　 　ｌ＿ ｊ ｌ 　 　 ｉ 　 　０ － ； 尊下 。 　 　 √　 旋 　 ■　 ■ 　 一一 　．Ｅ 　 ； 　 ｉ； 　ｊｉ 　　　 嚣… ｉ攘 　 ｊ ｛ 　蓬螽 ≤　ｉ　 　 ｊ 　 　 ｉ ｌｉ ＮＴＣ 　 　ｉ 　 …。 垂 　 ： ｉ 　 一 　露 　ｌ蔓 　　 ｉ ｌ 　 　 Ｎ ｃ　 ｌ■曩　 Ｔｌ６ 　Ｃｙｃ ｅ ｌ　图 ４ Ｉ Ｎ ７ 因 的熔 解 曲线 （ 　 Ｆ －基 Ｔｍ：２ ５ ＂　 ８ ． ￣０Ｃｌ 　Ｆｉ． 　 Ｔｈ 　 ｌ　ｕｒ ｅｆｒＩ ｇ４ ｅｍｅｔｃ ｖ 　ｏ 　ＦＮ－ ｇ ｎ （ 　 ｅ ｅ Ｔｍ ： ２ ５士 Ｏ℃ ） ８． 　图５ 设２ ０复 管 检 测 Ｉ Ｎ ７基 因 的 扩 增 曲线　 Ｆ －Ｆｉ． 　 Ｔｈ 　 ｍｐｉａｉｎ ｃ ｒ ｅｏ 　Ｆ ｙ ｇ ｎｅ（ ０ ｔｍｅ ） ｇ５ ｅａ ｌ ｔｏ 　ｕ ｖ 　ｆＩ Ｎ－ 　 ｅ ｃ ２ 　ｉ ｓ　３ 讨 论　生 高 水 平 的 Ｉ Ｎ一 从 而 维 持 了 潜 伏 感 染 状 态 。 Ｆ 　， 　干扰素 对免 疫 反 应 ， 炎症 反 应 具 有 重 要 的调 节　 Ｔ ｎ 　 Ｔ 等［ 在 研 究 病 毒 性 肝 脏 纤 维 化 时 ， 为　 ａ ｇＪ 　 ３ 　 认 作 用 ， 通 过调 节 免 疫 反 应 （ 括 淋 巴 细胞 活化 、 它 包 增　 Ｉ Ｎ一 Ｆ 　的表 达水 平 与肝 脏 纤 维 化 的严 重 程度 呈 负相　 殖 、 化 、 存 和 凋 亡 ） 免 疫 系统 中起 着 重 要 的作　 关 。此外 ， 分 生 在 对单 纯疱 疹 病毒 （ Ｖ） ＨＳ 感染 后 Ｉ Ｎ 表 达　 Ｆ用 。Ｋ ｉ ｒ ａｓ 　 ｅ Ｐ等［ 研究 鸡 干扰 素对 抗 马立 克 品种鸡　 水平 变 化 的 研 究 表 明 ， 毒 感 染 能 诱 导 机 体 表 达　 １ 胡 病 感 染 马立 克病 毒 后 的应 答 ， 明病 毒 感 染 可 诱 导 产　 Ｉ Ｎ［ 同 时 ＨＳ 通 过 阻 断 Ｉ Ｎ 信 号通 路 来 抵 抗　 表 Ｆ １ 　， Ｖ Ｆ维普资讯 ２　 ０动 物 医学 进 展２０ ０ ８年第 ２ ９卷第 ５期 （ 总第 １ ７期 ） ７ 　ｃ ａ ｇ ｓｎｔｅｂ ｎ　 ｒｏ ｏ　ｏ ｓ ｔ　 ｉ ｍａ ｉｓ ［］ Ｖｅ ｈ ｎ ｅ　 　ｈ　ｏ ｅｍａｒｗ　ｆｄｇ　 ｈｌｓ ｉ ｗｉ ｅ ｈ ｎｏｉ Ｊ ． ｔ ｓ 　Ｒｅ ， ０ ６， ５ （ ０ ６ ０ ６ ４　 ｃ ２ ０ １ ８ ２ ）； ９ － ９ ．机 体 Ｉ Ｎ对 其抑 制 作 用 ， Ｆ 以上 试 验 均 表 明 干扰 素在　 疾 病 的发病 机理及 机 体对 各种 病 原微 生物 的免 疫应　答 中发 挥关键 作用 。 　为研究 干扰素 的免 疫调 控 机理 、 病毒 与机 体之 间　 的相互关 系以及机 体对 病 原体 的免 疫 应答 ， 干扰 素　 对 ｍ ＮＡ表达 的准 确定 量 是非 常重要 的 。然 而 干扰 素　 Ｒ 含量很低且 蛋 白半 衰期 短 ， 常用 检测 干扰 素 蛋 白及 基　 因的方法 （ Ｅ ＩＡ、 如 Ｌ Ｓ 放射免 疫法 和免疫荧光 法 、 Ｔ ＭＴ 　 法、 常规 Ｐ Ｒ法等） 同程度地存 在着灵敏 度低 、 Ｃ 不 操作　 复杂 、 污染 环 境 、 时 和 难 以精 确 定 量 ， 耗 对操 作 者 、 环　［］ Ｆｅｃ ｉ ． ｎ ｅｉｎｓｓｅ ｔ ｉｔ　ｏｍｙｏ ａｔｒ ｌ ｉｅｓ． ｅ ５ ｉｓｈ Ｃ Ｍｅ ｄ ｌ 　ｕｃｐｉ ｌｙｔ　 ｃｂ ｃｅｉ 　 ｓａｅｄ － 　 ａ ｂｉ ａｄ 　 ｆｃｓｉ ｔｅＩ－２ Ｉ Ｎ　ａ ｅｔ　 　ｈ　Ｌ １／Ｆ ｇ ｍｍａ ａｈ ｙＪ ． ｒｓ　 ｄ ２ ０ ，５ ｎ 　 ｔｗａ ［］ Ｐ ｅｓＭｅ ，０ ６ ３　 ｐ（ － ）： ７ － ８ ． ５Ｃ２ ８ ９ ８ ６　［］ Ｋａ ｇＢＹ， ｍ　 　 ．Ｔａｇ ｔ ｇｃｔｋｎ ｓｏ　ｈ 　 ｔｒｅｋｎ１　 ６ ｎ 　 　 Ｋｉ Ｔ Ｓ ｒｅｉ 　ｙｏ ｉｅ　ｆｔｅｉ ｅｌｕ ｉ－２ ｎ ｎ ｆｍｉ 　 　 ｕｏｍｍｕ ｉ ［ ］ Ｃ ｒ　 ｄ Ｃ ｅ ２ ０ ， ３（ Ｏ ； ａ ｌ ｉ ａ ｔｉ ｙｎ ｎｔ Ｊ ． ｕｒ Ｍｅ　 ｈ ｍ， ０ ６ １ １ ）　 ｙ１ ４ － １ ６　 １ ９１５ ．［ ］ Ｈｉｕ ｈ　 Ｄ ｌｎ ｅ　 Ｗ ａ ｈＰＳ ｅ　１ ｉ ｌ ｎ ｏｓａ ｌ　 ７ ｇ ｃｉ Ｒ， ｏｌ ｇ ｒ ｉ Ｇ， ｌ 　　， ｔ ．Ｓｍｕｔ ｅｕ　ｍｐｉ ｓ ａ ａ ― ｆ ａｉｎａ ｄｄ ｔｃｉｎ ｏ　ｐｃｆ 　 ｉ ｔ 　ｎ 　ｅｅｔ 　 ｆｓｅｉｃＤＮＡ ｓｑ ｅｃｓ Ｊ ．Ｂｏｅｈ　 ｃ ｏ ｏ ｉ 　ｅｕ ｎ ｅ［］ ｉｔｃ―ｎ ｌｇ ｏ ｏ ｙ，１ ９ ９ ２，１ ４１ － ７　 ０； ３ ４１ ．［ ］ Ｂ ｓｉ　 　 ８ ｕ ｔ Ｓ Ａ，Ｂ ｎｓＶ，Ｎｏａ 　 ｅ　 １Ｑｕ ｎｉ ｔ ｅｒａ－ｍｅ ｎ ｅ ｅ　 ｌｎ Ｔ， ｔａ． ａ ｔ ａｉ 　ｅｌｉ 　 ｔ ｖ ｔ境造成毒 害 的 问题 。而 Ｒ － Ｃ 是 目前 国内 外检 测　 ＴＰ Ｒ核酸最 为快 速 （ 制 备 样 品 到 报 告 结 果 仅需 １ｈ 　 从 　 ～３ ｈ、 ） 灵敏 （ 低 可 以检 测 到一 个 基 因 的拷 贝） 高通 量　 最 、 （ １次可 以同时检 测 ９ ６个 或 ３ ４个 样本 ） ８ 和特 异 的方　 法， 在细胞 因子 的定量 中越 来 越 受 到青 睐 。因此 ， 本　 试验建立 了基于 Ｓ Ｂ 　 ｒｅ 　染 料法 的检 测鸭 ＩＮ－ Ｙ Ｒ Ｇ ｅｎＩ Ｆ 　 ７ ＮＡ的实时荧光定 量 Ｒ ＿Ｃ ｍＲ Ｔ Ｐ Ｒ方法 。从试验 结果　 可 以 看 出 ， 建 立 的 检 测 鸭 ＷＮ ７基 因 的 ｒ ｌ ｉ 　 所 － ｅ －ｍｅ ａｔＲ Ｐ Ｒ－ａｐｒｐｃｉｅ Ｊ．　 ｌ　 ｎ ｏ ，０ ５ ３ ：９－０ ． Ｔ－Ｃ 　ｅｓ ｅｔ ［］ ＪＭｏｅＥ ｄ ｃ２ ０ ，４ ５ ７６ １ ｖ 　［ ］ Ｚ ａｇＺ， ａｈｒｄ ｉ　　 Ｄｏｌ ｅ　１Ｃｙｏ ｉｅａ ｄＴ ｌｌ ｅ ９ ｈ ｎ 　 Ｂ ｓ ｉ ｄｎＪＢ， ｅ Ｃ，ｔ ． ｔｋｎ　ｎ 　 ｏｌｉ 　 ｕ 　 ａ ―ｋｒ ｃｐ ｏ 　 ｅ ｅ ｔ ｒ ｍＲＮＡｓ ｉ 　ｔ ｅ ａ ａ ． ｓ ｏ ｉ ｔ ｄ ｌ ｍ ｐ ｏ ｄ ｉ ｓ ｓ ｏ 　 　 ｎ ｈ 　ｎ ｓ １ａ ｓ ｃａ ｅ 　 ｙ ｈ ｉ 　ｔｓ ｕｅ 　 ｆｃｔ ｅｄ ｒ ｇｆｏ－ｎ－ ｕｈｄｓａｅｖｒｓｉｆｃｉｎ Ｊ．　 ｏ 　 ａｔ 　ｕｉ 　 ｔ ｄｍｏ ｔ　 ｉ ｓ　ｉｕ　 ｅｔ ［］ ＪＣ ｍｐ ｌ ｎ ｏ ａ ｅ ｎ ｏＰａｈｏ ，００ ｔ １２ ６，１ ４（ ）： ０ ６ ． ３ １ ６ ― ６　［Ｏ Ｌ ｅＹ Ｗ ， ｒｎ　 Ａ， ｐｉｎ ｕＮ，ｔａ． ｍａ　 １ ］ ｅ　 　 Ｈｉａｉ Ａ　 Ｋｙ ｒ ｏ 　 ｅ　１Ｈｕ ｎｉ ａ ｍｍｕ ｏ ｅ　 ｎ ｄ―ｆ ｉ ｎ ｙ ｒ Ｓ １ Ｔａ 　 ｒ ｔ ｉ　 ｐ ｒ ｇ ｌ ｔ ｓ ｉ ｔ ｒｅ ｋ ｎ ６ ａ ｄ ｉ ― ｉ ｅ ｃ 　 ｕ － 　 ｔ ｐ ｏ ｅ ｎ ｕ － ｅ ｕ ａ ｅ 　ｎ ｅ ｌ ｕ ｉ － 　 ｎ 　ｎ 　 ｃｔｒｅｋｎ８ｅ ｐｅｓ ｎ ｉ　 ｕ ｎ ｂ ｅｓ　ａ ｃｒｃｌ ［ ］ ｎ　 ｅｌｕ ｉ－　ｘ ｒｓｉ 　ｎ ｈ ｍａ 　 ｒａｔｃｎｅ　 ｅｌ Ｊ ．Ｉ－ ｏ ｓｆａ ｌｍｍ　 ｓ ２ ５， ４ ９ ３ ０ ３ ９． Ｒａ ，００ ５ （ ）： ８ ― ８ 　Ｒ －Ｃ Ｔ Ｐ Ｒ方法具 有 检 测 范 围广 、 异 性 好 、 增 效 率　 特 扩 高 、 复性和稳 定 性 良好 等特 点 ， 进 行 鸭病 原 与 鸭　 重 为体相 互关系 的研究 打下基础 。 　参考 文献 ： 　［ ］ Ｐ ｚａｓａ ａＶ　 １ ｏｈ ｒｋ ｙ　 Ｐ，Ｗ ｅｋａ ｄＬ Ｌ ａ ｌｎ 　 　 ，ＯｆｅｍａｎＭ　 Ｉｈｂｔ ｎ ｆｒ ｎ 　 Ｋ． ｎ ｉｉｏ 　 ｉｏ 　ｎ ｅ ｔｏ ｓ ｈｕ ｎ ｈ ｒ ｅ ｖ ｒ ｓ ８ ｐ ｏ ｃ ｉ ｎ ｂ 　 ａ ｆ ｉ ｆ ｃ ｉ ｕ 　 ｍａ 　 ｅ ｐ ｓ ｉ ｕ 　 　 ｒ ｄｕ ｔｏ 　 ｙ ｇ ｍｍａ ｉ ｔ ｒ 　 　ｎ ｅ―［ １ Ａｎ ｗｏｔ　 Ｍ ， ｐｅｏ 　 Ａ， ｉｋ ｒ 　 ，ｔ １Ｔｈ　ｆ ｃ　ｆ １］ ｉｓ ｒｈＤ　 Ａｐ ｌｔｎＪ Ｅｃ ｅ　 Ｗ ｅ　 ． ｅ ｆ ｔ 　 　 Ｓ ａ ｅｅ ｏｓｒ ｎ ｕ 　 ｘ ｒ ｉｅｏ 　 ＲＮＡ　 ｏ ｃ ｎ ｒｔｏ ｓ ｏ　ｎ ｅ ｌｕｋｎ １ 　 ｔｅ ｏ ｓｅ ｅｃｓ　 ｎ ｍ ｃ ｎ ｅ ｔａｉｎ 　 ｆｉｔ ｒｅ ｉ－ ２，ｉ ｅ ｆ ｒ ｎ ｇ ｍｍ ａ ａ ｄ ｉ ｔ ｒｅ ｋ ｎ ４ ｉ 　 ｑ ｉ ｅ ｐ ｌ ｎ ｒ 　ａ ｄ ｎｔ ｒ ｅ ｏ － ａ 　 ｎ 　 ｎ ｅ ｌ ｕ ｉ － 　 ｎ ｅ ｕ ｎ 　 ｕ ｍｏ ａ ｙ ｎ 　ｐ ｔ ｈ ｒｌ ｌｏ 　 ｎ ｎ ｃｅｒｃｌ ［］ 、 　ｍｍｕ ｏ Ｉ ｅｉ ｅａ　 ｏ ｄｍｏ ｏ ｕ ｌａ　ｅｌ Ｊ ．　ｔ ｐ ｂ ｓ Ｉ ｎ ｌ ｍｍｕ ｏ　 　 ｎ―ｐ ｔｏ１２ ０ ９ （ ）： ４７ｌ　 ａｈ ， ０ ３， １ １ ６ ― Ｊ［２ Ｈｏｍ　 Ｎｙ ｏｄＣ Ｇ， ｌｕ ａ 　　 ｅ　１Ｉｔｒ ｕ ｉ－１ ＿ ＮＡ　 １］ ｌ Ｃ， ｖ ｌ　　 Ｐａ ｄ ｎＳＲ，ｔ ．ｎｅｌ ｋｎ２　 Ｒ ａ ｅ ｍ ｅｐ ｅｓ ｎｄ ｒ ｇｖｒ ｓｉｆｃｉｎ ［］ Ｃ ｔｋｎ ，０ ６ ３ （ ）　 ｘ ｒｓｉ 　ｕｉ 　ｉ 　 ｅｔ ｓＪ ． ｙｏ ｉｅ２ ０ 。３ １ ： ｏ ｎ ｕ ｎ ｏ４ － ５　 １４ ．ｆｒｎａ ｄ ａ ｈ 　ｎｅｆｒｎｉ　 Ｃ Ｌ １ｃｌ ［ ］ 　 ｎ Ｖｉ ｌ ｅｏ 　ｎ 　ｌ ａｉｔｒｅｏ 　ｎ Ｂ Ｂ 一 ｅｌ Ｊ ．ＪＧｅ　 ｒ ， ｐ 　 ｓ ｏ　２ ０ ８ （ ０ ２ ７ ― ７ ７　 ０ ４， ５ １ ）： ７ ９２ ８ ．［３ Ｋａｓｒ １］ ｉ 　 ｅ Ｐ，Ｕｎ ｅｗ ｏ　 Ｄａｉｏ　 ． ｉ ｅｅｎｉｌ ｙｏ ｉｅｒ― ｄ ｒ ｏ ｄＧ， ｖｓｎ Ｆ Ｄｆ ｒｒｔ 　 ｔｋｎ　ｅ ｆ ａｃ 　ｓ ｏ ｓ ｓｆ ｌ ｗｉｇ ｍ ａ ｅ ｓｄｓ ａ ｅ ｖｒ ｓｉｆｃ ｉｎ ｏ　ｈｉｋ ｎｓ ｐ ｎ ｅ　ｏｌ ｎ 　 ｒｋ， 　 ｉｅ ｓ　 ｉｕ 　ｎ ｅ ｔｏ 　 ｆｃ ｃ ｅ 　 ｏ［ ］ Ｆ ｙＥ， ｉ Ｗ ａ ｇＣ，ｔ １Ｒｅ ｕａｉ 　 ｆｎｅｆｒｎｒｇ ｌ ｉｎ ２ ｏ　 Ｌ　 Ｋ， ｎ　 ｅ　 ． ｇ ｌｔ ｎｏ　 ｔｒ ｏ 　ｅｕａ ｏ 　 ａ ｏ ｉ ｅ ｔ ｆｃｏ－　 ｙｔｅｈ ｐ ｔｉ Ｃ ｖｒｓｓｒ ｅｐｏｅｓ ［ ］ Ｓ ｉ ｃ， ａｔｒ３ｂ 　ｈ　 ｅａｉｓ 　 ｉ 　 ｅｉ 　 ｔｔａｅ Ｊ ． ｃ ｎ ｅ　 ｔ　 ｕ ｎ ｅ２ ０ ３ ０： １ ５ １ ４ ． ０ ３， ０ １ ４ － １ ８ 　ｄｆ ｒ ｇｉ　ｅｉｔｎ ｅｔ　 ｒｋ ｓｄｓａｅＪ ．　 ｒ１２ ０ ，７ ｉｅｉ 　 ｒｓｓａ ｃ　ｏｍａｅ ，　ｉｅｓ［］ Ｊｖｉ ，０ ３ ７　 ｆ ｎ ｎ ｏ（ ）： ６ ― ６ 　 １ ７ ２ ７ ８．［ ］ ＴａｇＪＴ， ａ ｇＪＹ， 　 Ｑ，ｔａ． 　ｅ　 ３ ｎ 　 Ｆ ｎ 　 Ｇｕｗ　 ｅ　１Ｔ ｃｌ ｉ 　 　 ｌｍｍｍｕ 　ｅｐｎ ｅｉ ｅｒｓ ｏ ｓ　 　 ｓｃ ｒ ｌ ｔ ｄ ｗｉｈ ｆｂ ｏ ｉ　 ｎ 　ｎ ｌｍ ｍａ ｏ ｙ ａ ｔｖ ｔ 　ｎ ｈ ｐａ ｉｉ　 ｏｒ ｅａ ｅ 　 ｔ 　 ｒ ｓｓ ａ ｄ ｉ ｆａ ｉ ｔ ｒ 　 ｃ ｉ ｉｙ ｉ 　 ｅ ｔｔｓＢ　［４ Ｐ ｄ ｒｅ 　　 Ｈａｈ　 ， ｇ ｎｅ　 　 ． ｌ ｋ ｄｒｓ ｔｎｅｏ　 １］ ｅｅｓｎＥ Ｂ， ａ ｒＳ Ｍｏ ｅ ｓｎＳＣ ｘ―ｎ ｅ　ｅｉ ａ ｃ　 ｆ ｉ ｓｍｉ ｅ ｔ 　 ｉ ｈ ｄ ｓ ｓ ｏｆ ｈ ｒ ｅ 　 ｉ ｐ ｅ 　 ｉｕ 　 ｙ ｅ ２ ｃ ｒ ｅ ａ ｅ 　 ｃ 　ｏ ｈ ｇ 　 ｏ ｅ 　 　 ｅ ｐ ｓ ｓｍ ｌｘ ｖ ｒ ｓ ｔ ｐ 　 　 ｏ ｒ ｌｔ ｓｃｒｈ ｔ ｓＪ． ｏｌ　 Ｇ ｓｒｅ ｔｒｌ２ ０ ，２ １ ） ３ １―０ ９ ｉｒｏｉ ［］ Ｗ ｒ Ｊ ａｔｏ ｎｅｏ ，０ ６ １ （ ９ ：０ ５３ １ ． ｃ ｄ　 　 ［ ］ Ｆ ｇｉ Ｍａ ｚ ｌ　 ＲｅｔｃｉＢ， ａ ａ ｏＡ．ｅ　１ Ｐ ｔｏｏ ｉ ｌ ４　 ｏ ｌ　 ｎｉｏ Ｖ， ｓｕｃ ａ ｌ 　 Ｐ ｇｎ 　 ｔａ． ａｈ ｌｇｃ 　 ａｗｉ 　ａｌ　 ｔｒ ｒｎ ｐｏ ｕ ｔ ｎ［ ］ Ｉｆｃ　ｍｍｕ ， ９ ３ ２ ｔ ｅｒ ｉ ｅｆ ｏ 　 ｒｄ ｃｉ Ｊ ．ｎｅｔＩ ｈ ｙｎ ｅ ｏ ｎ １ ８ ，４　（ ）： ４ ― ４ ． ２ ７ ０ ７ ６　Ｅｓ ａ ｉｈ ｅ 　 ｆ Ｒｅ ｌｔｍ ｅ ＲＴ－ ｔ ｂｌｓ ｍ ｎｔ ｏ 　 ａ － ｉ 　 ＰＣＲ　 ｏ 　 ＦＮ－ 　 ＲＮＡ　ｎ　 ｃ 　 ｆ ｒＩ ｙｍ ｉ Ｄｕ ｋＸＩ Ｘｉ －ａ 　 ，ＴＡＮＧ　 ｈ ｎ 　 Ｅ　 ｕ ｌ ｎ Ｃ ｅ ｇ ，ＹＡＮＧ　 ａ ｌ ｎ 　 Ｆ ―ｏ ｇ ，ＹＵＥ　 ｕ 　 Ｈ ａ（． ｏｌｇ　ｆＬ ｆ 　ｃｅｃ　ｎ 　 ｃｎ ｌｇ １Ｃ ｌ ｅ ｅ ｏ ｉ ｅＳ ｉ ｅ ｄ Ｔｅｈ ｏｏ ｙ，Ｓ ｕｈ ｓ Ｕ ｉｅｓｔ　 ｏ　 ｔ ｎ ｌ ｉｓ Ｃ ｅ ｇ ｕ Ｓ ｃｕ ｎ ６ ０ ４ ， ｈｎ 　 ｎ ａ ｏ ｔｗｅｔ ｎｖｒｉ ｆ ｒＮａｉ ａｉ ｅ ， ｈ ｎ ｄ ， ｉｈ ａ ， １０ １Ｃ ｉａ； 　 ｙ ｏ ｔ ２ Ｄｅ ａｔ ｎ　ｆＭ ｉ ｏｉｌｇ 　ｎ 　ｍｍｕ ｏｏ ｙ， ａｈＳｃｕ ｎＭｅ ｉ ｌＣ ｌｅ ｅ Ｎａ ｃ ｏ ｇ，ｉｈ ａ ，３ ０ ０ Ｃ ｉａ　 ． ｐ ｒｍｅｔ 　 ｃ ｂｏｏ ｙａ ｄ Ｉ ｏ ｒ ｎｌｇ Ｎｏ 　ｉｈ ａ 　 ｄｃ 　 ｏｌｇ ， ｎｈ ｎ Ｓ ｃ ｕｎ ６ ７０ ， ｈｎ ） ａＡｂ ｔ ａ ｔ Ａｃ ｏ ｄ ｎ 　 ｏ ｔ ｅ ｄ ｃ 　 Ｆ 　 ｇ ｎ 　 ｅ ｕ ｎ ｅ 　 ｖ ｉ ｂ ｅ ｉ 　 ｎ ａ ｋ，ａ ｐ ｉ ｏ 　 ｒｍｅ ｓ ｗｅ ｅ ｄ ― ｓ ｒ ｃ ： ｃ ｒ ｉ ｇ ｔ 　 ｈ 　 ｕ ｋ Ｉ Ｎ一 ｅ ｅ ｓ ｑ ｅ ｃ ｓ ａ ａ ｌ ｌ　ｎ Ｇｅ Ｂ ｎ ａ 　 ａｒ ｆ ｐ ｉ ｒ　 ｒ 　 ｅ 　 　 ｓｇ ｅ 　ｏ 　 ｓ ａ ｌ ｈ ｎ 　 　 ＹＢ Ｇｒ ｅ 　　 ｕ ｎ ｉａ ｉ ｅ ｒ ａ ―ｉ 　 ｉｎ ｄ ｆｒｅ ｔ ｂｉ ｉ ｇ ａＳ ｓ Ｒ　 ｅ ｎ Ｉｑ ａ ｔｔ ｔｖ 　 ｅ ｌ ｍｅ ＲＴ－ ＣＲ　 ｅ ｈ ｄ ｆ ｒ Ｉ Ｎ一 ｍＲＮＡ　 ｆｄ ｃ ｔ Ｐ ｍ ｔ ｏ 　ｏ 　Ｆ 　 ｏ　ｕ ｋ． 　Ｔｏ ｅ ｔ ｂ ｉ ｈ ｔ ｅ ｓ ａ ｄ ｒ 　 ｕ ｖ ， ｈ 　 ｒ ｄ ｃ 　 ｆｃ ｎ ｅ ｔ ｎ ｌＰ 　 ｓ ａ ｌ 　 ｈ 　 ｔ ｎ ａ ｄ ｃ ｒ ｅ ｔ ｅ ｐ ｏ ｕ ｔ ｏ 　 ｏ ｖ ｎ ｉ ａ　 ＣＲ　 ｅ ｖ ｄ ａ 　 　 ｔ ｎ ａ ｄ ｆ ｌ ｗｉ ｇ ｗｉ 　 ｈ 　 ｓ ｏ ｓ ｒ ｅ 　 ｓａｓ ａ ｄ ｒ ，ｏ ｌ ｎ 　 ｔ ｔ ｅ ｏ ｈａ ａｙ ｉ ｏ　 ｌｉ ｇ ｃ ｒ ｅａ ｄ ｔ ｅ ｓａ ｉ ｔ 　ｅ ｔ ｎ ｌ ｓｓ ｆｍｅｔｎ 　 ｕ ｖ 　 ｎ 　 ｈ 　 ｔ ｂｌ ｙ ｔ ｓ．Ｔｈ 　 ｅ ｕｔ　 ｈ ｗｅ 　ｈ ｔｔ ｅ ｌ ｅ ｒｒ ｎ ｅｏ 　 　 ａｕ 　 ｓ 　 ｉ ｅ ｒｓ ｌｓｓ ｏ ｄ ｔ ａ　 ｈ 　ｉ ａ 　ａ ｇ 　 ｆＣｔｖ ｌ ｅｗａ　 ｎ ｆｏ １ ． － ３ ０ ｗｉｈ ａ ｇ ｏ 　 ｏ ｒ ｌｔｏ 　 ｏ ｆｉｉｎ （ ＝ ０ ９ ７ ｎ 　ｈ ｒ　 ｓａ ｓｎ ｌ　 ｅ ｋ ｗｉｈ ａ ８ ． ±　 ｒ ｍ　 ２ ０ ３ ． 　 ｔ 　　 ｏ ｄ ｃ ｒｅａ ｉｎ ｃ ｅｆｃｅ ｔ ｒ ． ９ ）ａ ｄ ｔ ｅ ｅ ｗａ　 　 ｉ ｇｅ ｐ ａ 　 ｔ 　　 ２ ５０ ℃ Ｔｍ　ｎ ｍ ｅｔｎ 　 ｕ ｖ ． Ｔｈ 　 ｏ ｆｅ ｉｎ ｓ ｏ　 ａ ｉｔ ｎ（ Ｖ　 ） ｓ ４ ２ 　 ｉ 　 ｌｉｇ ｃ ｒ ｅ ｅ ｃ ｅｆ ｃｅ ｔ　 ｆｖ ｒａｉ ｏ Ｃ ｗａ 　 ． ６．ｆ ｒ ｔ ｅ ｉｔａａ ｓ ｙ ｔ ｓ　 ｎ 　 ｏ 　ｈ 　ｎ ｒ― ｓ ａ 　 ｅ ｔａ ｄｔ ｅ ｅｗａ　 ｏ ｓｇ ｉ ｃ ｎ 　 ｉｆｒ ｎ ｅ（ ＞ Ｏ ０ ）ｎ ｔ ｅｉｔ ｒａ ｓ ｙｔ ｓ Ｔｈ 　 ｅ ｌ ｉ ｅＲＴ～ ＣＲ　 ｓ ａ 　ｏ 　 ｕ ｋ ｈ ｒ　 ｓｎ 　ｉｎ ｆ ａ ｔｄｆｅ ｅ ｃ Ｐ ｉ ． ５ ｉ　ｈ 　 ｅ－ ｓ ａ 　ｅ ｔ ｎ ｅｒ ａ― ｍ 　 ｔ Ｐ ａ ｓ ｙ ｆ ｒｄ ｃ 　Ｉ Ｎ一 ｍ ＲＮＡ　 ａ 　 ｒ ａ 　 ａ ｇ ，ｈ ｇ 　 ｆｉｉ ｎ ｙ ｐ ｃ ｆ ｉｙ ａ ｄ ｒ ｌ ｂ ｌ ｙ　 Ｆ 　 ｈ ｓｂ ｏ ｄ ｒ ｎ ｅ ｉ ｈ ｅ ｆｃｅ ｃ ，ｓ ｅ ｉ ｃｔ 　 ｎ 　 ｅ ｉ ｉ ｔ ． ｉ ａ ｉＫｅ 　 ｒ ｓ ｄ ｃ Ｉ Ｎ一 Ｒｅ ｌｔ 　 ｙｗｏ ｄ ： ｕ ｋ；Ｆ 　； ａ―ｉ ＲＴ― ＣＲ； ＹＢ Ｇｒ ｅ 　Ｉ ｍｅ Ｐ Ｓ Ｒ　 ｅ ｎ 　
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