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　京公网安备66上传用户：rpaudqhril资料价格：5财富值&&『』文档下载 ：『』&&『』学位专业：&关 键 词 ：&&&&&权力声明：若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请点击。摘要:（摘要内容经过系统自动伪原创处理以避免复制，下载原文正常，内容请直接查看目录。）缺氧缺血性脑毁伤(hypoxia—ischemicbrain damage， HIBD)在重生儿期是惹起重生儿逝世亡和神经体系毁伤最多见的缘由。据统计每1000例重生儿中约有1、2例因为围产期梗塞惹起HIBD，HIBD患儿中年夜约有15一20%在重生儿期逝世亡，约25%幸存患儿会遗留心经体系毁伤，如脑性瘫痪、智力妨碍、癫痫等。今朝对HIBD以对症支撑医治为主，亚高温和高压氧疗法曾经获得普遍的承认，亚高温疗法对中度HIBD后果明显，可显著预防和加重患儿后遗症的产生，进步生计质量。20年后人们广泛以为与其它器官的再生才能比拟，年夜脑组织在发育完整后，简直无再生成神经细胞的才能，然则最近几年来的研讨发明，在年夜脑的特别区域存在着神经干细胞(NSCs)，脑组织具有神经再生的才能。神经干细胞是在胚胎和成体神经组织中存在的具有自我更新和多向分化潜能的细胞，能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，介入神经发育和神经毁伤的修复。别的，近几年的研讨注解中枢神经存在很多克制因子，成年哺乳植物四周神经轴突毁伤后可以或许普遍再生，而中枢神经轴突的再生才能无限，其缘由除与毁伤点发展增进份子缺少、毁伤神经元内涵的发展才能差和胶质斑痕的物理樊篱感化外，微情况中克制因子的存在起侧重要感化，如Nogo一A，它是一个主要的中枢轴突发展克制因子，它对中枢神经毁伤的克制感化已被体表里试验证明。脑毁伤患儿晚期脑的可塑性比拟年夜，是以最年夜限制的激起内源性神经干细胞的发生，增进其增殖与分化成为近几年来研讨的热门。目标本试验制造缺氧缺血性脑毁伤年夜鼠植物模子，应用头皮位点药物打针对其医治，研讨头皮位点药物打针对缺氧缺血性脑毁伤(HIBD)重生年夜鼠内源性神经干细胞增殖分化及对神经再生克制因子Nogo一A mRNA表达的影响。办法缺氧缺血性脑毁伤年夜鼠模子制备：重生7日龄SD年夜鼠，随机分红四组：对比组，模子组，位点打针心理盐水医治组，位点打针VitB1、B12医治组。采取结扎左边颈总动脉并吸人2小时氮氧混杂气，制造重生年夜鼠HIBD模子。位点打针心理盐水医治组和位点打针VitB1、B12医治组在模子树立后第14天，分离在年夜鼠的左边额顶叶皮下打针等量的心理盐水和VitB1、VitB12的混杂浓缩液，1次/天，共20天，假手术组和模子组不予处置。各组予干涉后7天后处逝世植物：用40g/L多聚甲醛心脏灌注后断头取脑组织，分离做持续冠状切片。用HE染色做病理学剖析，用免疫荧光办法测定各组年夜鼠海马神经干细胞标记物巢卵白(Nestin)表达情形，免疫组织化学办法检测海马胶质纤维酸性卵白(GFAP)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达，用原位杂交办法测定海马神经再生克制因子Nogo一A mRNA的表达情形。统计学处置运用SPSS16。0统计软件停止剖析，数据以X士S表现，多组均数比拟用单身分方差剖析，组间两两比拟采取LSD法，以a=0。05为磨练水准，P《0。05差别有统计学意义。成果1。HE染色显示：位点打针可加重海马神经细胞的变性坏逝世，增进其修复，个中打针VitB1、B12医治组修复感化更加显著。2。位点打针可增长海马Nestin的表达，以打针VitB1、B12医治组表达最高，对比组组表达起码。3。海马NSE免疫组化显示：对比组和和位点打针VitB1、B12医治组表达较多，两者差异较小，而模子组海马表达起码(P《0。005)。海马GFAP免疫组织化学显示对比组表达起码，模子组最多，位点打针心理盐水和位点打针VitB1、B12可克制GFAP的表达，个中以位点打针VitB1、B12医治组的克制感化最为显著(P《0。005)。4。原位杂交显示：对比组的Nogo一A mRNA表达起码，而模子组表达与其相反，位点打针心理盐水医治组和位点打针VitB1、B12医治组的表达程度均低于模子组，个中位点打针VitB1、B12医治组更加显著(P《0。005)结论应用头皮位点药物打针医治年夜鼠外不雅形状脑瘫表示恶化，神经毁伤加重；应用位点药物打针医治组Nestin及NSE增多，然则GFAP及Nogo一A mRNA的表达削减。从而得出结论：头皮位点打针医治可增进内源性神经干细胞的增殖与分化，克制Nogo一A mRNA的表达，增进神经的再生与修复，位点打针时结合应用药物，能加强这类医治后果。Abstract:Hypoxic ischemic brain damage (ischemicbrain - damage hypoxia, HIBD) in the neonatal period is a cause of death and the most common cause of death of the nervous system. According to statistics per 1000 cases of children born in about 1 and 2 cases because of perinatal infarction cause HIBD, infants with HIBD middle-aged night about 15 to 20% died in the newborn period, approximately 25% of the surviving children with left heart meridian system damage, such as cerebral palsy, mental retardation, epilepsy and so on. Today on HIBD to symptomatic support cure is given priority to, sub high temperature and high pressure oxygen therapy once won the generally acknowledged that mild hyperthermia therapy on moderate HIBD consequences obviously, sequelae in children with significant prevention and aggravating, improve living quality. After 20 years it is commonly thought that compared with the other organ regeneration ability, big brain tissue after complete development, just to generate neural cells can, however in recent years, the study found, in a particular area of the brain of the eve of the there are neural stem cells (NSCs), brain tissue has the nerve regeneration can. Neural stem cells are cells have the self-renewal and multilineage differentiation potential in embryonic and adult neural tissue in the presence of can differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes, glial cells and intervention of neural development and neural damage repair. Other, in recent years, the discussion comment central nervous exist many restraint factors and adult mammals around axons damage can perhaps the most popular regeneration, and CNS axonal regeneration ability is limited, its reason in addition to and damage development enhance member missing, damage neurons of the connotation of development ability is poor and glial scar physical barriers affect the outside, micro restraint factors in existence play an important role, such as Nogo a, it is a main central axonal development restraint factor, it on the central nerve damage the restraining effect of has been surface test prove. Brain damage in children with advanced brain plasticity is relatively large, is to stimulate the occurrence of endogenous neural stem cells, enhance the proliferation and differentiation in recent years become a hot. Target hypoxic ischemic brain damage in animal models of manufacturing the test and application of scalp site medication injection on the treatment and research of scalp site medication injection on hypoxic ischemic brain damage (HIBD) rebirth of the eve of the mouse endogenous neural stem cell proliferation and differentiation and on the nerve regeneration effect of g factor Nogo a mRNA expression. Methods hypoxic ischemic brain damage model preparation: 7 day old SD rats were randomly divided into four groups: the contrast group, the model group, the site injection of the saline treatment group, the injection of VitB1, B12 treatment group. Ligation of the left common carotid artery and 2 hours of inhalation of nitrogen and oxygen mixed gas, to create a regeneration of the rat HIBD model. Site injections physiological saline cure group and site injections of vitamin B1 and B12 treatment group at 14 days after building model, the separation in the big rat left frontoparietal subcutaneous injection of an equal amount of physiological saline and VitB1, VitB12 mixed concentrate, 1 times / day, a total of 20 days, sham operation group and the model group received disposal. After 7 days of intervention, the plants were treated with 40g/L, the brain tissue was taken after the heart perfusion, and the continuous coronal sections were separated. By HE staining pathological analysis and immunofluorescence method determination of each group of big rat hippocampus neural stem cell marker nest protein (nestin) expression and immunohistochemistry method was detected in the hippocampus glial fibrillary acidic protein (GFAP) and neuron specific enolase (NSE) expression and by in situ hybridization method determination of hippocampal neural regeneration restraint factor Nogo a mRNA expression. Using SPSS16. 0 statistical software analysis, data to X S performance, the number of groups were compared with the single analysis of variance, the group of two two compared to take the LSD method, with a=0. 05 for the training level, P &0&. 05 the difference was statistically significant. Result 1. HE staining showed that: site injections can aggravate the degeneration of the hippocampus nerve cells died, enhance its repair, the injection of VitB1, B12 healing group repair effect is more significant. 2. Site injection can increase the expression of Nestin in the hippocampus, in order to inject VitB1, B12 treatment group expressed the highest, compared to the group expression at least. 3. NSE immunohistochemistry showed that: compared with the injection of VitB1, B12 treatment group, the expression of more, the difference between the two groups is small, and the model group hippocampus expression at least (P 0. 005). Hippocampal GFAP immunohistochemistry showed that the contrast group, the expression of at least, in model group, the most site injections physiological saline and site injections of vitamin B1, B12 can restrain GFAP expression, medium site injections of vitamin B1 and B12 in treatment group the restraining effect of the most significant (P & 0. 005). 4. In situ hybridization showed that in contrast to the group of Nogo a mRNA expression at least, and in model group, the expression of its opposite, site injections physiological saline cure group and site injections of vitamin B1 and B12 treatment the degree of expression of group were lower than those in the model group, medium site injections of vitamin B1 and B12 treatment group is more significant (P & 0. 005) conclusion application of scalp site medication injection to treat a big rat outside not elegant shape of cerebral palsy said the worsening, aggravate application site medication injection treatment group, the number of nestin and NSE increased, however, GFAP and nogo a mRNA expression of cuts. So as to draw a conclusion: scalp site injection treatment can be improved目录:摘要4-7Abstract7-10中英文缩略词对照表12-131 引言13-152 材料和方法15-223 结果22-284 讨论28-385 结论38-39参考文献39-43综述 神经干细胞及其增殖分化的因素43-55&&&&参考文献52-55致谢55-56个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果56分享到：相关文献|文档分类：
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中国医科大学博士学位论文新生大鼠HIBD晚期神经细胞凋亡及bFGF对其影响姓名:王菊莉申请学位级别:博士专业:儿科学指导教师:韩玉昆新生大鼠HIBD晚期神经细胞凋亡及bFGF对其影响中文摘要目的新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)可致新生儿死亡或永久性的神经系统损伤,现已证明,新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)后存在神经细胞凋亡,主要位于实验侧皮层、海马、丘脑及纹状体。Caspase家族,是近年来新发现的一类天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶,哺乳类启今已发现至少14种Caspases参与细胞凋亡。Capase一3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶,一旦被激活,凋亡常难以避免,因此Caspase一3是有可能被阻抑的最下游凋亡执行蛋白,该酶是否被激活也是鉴别细胞凋亡与坏死的主要依据。Caspase一3与ted一3高度同源,是细胞在执行PCD过程中的关键步骤。已证明,大脑缺血后表达、裂解并活化了Caspase一3。大量研究已证明,新生大鼠HIBD后Caspase一3活化参与了神经细胞凋亡。m后连续表达活化的Caspase一3和凋亡性形态的细胞持续存在达数天提示在新生儿缺氧缺血性脑损伤中凋亡持续存在。Bel—xL是Bcl一2家族成员之一,具有抗凋亡作用,Bel—xL表达增加可阻止Caspase一3活化,从而阻止凋亡的级联反应。本文研究新生大鼠缺氧缺血性脑损伤神经细胞凋亡持续时程,新生大鼠HIBD晚期Caspase一3、Bcl一】【L基因及其蛋白表达情况,以及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对HIBD晚期神经细胞凋亡的影响。方法选用本院动物室提供的健康新生7日龄Wistar大鼠为研究对象,用Rice法制成HIBD模型。缺氧浓度为84-l%,舱温36±1。C,缺氧持续1.5·l·小时。本实验采用此模型进行以下实验。在缺氧缺血(HI)后不同时间处死取脑进行研究,并设同批正常组及假手术组作对照,研究内容如下:1.应用苏木素一伊红(HE)染色、透射电镜、流式细胞检测术(FCM)及末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的生物紊化一dUTP原位缺口末端标记(TUNEL)研究新生大鼠HIBD晚期神经细胞凋亡持续时程。2.应用逆转录聚合酶链式反应(RT—PCR)及免疫组织化学方法研究与凋亡有关的基因Caspase一3、Bcl一)【L的mRNA及其蛋白在新生大鼠HI后晚期在脑中表达的情况。liT—PCR:反转录合成cDNA第一链(RT)。然后进行PCR扩增,用GIS一700D凝胶扫描成像分析系统扫描各扩增产物,Casapse一3mRNA及Bel—yJ_anRNA表达水平以GAPDH的相对表达量即Caspase一3/GAPDH及Bcl—xL/GAPDH计算,数据进行t检验。免疫组织化学方法:标本为脑组织石蜡切片,预先经电炉加热抗原修复,进行SABC染色。结果判定:400倍光镜下观察每组每个时间点各5只大鼠脑组织切片(各二张),经数码相机采样,左右皮层及海马各5个视野,输入MetaMorphImagerSystemVersiorA.6,将大脑皮层的免疫阳性细胞的染色强度变成量化指标,计算其平均光密度(OD)值,两组间比较采用t检验。3.观察碱性成纤维细胞生长因子对新生大鼠HIBD持续保护机制以及在新生大鼠HIBD晚期不同bFGF治疗方案对Caspase一3和Bcl—xL蛋白表达、DNA断裂的影响。首先制备新生大鼠HIBD模型,随机分成6组:bFGFl组(HI后腹腔注射bFGF4u·g~,连用3周)、bFGF2组(HI后腹腔注射bFGF4u·g~,第一及第三周用)、bFGF3组(HI后腹腔注射bFGF4u·g~,仅第一周用)及相应治疗方案的生理盐水对照组即对照1组、对照2组、对照3组,各组大鼠均于王II后3周处死,每组各5只。比较TUNEL染色阳性细胞数及免疫组化方法观察Caspase一3、Bcl—xL蛋白表达情况。结果1.HE染色:HIBD动物模型组,在m后2周、3周、4周时左侧大脑后扣带皮层区神经细胞明显少于右侧,额顶皮层运动区及额顶皮层躯体感觉区均可见神经细胞明显减少,皮层以Ⅲ一Ⅳ层细胞减少较I一Ⅱ层明显,代之以较多的星形胶质细胞;在HI后3周时即可见脑组织形成界限清楚的坏·2·死灶,坏死灶中可见较多的少突胶质细胞及小胶质细胞,半暗带内可见细胞呈三种变性形态:①细胞皱缩、核浓缩;②胞浆内核碎片;③单个圆形凋亡小体。有者在左侧丘脑处亦可见坏死灶。右侧扣带区皮质常为散在神经元丢失、神经元排列紊乱等改变,正常组及假手术组均未见到明显的病变。2.TUNEL染色结果:发现HI后2周、3周和4周时在额顶皮层躯体感觉区、纹状体、丘脑及海马处有一些散在的染色质浓缩呈黄色颗粒的圆形或卵圆形的凋亡细胞,以额顶皮层躯体感觉区相对多见,在半暗带内亦可见凋亡细胞,皮层以Ⅲ~Ⅳ层凋亡细胞较I~Ⅱ层多。正常对照组全脑于各时间点,10个高倍视野凋亡细胞数为0—6个(4.204-1.30),可见大鼠于出生后,在生理情况下大脑神经细胞发生极少量的凋亡,假手术组及右侧脑亦有同样的规律。m后3周时左脑凋亡细胞数为8.{30±1.00,与正常组(4.20±1.30)比较,差异有显著性(t=5.17,P&O.01);在m后4周时左脑凋亡细胞数(4.00±1.00)与对照组比较差异无显著性(t=0.27,P&0.05)。3.局灶性脑缺血后脑组织DNA断裂百分率的变化:HI后3周时脑组织DNA断裂百分率为8.19±2.49,与正常组(3.04±0.12)比较,DNA断裂百分率之间差异有显著性(t=4.62,P&0.05),而Hl后4周时则差异无显著性(t=O.27,P&0.05)。4.透射电镜发现:HI后3周时,仍可见到凋亡细胞,表现为染色质边集、聚集成块、有者形成凋亡小体。从形态学上进一步支持了新生大鼠HIBD晚期仍存在细胞凋亡。5.RT—PCR检测发现:正常时脑皮层即有少量Caspase一3mRNA表达,于HI晚期3周时Caspase-3mRNA表达(O.771±0.074)仍有增高,与正常组(0.541±0.093)比较,差异有显著性(t=4.74,P&0.01),HI后4w时Caspase-3mRNA表达(0.582-s0.021)与正常组比较差异无显著性(t=1.04,P&0.05)。HIBD组于HI后3周及4周时Bel—xI.znRNA表达与正常组比较差异均无显著性(t值分别为0.43和0.51,P&0.05)。6.免疫组织化学检测发现:正常组及假手术组皮层及海马个别区域有少量的Caspase-3免疫阳性细胞。HIBD组于m后2周时,左侧皮层出现较多的黄色免疫阳性细胞,3周时阳性细胞明显减少,但其平均光密度值(0.382±0.035)与正常组(O.362-sO.025)比较,差异仍有显著性(t=2.21,P&0.05);4周时可见散在的阳性细胞,与正常组比较差异无显著性(t=·3·1.57,P&0.05);右侧情况同正常组及假手术组。阴性对照无一抗者未显示Caspase一3免疫阳性细胞。正常组及假手术组皮层1
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重庆医科大学博士研究生学位论文
代内均能保持干细胞的形态特征，细胞增殖能力较强，传代后 3-4 天可
长满。（2）hUC-MSCs 染色体显带分析：体外培养至第 2 代、第 10 代
以及第 15 代的 hUC-MSCs，染色体显带结果无异常，细胞传代至第 15
代仍能保持正常的染色体带型，不会发生染色体畸变。（3）hUC-MSCs
流式技术鉴定：培养第 3 代的 hUC-MSCs，99%以上的细胞阳性表达
CD29、CD44、CD90、CD105、HLA-ABC，阴性表达造血干细胞标志
CD34、CD45 和免疫原性标志 HLA-DR。（4）hUC-MSCs 神经分化、
再分化诱导后形态变化：hUC-MSCs 经神经分化诱导 24h 后，细胞形
态较未经诱导的 hUC-MSCs 无明显变化，细胞仍呈现 hMSCs 的形态特
征，细胞扁平呈梭形，旋涡状生长。但 hUC-MSCs 经神经再分化诱导
24h 后，细胞形态发生明显变化，呈现神经元样细胞形态，胞体收缩变
圆而亮，细胞有单极或多极突起，部分突起连成网状，神经诱导率可
达 80-90%。（5）hUC-MSCs 神经分化、再分化诱导后神经标志物表达
情况：Real-time PCR 结果显示，Dif 组和 Re-Dif 组 NSE、MAP2、
β-tubulinIII 的表达均高于 hUC-MSCs 组，且 Re-Dif 组的表达高于 Dif
组，差异具有统计学意义（**P＜0.01, ***P＜0.001, one-way ANOVA）；
Western Blotting 检测结果与 Real-time PCR 结果一致。
结论（1）hUC-MSCs 具有 hMSCs 的形态特征和表面标志，细胞
增殖能力较旺盛。（2）hUC-MSCs 具有很好的生物学稳定性，体外多
次传代不会对细胞染色体带型造成影响。（3）hUC-MSCs 具有神经分
化和再分化潜能，再分化 hUC-MSCs 较分化的 hUC-MSCs 表达更高的
神经标志物。
重庆医科大学博士研究生学位论文
关键词 人脐带间充质干细胞，神经分化，再分化，神经标志物
第二部分 hUC-MSCs及分化、再分化hUC-MSCs移植对HIBD模
型大鼠的神经修复作用
目的 利用新生 SD 大鼠建立 HIBD 模型，在体研究 hUC-MSCs，
分化及再分化 hUC-MSCs 移植对 HIBD 大鼠的神经保护作用。
方法 将 134 只 7 日龄健康 SD 大鼠随机分为假手术组（Sham 组，
n=27）和 HIBD 造模组（HIBD 组，n=107）；HIBD 组大鼠行经典 Rice
法双结扎并离断左侧颈总动脉，并给予缺氧处理 2.5h。Sham 组大鼠仅
分离并暴露左侧颈总动脉，但不结扎和离断也不给予缺氧处理；在建
模后 5d，将 HIBD 组实验大鼠随机分为 PBS 组（n=34）和细胞移植组
（n=73），细胞移植组分为：未分化 hUC-MSCs 移植组（hUC-MSCs
组，n=34），分化 hUC-MSCs 移植组（Dif 组，n=21）和再分化 hUC-MSCs
移植组（Re-Dif 组，n=18）；各组大鼠麻醉后固定，在脑立体定位仪指
引下行颅内注射，每只实验大鼠给予细胞悬液量为 5μL，细胞数量为
5个，PBS 组只给予 5μL 灭菌 PBS 颅内注射；细胞移植后 2d，左
侧脑组织石蜡切片行 HE 染色；颅内注射后 1 月，Morris 水迷宫检测
实验大鼠的学习记忆功能，Object-in-place 行为学实验检测各组大鼠对
新事物的探索能力，膜片钳记录实验大鼠海马脑片 CA1 区长时程增强
电位情况。
结果（1）hUC-MSCs 移植对 HIBD 模型大鼠脑组织病理形态的影
响：通过 HE 染色，HIBD 组大鼠侧脑室周围脑组织疏松，呈现弥散状
态，细胞核固缩呈空泡状。而经 hUC-MSCs 移植后，侧脑室周围脑组
重庆医科大学博士研究生学位论文
织较紧密，细胞核固缩、空泡情况较 HIBD 组改善，但仍达不到 Sham
组正常大鼠的脑组织形态特征。（2）hUC-MSCs 移植对 HIBD 大鼠学
习记忆功能的影响：Morris 水迷宫实验发现，在第 1d 可见平台测试中，
Sham（n=9），HIBD（n=18）和 hUC-MSCs（n=17）三组大鼠找到平
台所用时间和距离没有统计学差异，提示 HIBD 建模和细胞移植不会
对大鼠的运动和视觉能力造成影响。第 2-5d 定位航行训练中，Sham,
HIBD 和 hUC-MSCs 三组大鼠找到平台所用时间均随着训练天数的增
加而降低。HIBD 组找到平台所用时间较 S
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