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急性髓系白血病细胞复杂表型、染色体核型及其APCcdh1、NEK2mRNA水平与临床预后的相互关系
【摘要】：背景与目的：
急性髓系白血病(AML)是成人急性白血病中最常见的类型。化疗一直是AML经典的治疗手段,目前60%-80%的AML患者经标准化疗后可以获得完全缓解(complete remission, CR),但大部分CR后的患者终将复发,甚至一部分患者难以达到CR而成为难治性白血病,治疗无效而死亡。多数由于对抗白血病的药物产生多药耐药而使治疗失败。引起耐药的原因主要与白血病细胞的生物学特征及遗传学背景差异有着密切关系。
AML中有少数患者的白血病细胞具有1种以上的造血分化抗原特征即混合细胞表型急性白血病(MPAL),它是髓系和淋系共同累及的具有独特生物学特征的一组急性白血病,是诊断比较困难的疾病,它不像急性淋巴细胞白血病(ALL)和急性髓系白血病(AML)那样可以明确归类,需要联合借助于细胞形态学、免疫学分类以及细胞遗传学才能诊断,而且目前这一疾病诊断标准复杂而多样,尽管近年来大多学者仍采用欧洲组白血病免疫学分类(EGIL)评分标准,但是,其局限性日益凸显,主要问题是即使按照EGIL标准严格应用评分系统,仍有很多病例是无法准确分类。2008年WHO借助于更少的标志和更为简单的诊断方法代替了EGIL评分系统。并将这一类疾病统一命名为混合表型急性白血病(Mixed-phenotype Acute leukemia, MPAL)。该诊断标准结合流式细胞术、免疫组织化学、细胞化学、免疫电泳等多种手段界定白血病细胞的分化特征,并且特别提出必须除外那些伴有重现性染色体异常的或者具有CML/MDS病史或者治疗相关的急性白血病病例。看来诊断指标简单、明确,但是对于未开展这些检查手段的单位受限制较大,而且目前还不是很清楚WHO标准与EGIL标准诊断的MPAL患者的临床特征、疗效及预后差异。伴淋系抗原(Ly)表达的急性髓系白血病(Ly+AML)也是一组特殊亚型的AML,其临床、MIC分型及预后特点,目前已逐渐引起重视,迄今为止,有关Ly+AML的预后各家报道不一,尚未见关于MPAL与Ly+AML的临床、预后等比较的研究报道。
研究表明,基因组不稳定性是肿瘤发生发展的重要原因,也是近年来研究的热点。泛素-蛋白酶体(Ubiquitin-proteasome Path-way,简称UP)通路是生物体内进行蛋白质选择性降解的重要途径之一。APC/C是人类发现的一大主要E3泛素连接酶,有两个作用底物链接蛋白APCcdc20和APCcdh1。APC-cdh1在有丝分裂晚期至G1期之间处于活化状态,作为细胞周期调控蛋白参与调控G1期至S期期间精细的DNA修复功能。APCcdh1在非小细胞癌、胃间质性肿瘤、乳腺癌及直肠癌等实体肿瘤细胞中均有所表达外,在血液肿瘤,包括某些急性、慢性髓系白血病细胞中也高表达,国外也有研究报道在滋养层细胞及纤维母细胞中APCcdh1与维持基因稳定性密切相关。我们的前期研究也发现,Cdhl在慢性粒细胞白血病(CML)急变期患者中不同丰度表达,且低表达丰度与附加染色体异常、ABL基因突变有关,提示Cdhl表达可能与维持CML基因组稳定性有关。另外,研究还发现,NIMA家族成员NEK2作为APCCdh1的分子底物,不但在乳腺癌、多发性骨髓瘤、白血病等多种肿瘤中异常表达,并且与肿瘤不良预后、基因组不稳定性、化疗耐药等密切相关。
鉴于急性髓系白血病(AML)的免疫表型及染色体核型的高度异质性,为深入研究其临床和预后的特点,我们收集了近10年来在我院诊断为AL的患者资料,分别按EGIL1998和WH02008标准诊断混合表型AL,按WH02008标准诊断Ly+AM、Ly-AML,对比分析两种不同标准诊断MPAL的符合率及其各自的临床特征、治疗反应及预后差异。并且通过实时荧光荧光定量PCR (Rreal-time quatitative PCR, RQ-PCR)技术检测APCcdh1、NEK2在AML中的表达,研究APCcdhl对AML免疫表型及染色体核型的影响；旨在探索APCcdh1、NEK2对AML治疗、预后的影响及其在不同的遗传学背景中的差异及意义。
1、AML患者骨髓细胞复杂表型、染色体核型与治疗反应
1).病历资料：南方医院2.8按照WH02008标准诊断混合表型急性白血病(MPAL)42例、伴淋系抗原表达的AML(Ly+AML)59例、单纯AML (Ly-AML)84例病例；按照EGIL1998标准诊断的混合细胞表型急性白血病(MPAL)45例。均随访至2013年2月。分析EGIL1998、WHO2008两种不同标准诊断MPAL的符合率及以上各组患者的临床特征、治疗反应及预后差异。
2、AM[L患者骨髓细胞APCcdh1、NEK2mRNA表达水平与复杂核型、表型的关系及其临床意义
1).研究对象：选择的所有白血病骨髓标本均取自第一阶段分析的部分急性髓系白血病患者共61例(包括Ly+AML、Ly-AML),其中正常核型43例,复杂核型18例；对照组为年龄、性别匹配的非恶性血液病患者共21例。
2).引物设计与合成：根据GeneBank的序列设计APC-cdh1、NEK2基因及管家基因β-actin引物。
3).提取白血病及健康供者骨髓单个核细胞,提取总RNA,逆转录成cDNA,进行实时荧光定量PCR。通过熔解曲线确定PCR产物的特异性。取两管平均Ct值计算2-ACT值,作为各标本mRNA的相对表达量,ACT=(目的基因CT值-内参基因CT值)。比较不同免疫表型的AML (Ly+AML、Ly-AML)患者中APCcdh1、NEK2表达差异,伴正常核型的急性髓系白血病(CN-AML)与伴复杂核型的急性髓系白血病(AML+CK)、CN-AML与非恶性血液病对照组、AML+CK与非恶性血液病对照组之间的APC-cdh1、NEK2mRNA表达水平有无统计学差异。以AML中各基因的表达水平中位数为界,将研究对象分为高表达组与低表达组,分别比较AML患者骨髓单个核细胞APC-cdh1、NEK2mRNA高表达组和低表达组2疗程累计CR率、难治性白血病发生率、3年总生存期的差异,以及两基因表达水平的相关性。
3、统计学分析
应用SPSS17.0统计软件分析数据,计量资料呈非正态分布,用中位数描述；两组计量资料间分布比较用Mann-Whitney U两变量间相关分析采用Spearman rank 率的比较采用chi-生存分析用Kaplan-Meier曲线；生存率比较用log-rank检验；单因素分析及多因素分析用Cox R检验水准α=0.05,双侧检验。
1.2002年1月至2012年8月共收治按EGIL1998标准诊断为MPAL的患者45例,与WH02008标准诊断MPAL符合率率为77.8%(45例中35),在M/B、M/T\B/T混合表型急性白血病的诊断符合率分别为81.6%(38例中31例),66.7%(6例中4例),100%(1例中1例)。同时符合EGIL1998标准和符合WH02008标准、只符合EGIL1998标准和只符合WH02008标准的MPAL患者2疗程累计CR率分别为72.0%,62.5%,57.14%,各组间比较均无统计学差异(P0.05),同时将各组间患者总生存期进行预后比较发现也无统计学差异。
2.符合WHO2008标准诊断的MPAL共42例,分别与同期年龄、性别相匹配的59例Ly+AML及84例Ly-AML比较临床表现,发现MPAL组患者的骨髓幼稚细胞比例及肝脾淋巴结浸润发生率明显高于后两组；而CD34阳性发生率在MPAL及Ly+AML组中明显高于Ly-AML组；细胞遗传学结果显示MPAL组中的Ph+染色体/BCR-ABL融合基因阳性发生率及复杂核型发生率(除外伴Ph+病例)显著高于Ly+AML及Ly-AML病例组(P0.05)。三组2疗程累计完全缓解率分别为67.5%,68.5%,64.5%,各组间无统计学差异(P0.05),而MPAL的OS及RFS显著短于Ly+AML及Ly-AML病例组；Ly+AML与Ly-AML两病例组间临床及预后比较无差异。分别比较MPAL、Ly+AML及Ly-AML三组病例内染色体核型正常与复杂患者的总生存期,均发现复杂核型预后更差。而当细胞遗传学均正常的背景下,MPAL的OS及RFS显著短于Ly+AML、Ly-AML两病例组；当细胞遗传学均复杂核型的背景下,三组OS及RFS均无统计差异。
3. RNA、cDNA纯度和质量分析显示所提取总RNA、cDNA经紫外分光光度计检测,比值在1.8-2.0之间。同一标本cDNA经10倍比稀释后,设6个梯度,测各梯度浓度,范围是8.1～258.8ng/μl,分别对管家基因和目的基因进行扩增,6个梯度的ACT相差很小,说明在浓度范围内管家基因与目的基因的扩增效率一致,其CT值可以反应扩增基因的丰度。扩增后进入熔解程序生成熔解曲线,熔解曲线显示锐利的单一峰,无其它特异峰,说明扩增产物均一,无非特异扩增及引物二聚体,符合实验要求。
4.基因表达：APCcdhl、NEK2mRNA表达水平在不同免疫表型的AML(Ly+AML、Ly-AML)患者中表达均无显著差异。AML复杂核型组APCcdh1mRNA表达水平显著低于正常核型组及对照组,(Z=-2.918,P=0.004；Z=-3.493,P=0.000)。而NEK2mRNA表达水平在复杂核型组中明显高于正常核型组及非恶性血液病对照组(Z=-3.89,P=0.000；Z=-3.409,P=0.001)。
5.基因表达水平与临床的关系：分别将APCcdh1、NEK2基因的表达水平与患者初诊时年龄、白细胞计数、外周血白血病细胞比例及骨髓白血病细胞比例等指标做相关性分析,结果显示APCcdh1、NEK2mRNA表达水平在男女患者之间无统计学差异(Z=-0.155,P=0.877；Z=-1.211,P=0.226)。APCcdh1mRNA表达水平与患者初治时年龄、外周血白细胞计数、外周血原幼稚细胞比例、骨髓原幼稚细胞比例均无显著性相关,相关系数绝对值均小于0.3,P0.05,而NEK2mRNA表达水平与骨髓幼稚细胞比例呈正相关。APCcdh1与NEK2两基因表达水平均与染色体核型分类有着密切相关,即当染色体核型为正常核型时APCcdh1mRNA表达水平高,NEK2mRNA表达水平低；当为复杂核型时,APCcdh1mRNA表达水平低,NEK2mRNA表达水平则高。APCcdh1与NEK2两基因之间的]mRNA表达水平无显著相关(r=-0.213,P=0.099)可能跟病例数少有关。
6.基因表达水平与疗效的关系：依据AML中APCcdh1、NEK2mRNA表达水平中位数为界将患者分成两组,高于AML组APCcdh1、NEK2mRNA表达水平中位数定义为高表达组,否则定义为低表达组。61例AML患者除去5例治疗不足1疗程即自动出院未列入统计外,其余56例均列入治疗反应分析。APCcdhl mRNA高表达组28例,经2疗程化疗CR24例(85.7%),低表达28例中CR14例(50.0%),x2检验显示,高表达组2疗程累计CR率显著高于低表达组(P0.05)；且高表达组中难治病例发生率显著低于低表达组(35.7%vs70.4%,P0.05)。NEK2mRNA高表达组29例,经2疗程化疗CR15例(51.7%),低表达27例中CR21例(77.8%),两组CR率有显著性差异(P0.05)：且高表达组中难治病例发生率显著高于低表达组(65.5%vs37%,P0.05)。
7.基因表达在预后中的意义：将患者初诊时年龄、外周血WBC计数、外周血原幼稚细胞比例、免疫分型、核型、骨髓原幼稚细胞比例及/APCcdh1、NEK2mRNA表达水平等对生存时间的影响进行单因素分析,发现初治时外周血WBC计数、染色体核型、NEK2mRNA表达水平对AML患者的生存时间均有显著性意义(P0.05)。但是进行多因素分析发现只有外周血WBC计数、NEK2mRNA表达水平对生存时间有显著意义,p0.05。
1.与EGIL1998标准相比,WH02008标准诊断的MPAL病例可能更具有混合细胞表型的特征。
2.MPAL病例的OS明显低于Ly+AML及Ly-AML组,可能与初发骨髓白血病细胞比例、复杂核型发生率高的因素有关；Ly+AML与Ly-AML两组间临床特征及OS无差异。
3.复杂核型是不同免疫表型AML患者共同不良预后因素。
4. NEK2mRNA表达水平与骨髓原幼稚细胞比例呈正相关,低表达APCcdhl或者高表达NEK2可能提示复杂染色体核型的发生率高,与预后不良有关。
5. Ly+AML、Ly-AML与APCcdhl、NEK2mRNA表达水平无显著差异。
【关键词】：
【学位授予单位】：南方医科大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2013【分类号】：R733.71【目录】：
摘要3-9ABSTRACT9-18第1章 AML细胞复杂表型、染色体核型与治疗反应18-34 前言18-20 研究对象与方法20-22 结果22-30 讨论30-33 小结33-34第2章 AML细胞APCcdh1、NEK2表达水平与复杂核型、表型及其预后影响分析34-53 前言34-36 研究对象与方法36-41 结果41-48 讨论48-52 小结52-53全文结论53-54参考文献54-61附录61-62攻读硕士学位期间撰写的论文62-63致谢63-64
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京公网安备75号一、白血病；DA方案-----成人急性髓性白血病（AML）；柔红霉素；阿糖胞苷；此方案的主要毒副作用是骨髓抑制和胃肠道反应；DAT方案---AML；柔红霉素；阿糖胞苷；巯鸟嘌呤或足页乙甙；此方案的主要毒副作用是骨髓抑制，胃肠道反应和肝损；HA方案----AML；三尖杉酯碱；阿糖胞苷；巯鸟嘌呤；此方案主要的毒副作用是骨髓抑制；HOAP方案----AML；三尖杉
一、白血病
DA方案-----成人急性髓性白血病（AML）
此方案的主要毒副作用是骨髓抑制和胃肠道反应。
DAT方案---AML
巯鸟嘌呤或足页乙甙
此方案的主要毒副作用是骨髓抑制，胃肠道反应和肝损害。
HA方案----AML
三尖杉酯碱
此方案主要的毒副作用是骨髓抑制。
HOAP方案----AML
三尖杉酯碱
此方案主要的毒副作用是胃肠道反应，骨髓抑制，神经毒性，脱发等。
ME方案-----复发性急性髓性白血病
此方案的主要毒副作用是骨髓抑制，胃肠道反应。
HD-AA方案----复发性成人急性髓性白血病
柔红霉素或
此方案最主要的副作用是骨髓抑制，胃肠道反应，心脏毒性，及皮肤色素沉着。 CECA方案-----成人急性髓性白血病的复发/抢救治疗
此方案最主要的副作用是骨髓抑制
VDLP方案---成人急性淋巴细胞性白血病ALL-----第15天开始减量
门冬胺酸酶
此方案最主要的副作用是骨髓抑制。
苯丁酸氮芥（瘤可宁）
此方案常见的副作用是消化道系统和血液系统反应。
FP方案-----慢性淋巴细胞性白血病（CLL）
此方案常见的副作用是骨髓抑制、免疫功能受损和机会感染率增加。
COP方案或CHOP方案----难治性慢性淋巴细胞性白血病（CLL）
此方案常见的的副作用是胃肠道反应和骨髓抑制。
二、肺癌化疗方案列举如下：
环磷酰胺400-1000mg/m2，静注，第1天；
阿霉素40-50mg/m2，静注，第1天；
顺铂40-80mg/m2(水化)，静滴，第1天。
每3-4周为一个周期，每2-3个周期为1疗程。本肺癌化疗方案有效率为6-39%。 此方案主要的毒副作用是造血功能抑制、恶心、呕吐、脱发。
VP-16每次100mg，静滴，第1-5天；
顺铂 60-80mg/m2(水化)，静滴，第1天。
每4周为一个周期，每2-3个周期为1疗程。本肺癌化疗方案有效率为17-39%。 此方案最主要的毒副作用是骨髓抑制和恶心呕吐。
卡铂每次300mg，静滴，第1天；
VP-16 每次100mg，静滴，第1-5天；
每3-4周为一个周期，每2个周期为1疗程。本肺癌化疗方案有效率为40%。
此方案的常见副作用是胃肠道反应和骨髓抑制。
丝裂霉素6-8mg/m2，静注，第1天；
长春地辛3mg/m2，静注，第1、8天；
顺铂 40-80mg/m2(水化)，静滴，第1天。
每3-4周为一个周期，每2-3个周期为1疗程。本肺癌化疗方案有效率为35-53%。 此方案常见的副作用是骨髓抑制，消化道反应及神经系统等。
鬼臼噻吩甙100mg，静滴，第1-3天；
顺铂 40mg，静滴，第1-3天。
每3周为一个周期，每3个周期为1疗程。本肺癌化疗方案有效率为31%。
此方案常见的副作用是骨髓抑制和消化道反应。
丝裂霉6mg/m2，静注，第1天；
异环磷酰胺1.5g/m2，静滴，第1-5天(同时用美斯钠a40mg，静注，在滴注异环磷酰胺时给1次，以后每4小时给1次，全天共给3次，连用5天）；
顺铂 20mg，静滴，第1-5天。
每3-4周为一个周期，每2-3个周期为1疗程。
此方案常见的副作用是骨髓抑制。
长春地辛3mg/m2，静注，第1、8天；
异环磷酰胺 1.5g/m2，静滴，第1-5天(同时用美斯钠40mg，静注，在滴注异环鳞酰胺时给1次，以后每4小时给1次，全天共给3次，连用5天）；
顺铂20mg，静滴，第1-5天。
每3-4周为一个周期，每2-3个周期为1疗程。本肺癌化疗方案有效率为63%。 此方案常见的副作用是骨髓抑制。
CAMP方案：
环磷酰胺600-800mg/m2，静注，第1、8天；
阿霉素 20-30mg/m2，静注，第1、8天；
甲氨碟磷 15-20mg/m2，静注，第1、8天；
甲基苄肼100mg/m2，口服，第1-10天。
每4周为一个周期，每2-3个周期为1疗程。本肺癌化疗方案有效率为17-44%。
CAEP方案：
环磷酰胺 400mg/m2，静注，第1-2天；
阿霉素20mg/m2，静注，第1-2天；
VP-16静滴，第1-3天；
顺铂20mg，静滴，第1-3天。
每4周为一个周期，每2-3个周期为1疗程。本肺癌化疗方案有效率为46%。
Taxol+DDP方案:
泰素 135-175mg/m2，静滴，第1天；
顺铂 60mg/m2，静滴，第3天。
每3周为一个周期，每2-3个周期为1疗程。
此方案主要的不良反应是骨髓抑制
DDP+NVB方案：
顺铂 80mg/m2(水化），静滴，第1天；
去甲长春花碱25mg，静滴，第1、8天。
每4周为一个周期，每2-3个周期为1疗程。本肺癌化疗方案有效率为33-50%。
三、食道癌化疗方案
此方案的副作用是血液和消化道的反应。
此方案的主要毒副作用是发热过敏反应，胃肠道反应，骨髓抑制、轻度周围神经毒性和静脉炎。
此方案主要的毒副作用是白细胞减少和外周神经炎。
四、恶性淋巴瘤常用的化疗方案有哪些？
⑴HD的化疗方案：目前常用方案MOPP、ABVD、CHOP等
①MOPP HN2
（M。氮介）
VCR（O：长春新碱）
PCR（P：甲基苄肼）
Pred（P：强的松）
一疗程结束后休息14天，共6疗程
为防止此方案诱发继发性白血病、不育症和继发性肿瘤的副作用，多采用CTX（C：环磷酰胺）代替氮介成为COPP方案。
此方案可能会导致急性非淋巴细胞白血病及不育
②CHOP方案
CTX （C：环磷酰胺）
ADM（H：阿霉素）
VCR （O：长春新碱）
Pred （P：强的松）
每21天给药一疗程，连用6疗程。
此方案常见的副反应有骨髓抑制、脱发、肝肾功能及心脏损害、低钾血症等。
③ABVD方案
ADM（H：阿霉素）
BLM （B：争光霉素）
VLB（V：长春新碱）
DTIC（D：氮烯咪胺）
此方案常见的副作用是心脏损害如心力衰竭及肺纤维化。
五、多发性骨髓瘤
MP方案---28天重复
苯丙氨酸氮芥
此方案最常见的是骨髓抑制。
VAD方案----28天重复
此方案最常见的是骨髓抑制。
胃癌化疗方案
DCF（顺铂、5Fu、多西紫杉醇）
此方案常见的副作用是骨髓抑制，消化道反应，周围神经毒性反应。
六、大肠癌化疗方案
（ 1 ） MF 方案
此方案常见的副作用是胃肠道反应，骨髓抑制，肝肾损害，脱发，皮炎，色素沉着等 （ 2 ） MeF 方案
（ 3 ） MCF 方案
长春新碱（ VCR ）
（ 4 ） FAM 方案
阿霉素（ ADM ）
此方案常见的副作用有恶心、呕吐。
七、乳腺癌化疗方案
环磷酰胺 （ Cyclophosphamide ）
甲胺喋磷（ Methotrexate ）
氟尿嘧啶(5-Fluorouracil)
每28天一个周期，共6个周期
Doxorubicin （阿霉素）
Cyclophosphamide （环磷酰胺）
Docetaxel(多西他赛) 每21天一个周期，共4个周期
此方案常见的副作用是过敏及神经毒性
环磷酰胺（Cyclophosphomide）
阿霉素（ Doxorubicin ）
每28天一个周期，共6个周期
此方案常见的副作用心脏毒性。
4. CEF 方案
环磷酰胺（Cyclophosphomide）
表阿霉素（Epirubicin）
5-Fluorouracil
每28天一个周期，共6个周期
此方案的主要毒副作用为脱发、轻度骨髓抑制、胃肠道反应,心脏毒性，极少肝功能损伤,
诺维本（NVB）
表阿霉素(EPI)
每28天为1个周期，共4-6个周期
此方案的主要副作用是骨髓抑制
八、卵巢癌化疗
目前，国内常用的一线化疗方案为
铂类药物+环磷酰胺（PC方案）；
三亿文库包含各类专业文献、中学教育、外语学习资料、专业论文、生活休闲娱乐、文学作品欣赏、行业资料、高等教育、13白血病化疗方案有哪些等内容。　
　各种化疗方案及支持疗法的完善、造血干细胞移植的应 用等,急性白血病的预后已大有改观,白血病患者的缓解率明显提高,缓解期、 生存期,特别是无症状存活期延长,相当... 　白血病化疗药物有哪些文章来源:39 健康网
22:24:54 文字【大】【...用于各种白血病,与其它抗白血病化疗药组成不同化 疗方案。 环己亚硝脲(ccnu)。... 　相关阅读一:白血病的治疗方法有哪些?? 白血病发病在各个年龄段,几岁的儿童和...(1)白血病治疗方法――化疗 随着白血病治疗研究的进展,疗效还在不断提高。为根治... 　如何更好的进行白血病化疗 白血病的化疗多采取联合化疗、 联合化疗注重细胞周期和...2、对具有不同预后因素的白血病个体其治疗方案应有所侧重和不同,如对 T-ALL ... 　关于白血病的介绍_临床医学_医药卫生_专业资料。2015 年 8 月 9 日晚,演员王洁曦因白血病治疗无效而去世了,年仅 26 岁,在 最后的微博 5 月 14 日中写着“... 　恶性血液病化疗方案_医药卫生_专业资料。恶性血液病化疗方案 DA 方案---成人急性髓性白血病(AML) 柔红霉素 25-45MG/M2 IV 第 1-3 天 阿糖胞苷 100MG/M2 C... 　白血病化疗病人的观察及护理_医药卫生_专业资料。白血病化疗病人的观察及护理 1 临床资料 我科
年收住血液科病人中需进行化疗的病例 52 例,其中男 30... 　白血病患者在化疗期间需要哪些护理白血病是一种极为折磨人的疾病, 此病不仅折磨患者还折磨着患者的家人, 包括精神和 经济上的。因此白血病患者一定要振作起来,积极的... 　对 于白血病目前没有特别好的治疗方法,主要就是中医联合化疗,还有骨髓移植,然而骨髓移 植花费高,危险大,更多的人把目光放在了中西医结合治疗上面,关于白血病的治疗... 上传我的文档
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败血症ARF时如何应用血管活性药物—对去甲肾上腺素与多巴胺的重新评价
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