小鼠脾脏的位置及状态分离方法？

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2023-09-07 01:35 标签： 小鼠脾脏的位置及状态
所需试剂供参考制备储存液氯化钙 (CaCl2) 和硫酸镁 (MgSO4) 储存液将对应的粉剂溶于双蒸水中，制备 1M CaCl2 和 MgSO4 储存液。通过0.22 μm滤膜对两种储存液进行无菌过滤。储存液在室温下储存。DNAse I将脱氧核糖核酸酶 I(DNAse I) 溶于 Hank's平衡盐溶液 (HBSS) 中，以达到4200U/ml 的终浓度。通过0.22 μm无菌滤膜对溶液进行无菌过滤。分装成小份，-20℃保存，避免反复冻融。胶原酶 IV/胶原酶 D将胶原酶 IV(Col IV) 溶于含 3 mM CaCl2 的 Hank's平衡盐溶液中，以达到1500U/ml 的终浓度。通过0.22 μm无菌滤膜对溶液进行无菌过滤。分装成小份，-20℃保存，避免反复冻融。胎牛血清（FCS）在37℃水浴中快速解冻FCS。一旦完全解冻，在42°C水浴中孵育 15分钟 以破坏补体活性。通过0.22 μm无菌膜 (Corning#431118) 直接过滤温热的 FCS 至无菌储存瓶 (Corning#430518) 中，并以50 mL分装，保存到-20℃下。避免反复冻融。RPMI-1640向 RPMI-1640 溶液 (RPMI) 中添加FCS，最终浓度2%FCS(v/v)。用于红细胞裂解的氯化铵-钾 (ACK) 裂解缓冲液将 NH4Cl 和 KHCO3 一起溶于双蒸水中，分别达到 155 mM 和 10 mM 的终浓度。必要时，用 HCl 调节 pH 值至7.23。对溶液进行高压灭菌。室温下储存。打开后，请勿使用 ACK 裂解缓冲液超过6周，因为空气中的 CO2 与碳酸盐结合导致缓冲液的 pH 值发生变化。FACS 缓冲液向磷酸盐缓冲液 (PBS) 中加入2%FCS(v/v)。用于制备消化缓冲液的 Hank's 平衡盐溶液往Hank's 平衡盐溶液中FCS、CaCl2、MgSO4，终浓度分别为2%FCS(v/v)、2 mM CaCl2和 2 mM MgSO4。该储存液在4℃下储存。用于从脾脏中分离细胞的完全消化缓冲液为消化脾脏，向每 1 mL 含2%FCS(v/v)、2 mM CaCl2和 2 mM MgSO4 的 HBSS 储存液中加入50 μL胶原酶 IV 和50 μL DNAse I。使用前在水浴中预热至37℃。仅在消化前直接加入酶。每个器官的消化共需要 2 mL 完全消化缓冲液。台盼蓝将 NaCl 溶于双蒸水中，制备0.9%(w/v)NaCl溶液。将0.36%(w/v) 台盼蓝粉末溶于0.9%NaCl溶液中。通过0.22 μm滤膜无菌过滤溶液，并在室温下储存。收集脾脏组织1.处死小鼠；2.将小鼠固定在准备台上后，通过进行从尿道口（尾侧）到下颌下部（头侧）的纵向切割，小心打开腹侧皮肤，暴露腹壁；3.小心打开腹壁；4.分离脾脏；5.彻底清除脂肪组织；6.将脾脏储存在六孔板中，并用冷 PBS 覆盖组织材料；如有必要，使用锋利的手术刀小心切割三分之一的脾脏，使用共聚焦显微镜进行分析；可通过流式细胞术和共聚焦显微镜对脾组织进行平行分析；在O.C.T.中包埋脾组分。溶液同时避免气泡，样品-80℃保存至样品制备；7.收获所有器官后，准备制备单细胞混悬液；8.如果对分离的细胞进行下游试验（需要在37℃下孵育），则使用无菌技术在无菌细胞培养工作台下进行以下所有步骤。制备脾脏单细胞悬液1.每只脾脏加入 2 mL 预热 (37℃) 的含胶原酶 IV 和 DNAse I 的消化缓冲液；2.用镊子使组织完全浸没，以增加消化缓冲液进入；3.在37°C、5%CO2培养箱中消化组织30分钟；4.用移液器吸取细胞悬液至100 μm过滤器上，过滤到50 mL 试管中，并用 2-3 mL 含2%FCS(v/v) 的冰冷 RPMI 冲洗；5.用杵小心研磨组织，同时避免过度用力；6.用 5 mL 含2%FCS(v/v) 的冰冷 RPMI 冲洗过滤器和研杵；7.在4°C下以700×g离心样品5分钟；8.如果离心后观察到脂肪层，则在倒出上清液前使用血清移液管吸出脂肪层；倒出上清液，将试管倒置在纸巾上2-5分钟，除去大部分液体；如果在无菌条件下生成单细胞混悬液，请勿使用纸巾，而是用无菌吸头小心吸去上清液；9.然后，使用 ACK 裂解缓冲液进行红细胞裂解。每管1 mL ACK 裂解缓冲液；10.短暂涡旋细胞悬液；11.室温下孵育样品5分钟；12.5分钟后，立即加入5 mL RPMI + 2%FCS终止裂解；13.通过涡旋混合；14.用40 μm滤器对细胞悬液进行过滤；15.用RPMI + 2%FCS冲洗试管并过滤；但保证悬液总体积低于15 mL；16.将细胞悬液直接转移至 15 mL 试管中；17.在4°C下以700×g离心样品5分钟；18.用无菌吸头小心吸去上清，将沉淀重悬于 1 mL FACS 缓冲液中；19.用FACS缓冲液加至8-10 mL；20.涡旋混合样品；21.在4°C下以700×g离心样品5分钟；22.弃去上清液；23.再次重复步骤26-30（总共洗3次）；最后，在 10 mL FACS 缓冲液中重悬团块，用台盼蓝进行细胞计数（C57BI/6小鼠一般一个脾脏可产出活细胞100×10E6–140×10E6）。24.调整细胞浓度为10 × 10E6/100 μL（相当于0.1 × 10E6/μl）；25.将100 μL细胞悬液分别转移至96孔 V 底平板中，根据流式细胞术步骤进行染色，上机获取；单细胞悬液也可用于Western blot、RNA 单细胞测序等。问题和对策活力低如果活力特别低，建议制备新鲜的 ACK 裂解缓冲液。并确保 5分钟后立即停止ACK 裂解。Collagenase IV 和 DNAse I 的消化时间不要超过 30分钟，确保除 ACK 裂解缓冲液外的所有缓冲液持续冷藏 (4℃)，使用预冷的离心机 (4℃)，各步骤尽量快。较长的孵育时间可降低细胞活力，导致 DC 活化以及表面标记物的丢失。但是，请勿缩短清洗步骤，因为这些步骤旨在除去消化缓冲液、ACK裂解缓冲液、粘连体、碎片和死细胞，从而大大提高生成的单细胞混悬液的质量。细胞得率低在开始消化程序之前，完全去除覆盖离体组织的脂肪，以避免细胞损失。使用前确保酶和消化缓冲液预热至37℃。确保消化缓冲液中添加 CaCl2 和MgSO4，因为Ca2 + 和Mg2 + 分别是胶原酶 IV 和 DNAse i 功能所必需的辅助因子。一般而言，彻底切碎器官材料可增加消化缓冲液进入组织片段，从而提高细胞产量。在清洗步骤中（与组织无关），倒出上清液前，必须通过小心去除脂肪层。ACK裂解不完全ACK 裂解后，ACK裂解不完全表现为洗涤步骤后出现明显的红色沉淀。需制备新鲜的 ACK 裂解缓冲液。确保在室温下进行 ACK 裂解。裂解开始前，要确保细胞已完全重悬。参考文献：Amon L, Dudziak D, Backer RA, et al. Guidelines for DC preparation and flow cytometry analysis of mouse lymphohematopoietic tissues [published online ahead of print, 2022 Dec 23]. Eur J Immunol. 2022;10.1002/eji.202249893. doi:10.1002/eji.202249893本文来自流式中文网(flowcyto.cn)欢迎转发到朋友圈，但谢绝复制粘贴转载如有需要请联系mail@flowcyto.cnPromotions below
罗工秘籍系列自2020年发布以来，就深受小伙伴们的欢迎。而自本周起，罗工又有新系列和大家见面了：罗工宝典，其中都是精心整理的完整实验操作方案，希望此系列可以对大家的科研有所裨益。调节性T（Treg）细胞是CD4+ T细胞的一个亚群，它表达Foxp3作为转录因子。Treg细胞通过调节免疫反应，在免疫耐受和维持体内平衡中发挥着重要作用。Treg细胞的主要作用是抑制效应T（Teff）细胞的增殖和细胞因子如IFN-γ、TNF-α和IL-2的产生。研究表明，Treg细胞抑制Teff细胞功能的能力会在持续的病原体感染和癌症发展过程中增强。在参与T细胞抑制的因素中，表达程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1）的终末耗竭性T（Texh）细胞和Treg细胞被广泛认为是抗原持久性和抑制环境的标志。Treg细胞表达PD-1的水平与其抑制T细胞增殖的抑制能力强弱相关。图1. Treg细胞在癌症中的作用步骤1步骤2步骤31.
RPMI培养基、FBS、双抗、L-谷氨酰胺、2-巯基乙醇2.
FACS 缓冲液3.
红细胞裂解液4.
70μm滤器5.
固定破膜试剂盒6.
相关鉴定指标抗体、死活染料1.
磁珠分选缓冲液2.
Miltenyi细胞分离试剂盒3.
Miltenyi分选柱4.
40μm滤器1.
细胞增殖试剂盒2.
anti-CD3/CD28功能抗体或磁珠3.
检测细胞因子ELISA试剂盒1. 脾脏样本单细胞悬液制备与Treg鉴定1） 脾脏淋巴细胞的分离a) 取小鼠脾脏置于2% RPMI培养基（2% FBS+1% 双抗）中。b) 使用注射器柱塞研磨，并通过70μm细胞过滤器，用2ml 2% RPMI培养基冲洗。c) 补充适量2% RPMI培养基，4°C，300g离心5min，丢弃上清，用1ml 红细胞裂解缓冲液重悬细胞，室温孵育5min。d) 加适量2%RPMI培养基中止裂解，4°C，300g离心10min，丢弃上清，在RPMI完全培养基（10%FBS+1%双抗+1%L-谷氨酰胺+50μM 2-巯基乙醇）中以1×107 cells/ml的密度重悬细胞，等待后续实验。2） Treg细胞的表型分析鉴定a) 转移50μl淋巴细胞（5×105 cells）到96孔板中，再加入150μl FACS缓冲液，4°C，300g离心2min。b) 丢弃上清，再使用200μl FACS缓冲液洗2遍，4°C，300g离心2min。c) 准备含抗体的染色缓冲液（50μl/孔，抗体用量参考说明书）：anti-CD4，anti-CD25，anti-PD-1，死活染料。注意：为了进一步分析活化Treg细胞的表型，可添加anti-CD103进行细胞表面标记物染色。d) 每孔用50μl抗体缓冲液重悬细胞，4°C避光孵育20min，用FACS缓冲液洗涤细胞2次，4°C，300g离心2min。e) 按厂家说明书制备固定缓冲液100μl，在4℃黑暗中固定细胞20min。用渗透性洗涤缓冲液(根据制造商的说明书准备)洗涤细胞2次，4°C，300g离心2min。f) 制备细胞内Foxp3染色的抗体溶液（抗体用量参考说明书），用50μl 含anti-Foxp3抗体溶液重悬细胞。g) 4°C避光孵育20min，用FACS缓冲液洗涤细胞2次，4°C，300g离心2min。用200μl FACS缓冲液重悬细胞，用流式细胞仪检测细胞表型。图2 小鼠脾脏Treg细胞表型分析2. CD4+CD25+Treg细胞的分离纯化（磁珠分选）（Miltenyibiotec Cat: 130-091-041）a) 按步骤1）获得1×107 cells/ml细胞悬液。加入10ml T细胞分离缓冲液清洗细胞。4°C，300g离心10min。弃去上清，用40μl缓冲液重悬细胞。b) CD4+T细胞磁性标记：加入10μl生物素-抗体混合物搅拌均匀，4°C孵育10min。c) 加入30μl缓冲液，20μl抗生物素微珠标记non-CD4+T细胞，10μl CD25-PE抗体。搅拌均匀，避光孵育15min。d) 加入2ml缓冲液，将细胞通过一个40μm的细胞过滤器，到新的50ml的管中，清除细胞碎片。4°C，300g离心10min，丢弃上清，用500μl缓冲液重悬细胞，浓度最高可达1.25×108个细胞。e) 收集通过分选柱的未标记细胞。加入2ml缓冲液清洗分选柱，4°C，300g离心10min。将分离的CD4+T细胞完全弃去上清，用90μl缓冲液重悬。f) CD25+细胞磁性标记：加入抗PE磁珠10μl，混合均匀，4℃避光孵育15min。g) 加入2ml缓冲液，4°C，300g离心10min，丢弃上清，用500μl缓冲液重悬细胞，浓度最高可达1×108 cells。h) 富集CD4+CD25+Treg细胞：将细胞涂于柱上进行阳性选择，并加入2ml缓冲液冲洗柱。重复3次。i) 当最后洗涤后柱为空时，在柱上加1ml缓冲液，用柱塞冲洗磁性标记的CD4+CD25+细胞。j) 重复h-i步骤，提高分离的CD4+CD25+Treg细胞的纯度。用FACS缓冲液洗涤细胞，4°C, 300g离心10min。丢弃上清，将分离的CD4+CD25+Treg细胞重悬于RPMI完全培养基中，浓度为2×106 cells/ml。k) 为了检测分离的CD4 +CD25+Treg细胞的纯度，从总分离的CD4+CD25+Treg细胞中提取的2×105个细胞。用50μl含anti-CD4和细胞活力检测试剂的FACS缓冲液。l) 4°C避光孵育20min。用FACS缓冲液洗涤细胞， 4°C，300g离心2min。洗涤后用100μl FACS缓冲液重悬细胞，用流式细胞仪检测纯度。m) 从活细胞中分析Treg细胞纯度，确认CD4+CD25+细胞纯度。图3 Treg细胞分离后纯度分析3. CD4+CD25+Treg和CD8+T体外抑制实验a) 为了制备anti-CD3/CD28包被的磁珠：将适当体积的磁珠转移到15ml管中（2.5μl/1x105 cells）。 加入等体积的PBS并混合。4°C，300g离心2min，丢弃上清液。在完全培养基中稀释磁珠（50μl/孔）。b) 取50μl CD4+CD25+Treg细胞（1×105 cells/孔）。每孔加50μl CD8+T细胞作为应答T (Tresp)细胞（1×105 cells/孔）。每孔加入50μl稀释后的anti-CD3/CD28。注意：在此步骤中，标记和建立对照孔如下:未刺激CD8+T（不含anti-CD3/CD28）；刺激的CD8+T细胞（含anti-CD3/CD28）；刺激的Treg细胞（含anti-CD3/CD28）。Treg细胞可以用完全培养基稀释，以不同比例的Tresp细胞与Treg细胞（1:0.25-1:1）共培养。c) 各孔加50μl或适当体积的培养基，总体积为200μl。用铝箔盖住板子，放入二氧化碳培养箱中37°C培养 72h。d) 培养72h后进行细胞因子产生分析，将每孔上清液分离到另一个板上，进行酶联免疫吸附试验（ELISA），检测IFN-γ水平。e) 将每孔上清液分离后，用FACS缓冲液清洗含有细胞的培养皿，4°C，300g离心2min，洗3次。f) 洗涤后，弃去上清。用50 μl的抗体缓冲液（anti-CD4、anti-CD8和细胞活力检测试剂）重悬细胞，对增殖的CD8+T细胞进行染色（在获得CD8+T细胞时，可使用追踪细胞增殖的染料进行标记）。4°C避光孵育20min。g) 4°C，300g离心2min，洗两次。洗涤后，弃上清，用100μl固定缓冲液4℃避光固定20 min。h) 4°C，300g离心2min，洗两次。200μl FACS缓冲液重悬细胞，流式细胞术检测标记CD8+T细胞增殖情况。图4 活化的Treg细胞对CD8+T细胞应答的影响体外抑制实验的优势在于，因为只有Tresp细胞与Treg细胞共培养，所以它可以直接评估Treg细胞对CD8+T细胞反应的抑制作用。除CD8+T细胞外，也可以通过改变实验条件来评估Treg细胞对其它免疫细胞(如树突状细胞或自然杀伤细胞)的影响。[1] Park HJ, Oh JH, Ha SJ. Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice. J Vis Exp. 2016 Jun 22;(112):54138. doi: 10.3791/54138. PMID: 27404802.[2] Zeng G, et al. Regulatory T Cells in Cancer Immunotherapy: Basic Research Outcomes and Clinical Directions. Cancer Manag Res. 2020 Oct 21; 12:10411-10421. doi: 10.1016/j.bbmt.2014.11.001. PMID: 25459643.[3] Park HJ, et al. PD-1 upregulated on regulatory T cells during chronic virus infection enhances the suppression of CD8+ T cell immune response via the interaction with PD-L1 expressed on CD8+ T cells. J Immunol. 2015 Jun 15;194(12):5801-11. doi: 10.4049/jimmunol.1401936. PMID: 25934860.

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