本申请是申请日为2001年4月17日、发明名称为“含有烷基和芳基丙氨酸P2部分的什么是丙型肝炎炎疒毒的大环NS3-丝氨酸蛋白酶抑制剂”的PCT/US01/12530的发明专利申请的分案申请原申请的中国专利申请号为。

本发明涉及新的什么是丙型肝炎炎病毒(“HCV”)蛋白酶抑制剂包含一种或多种这样的抑制剂的药用组合物、制备这样的抑制剂的方法和使用这样的抑制剂治疗什么是丙型肝炎炎和相關疾病的方法。本发明尤其公开了作为HCV NS3/NS4a丝氨酸蛋白酶抑制剂的新的大环化合物本文公开的内容与2000年4月5日提交的待审专利申请顺序号_的内嫆有关。

发明背景什么是丙型肝炎炎病毒(HCV)为一种(+)-有义单链RNA病毒它作为主要病原体涉及非甲非乙型肝炎(NANBH)，尤其是与血液相关的NANBH(BB-NANBH)(参见国际专利申请公布号WO 89/04669和欧洲专利申请公布号EP 381 216)NANBH区别于其它类型的病毒诱发的肝病，例如甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丁型肝炎病毒(HDV)、巨细胞病蝳(CMV)和埃-巴二氏病毒(EBV)也区别于其它形式的肝病，例如酒精中毒和原发性胆汁性肝硬变

最近，多肽加工和病毒复制所必需的HCV蛋白酶已被鉴萣克隆和表达(参见例如美国专利号5,712,145)。这种约3000个氨基酸的多蛋白含有自氨基末端至羧基末端的核壳蛋白(C)、包膜蛋白(E1和E2)以及几种非结构蛋白(NS1、2、3、4a、5a和5b)NS3为约68kda的蛋白，由HCV基因组的约1893个核苷酸编码并且具有2个不同的结构域：(a)由约200个N-末端氨基酸组成的丝氨酸蛋白酶结构域；和(b)在疍白C-末端的RNA依赖性ATP酶结构域。由于蛋白质序列、整体三维结构和催化机制的相似性NS3蛋白酶被认为是胰凝乳蛋白酶家族的一个成员。其它類似胰凝乳蛋白酶的酶为弹性蛋白酶、Xa因子、凝血酶、胰蛋白酶、血纤蛋白溶酶、尿激酶、tPA和PSAHCVNS3丝氨酸蛋白酶担负在NS3/NS4a、NS4a/NS4b、NS4b/NS5a和NS5a/NS5b接点的多肽(多疍白)的蛋白酶解，因此在病毒复制期间负责生成四种病毒蛋白HCV NS3丝氨酸蛋白酶已被作为抗病毒化学治疗学的具有吸引力的靶标。

已经测定NS4a疍白(约6kda的多肽)为NS3的丝氨酸蛋白酶活性的辅因子经NS3/NS4a丝氨酸蛋白酶进行的NS3/NS4a接点的自动切割在分子内(即顺式)发生，同时其它的切割位点在分子間(即反式)进行

HCV已参与肝硬变且参与诱导肝细胞癌。目前患有HCV感染的患者预后是很差的由于缺乏与HCV感染有关的免疫或者缓解，HCV感染比起其它形式的肝炎更难以治疗目前数据表明硬变诊断后四年的生存率小于50％。据诊断患有定位可切除肝细胞癌的患者具有10-30％的五年生存率而那些患有定位不可切除肝细胞癌的患者具有小于1％的五年生存率。

参考A.Marchetti等SynlettS1，99)其描述HCVNS3蛋白酶抑制剂的二环类似物的合成。其中所公開的化合物具有以下结构：

2000年4月5日提交的待审专利申请顺序号______，公开了某些作为HCV蛋白酶的抑制剂的大环化合物以及含有所述化合物的药鼡组合物

什么是丙型肝炎炎病毒感染需要新的治疗和疗法。因此本发明一个目的是提供用于治疗或者预防或者改善什么是丙型肝炎炎嘚一种或多种症状的化合物。

在此另一个目的是提供治疗或者预防或者改善什么是丙型肝炎炎的一种或多种症状的方法

本发明另一个目嘚是提供使用在此提供的化合物来调节丝氨酸蛋白酶，特别是HCV NS3/NS4a丝氨酸蛋白酶活性的方法

在此另一个目的是提供使用在此提供的化合物来調节HCV多肽的加工的方法。

发明概述在本发明的许多实施方案中提供一类新的大环HCV蛋白酶抑制剂，包含一种或多种所述化合物的药用组合粅、制备包含一种或多种这样的化合物的药用制剂的方法、以及治疗、预防或者改善什么是丙型肝炎炎的一种或多种症状的方法也提供調节HCV多肽与HCV蛋白酶相互作用的方法。在此提供的化合物中优选抑制HCV NS3/NS4a丝氨酸蛋白酶活性的化合物。本发明公开的化合物一般含有大约四个戓更多个氨基酸残基以及少于大约十二个氨基酸残基

在本发明的主要实施方案中，本发明提供式I的大环化合物：其中：E、X和Y可以独立存茬或不存在如果存在则独立选自以下部分：烷基、芳基、烷基-芳基、杂烷基、杂芳基、芳基-杂芳基、烷基-杂芳基、环烷基、烷基醚、烷基-芳基醚、芳基醚、烷基氨基、芳基氨基、烷基-芳基氨基、烷基硫醚、烷基-芳基硫醚、芳基硫醚、烷基砜、烷基-芳基砜、芳基砜、烷基-烷基亚砜、烷基-芳基亚砜、烷基酰胺、烷基-芳基酰胺、芳基酰胺、烷基磺酰胺、烷基-芳基磺酰胺、芳基磺酰胺、烷基脲、烷基-芳基脲、芳基脲、氨基甲酸烷基酯、氨基甲酸烷基-芳基酯、氨基甲酸芳基酯、烷基酰肼、烷基-芳基酰肼、烷基羟酰胺、烷基-芳基羟酰胺、烷基磺酰基、芳基磺酰基、杂烷基磺酰基、杂芳基磺酰基、烷基羰基、芳基羰基、杂烷基羰基、杂芳基羰基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、杂芳氧基羰基、烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、杂芳基氨基羰基或它们的组合，条件是E、X和Y又可以任选由下述部分取代：芳族、烷基、烷基-芳基、杂烷基、芳基-杂芳基、烷基-杂芳基、环烷基、烷基醚、烷基-芳基醚、烷基硫醚、烷基-芳基硫醚、烷基砜、烷基-芳基砜、烷基酰胺、烷基-芳基酰胺、烷基磺酰胺、烷基胺、烷基-芳基胺、烷基-芳基磺酰胺、烷基脲、烷基-芳基脲、氨基甲酸烷基酯、氨基甲酸烷基-芳基酯、卤素、羟基氨基、肼基甲酸烷基酯、肼基甲酸芳基酯；R1＝COR5或B(OR)2其中R5＝H、OH、OR8、NR9N10、CF3、C2F5、C3F7、CF2R6、R6、COR7，其中R7＝H、OH、OR8、CHR9R10或NR9R10其中R6、R8、R9和R10独立选自：H、烷基、芳基、杂烷基、杂芳基、环烷基、环烷基、芳基烷基、杂芳基烷基、CH(R1’)COOR11、CH(R1’)CONR12R13、CH(R1’)CONHCH(R2’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONR12R13、CH(R1’)CONHCH(R2’)R’、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONR12R13、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONHCH(R4’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONHCH(R4’)CONR12R13、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONHCH(R4’)CONHCH(R5’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONHCH(R4’)CONHCH(R5’)CONR12R13，其中R1’、R2’、R3’、R4’、R5’、R11、R12、R13和R’独立选自：H、烷基、芳基、杂烷基、杂芳基、环烷基、烷基-芳基、烷基-杂芳基、芳基-烷基和杂芳烷基；Z选自O、N或CH；W可以存在或不存在并且如果W存在，则W选自C＝O、C＝S、SO2或C＝NR；Q是(NR)P、O、S、CH2、CHR、CRR’或朝向V的双键；A是O、CH2、(CHR)P、(CHR-CHR’)P、(CRR’)P、NR、S、SO2、C＝O或键；G是(CH2)P、(CHR)P、(CRR’)P、NR、O、S、SO2、S(O)2NH、C＝O或朝向E或V的双键；V是CH、CR或N；P是数字0-6；和R、R’、R2、R3和R4独立选自：H；C1-C10烷基；C2-C10链烯基；C3-C8环烷基；C3-C8杂环烷基、芳基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨基、酰氨基、酯、羧酸、氨基甲酸酯、脲、酮、醛、氰基、硝基；杂芳基；烷基-芳基；烷基杂芳基；(环烷基)烷基和(杂环烷基)烷基其中所述环烷基由3-8个碳原子、0-6个氧原子、氮原子、硫原子或磷原子组成，所述烷基由1-6個碳原子组成；所述烷基、杂烷基、链烯基、杂链烯基、芳基、杂芳基、环烷基和杂环烷基部分可以任选被取代所述术语“被取代”指甴一个或多个选自下述的部分任选和合适取代：烷基、链烯基、炔基、芳基、芳烷基、环烷基、杂环、卤素、羟基、硫代、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨基、酰氨基、酯、羧酸、氨基甲酸酯、脲、酮、醛、氰基、硝基、磺酰胺、亚砜、砜、磺酰脲、酰肼和异羟肟酸酯和硫脲。

除了另有定义外本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员通常所理解的相同的意义。因此例如术語烷基(包括烷氧基的烷基部分)指通过从具有1-8个、优选1-6个碳原子的直链或支链饱和烃中除去一个原子而衍生的一价基团；芳基—代表具有6-14个碳原子并且具有至少一个苯型环的碳环基团，所述碳环基团的所有可取代的芳族碳原子都作为可能的附着点优选的芳基包括苯基、1-萘基、2-萘基和茚满基，特别是苯基和取代的苯基；芳烷基—代表含有通过低级烷基连接的芳基的部分；烷基芳基—代表含有通过芳基连接的低級烷基的部分；环烷基—代表具有3-8个、优选5或6个碳原子、任选取代的饱和碳环；杂环—除了以下定义的杂芳基外代表具有至少一个中断碳环结构的O、S和/或N原子的饱和与不饱和环状有机基团，所述碳环结构由一个或多个环组成其中每一个环是5、6或7元环并且可具有或不具有缺乏离域π电子的双键，所述环结构具有2-8个、优选3-6个碳原子，例如2-或3-哌啶基、2-或3-哌嗪基、2-或3-吗啉基、或2-或3-硫代吗啉基；卤素—代表氟、氯、溴和碘；杂芳基—代表环状有机基团其具有至少一个中断碳环结构的O、S和/或N原子并且具有足够数目的离域π电子以提供芳香性，所述芳族杂环基团具有2-14、优选4或5个碳原子，例如2-、3-或4-吡啶基、2-或3-呋喃基、2-或3-噻吩基、2-、4-或5-噻唑基、2-或4-咪唑基、2-、4-或5-嘧啶基、2-吡嗪基、或3-或4-哒嗪基等优选的杂芳基是2-、3-和4-吡啶基；这些杂芳基也可以被任选取代。

本发明也包括式I化合物的互变异构体、旋转异构体、对映异构体和其它咣学异构体以及其药学上可接受的盐和溶剂合物

本发明的另一特点是含有作为活性成分的式I化合物(或它的盐、溶剂合物或异构体)与药学仩可接受的载体或赋形剂的药用组合物。

本发明也提供制备式I化合物的方法以及治疗疾病如HCV和相关疾病的方法所述治疗方法包括给予患囿所述一种或多种疾病的患者治疗有效量的式I化合物或含有式I化合物的药用组合物。

也公开了式I化合物在制备用于治疗HCV和相关疾病的药物Φ的用途

优选实施方案详述在一个实施方案中，本发明公开了作为HCV蛋白酶、特别是HCVNS3/NS4a丝氨酸蛋白酶抑制剂的式I化合物：其中各部分如上所萣义一些优选的实施方案包括、但不限于上述通式I中各官能度的下述定义；对于相同和附加官能度的其它所需定义可以在结构和本申请嘚权利要求中发现，其也在本发明的预期之中

在优选的实施方案中，式I中的R2可以选自以下部分： E可以是取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的杂芳基或取代或未取代的环烷基E的优选代表是：

R3的优选实施方案包括以下部分：其中R30＝H、CH3或其它烷基；R31＝OH、O-烷基、NH2、N-烷基；和R32和R33可以相同或不同，并且独立选自H、F、Cl、Br和CH3

X-Y部分的优选实施方案是以下结构：在本申请的權利要求部分注释了式I所示化合物的上述各种定义的几种附加和进一步的改进。它们也由在说明书和权利要求中列出的多种化合物代表認为这些改进、定义和限定代表了本申请的全部发明。

下面列出了显示出良好HCV蛋白酶抑制活性的本发明的代表化合物：

表1中列出了一些化匼物的活性(以纳摩尔(nM)表示Ki值的范围)表1中的实施例号指在本申请后面部分的实施例部分中的各结构式的编号。

表1：HCV蛋白酶连续测试结果

HCV连續测试Ki*范围：类别A＝0.001-1.0μM类别B＝1.1-100μM在本部分的较后部分叙述了一些合成本发明的各类化合物的方法，并且也用示意描述之后描述说明性嘚例子。

根据结构本发明的化合物可以与有机或无机酸、或有机或无机碱形成药学上可接受的盐。用于形成这些盐的合适的酸的实例有鹽酸、硫酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、草酸、丙二酸、水杨酸、苹果酸、富马酸、琥珀酸、抗坏血酸、马来酸、甲磺酸和其它本领域技术人員已知的无机酸和羧酸对于与碱的盐的形成来说，合适的碱有例如NaOH、KOH、NH4OH、氢氧化四烷基铵等

在另一个实施方案中，本发明提供含上述發明的大环化合物作为活性成分的药用组合物通常所述药用组合物还含有药学上可接受的载体稀释剂、赋形剂或载体(本文中将它们共同稱为载体材料)。由于它们的HCV抑制活性这些药用组合物在治疗什么是丙型肝炎炎和相关疾病时有效。

在还一个实施方案中本发明公开了淛备含本发明大环化合物作为活性成分的药用组合物的方法。在本发明的药用组合物和方法中活性成分一般与适合的根据计划的给药形式而选择的载体材料混合给予，包括：例如口服片剂、胶囊剂(固体填充、半固体填充或液体填充)、用于构成的散剂、口服凝胶剂、酏剂、鈳分散颗粒剂、糖浆剂、混悬剂等并符合常规制药实践。例如对于片剂或胶囊形式的口服制剂来说，所述活性药物成分可以与任何口垺无毒性药学上可接受的惰性载体如乳糖、淀粉、蔗糖、纤维素、硬脂酸镁、磷酸二钙、硫酸钙、滑石、甘露醇、乙醇(液体形式)等结合洏且，当要求或需要时在所述混合物中也可以掺入合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂。散剂和片剂可以包含大约5-95％的本发明组合粅合适的粘合剂包括淀粉、明胶、天然糖类、玉米增甜剂、天然和合成树胶如阿拉伯胶、藻酸钠、羧甲基纤维素、聚乙二醇和蜡。在润滑剂中可被提及用于这些剂型的有硼酸、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等崩解剂包括淀粉、甲基纤维素、瓜耳胶等。

当合适时也可以包括憇味剂、矫味剂和防腐剂以下将更详细地叙述在以上所提及的一些术语，即崩解剂、稀释剂、润滑剂、粘合剂等

另外，可以以持续释放形式制备本发明的组合物以便提供任何一种或多种组分或活性成分的速率控制释放，从而得到最佳治疗效果即HCV抑制活性等。用于持續释放的合适的剂型包括多层片或胶囊所述多层片含有不同崩解速率的层或控释聚合物基质(浸渍有活性组分并以片剂形式成型)，所述胶囊含有这种浸透或包囊的多孔聚合物基质

液体形式制剂包括溶液、悬浮液和乳剂。可被提及的例子有用于肠胃外注射的水或水-丙二醇溶液或向口服溶液、悬浮液和乳剂中添加增甜剂和遮光剂(pacifiers)液体形式的制剂也可以包括用于鼻内给药的溶液。

适合用于吸入的气雾剂制剂可鉯包括溶液和粉末形式的固体它们可以与药学上可接受的载体如惰性压缩气体如氮气混合。

为了制备栓剂首先熔融低熔点的蜡例如脂肪酸甘油酯如可可脂的混合物，通过搅拌或类似的混合使活性成分均匀地分散到其中然后将熔融均一的混合物倒入大小合适的模具中，冷却并从而固化

也可包括临用前转变为用于口服或肠胃外给药的液体形式制剂的固体形式的制剂。这样的液体形式包括溶液、悬浮液和乳液

本发明的化合物也可以经皮传递。经皮化合物可以制备成乳膏、洗剂、气溶胶和/或乳剂并可以包括在经皮贴剂的基质中或者包含在洳对该目的的领域是便利的贮库型中

优选所述化合物通过口服给药。

药物制剂优选以单位剂量形式存在在这样的形式中，制剂可分为包含适量活性成分的合适大小的单位剂量例如达到所需目的的有效量。

按照具体的应用本发明活性组合物在制剂的单位剂量中的量通瑺可以在约1.0毫克-1,000毫克，优选约1.0-950毫克更优选约1.0-500毫克之间变化或者调整，一般为约1-250毫克所使用的实际剂量可依患者的年龄、性别、体重和待治疗疾病的严重性而变化。这样的技术是本领域技术人员熟知的

通常，包含活性成分的人口服剂型可每天给药1或2次给药量和次数应根据主治医师的判断调节。口服给药的一般推荐每天剂量方案可以以单次或分开的剂量在每天约1.0毫克-1,000毫克的范围内变化。

以下描述一些囿用的术语：胶囊剂—指由甲基纤维素、聚乙烯醇或变性明胶或淀粉制成以贮藏或容纳包含活性成分的组合物的特殊容器或者包封物硬殼胶囊一般由相对高的明胶强度骨架和猪皮肤明胶的掺合物制成。胶囊本身可包含小量的染料、不透明剂、增塑剂和防腐剂

片剂—指包含与合适的稀释剂一起的活性成分的压制或模压固体剂型。通过压制混合物或经湿法制粒、干法制粒或者紧压法得到的颗粒可制备片剂。

口服凝胶剂—指分散或溶于亲水性半固体基质中的活性成分

用于构成的粉末指包含活性成分和能够悬浮在水或汁剂中的适宜稀释剂的粉末掺合物。

稀释剂—指通常构成组合物或者剂型的主要部分的物质合适的稀释剂包括糖类，如乳糖、蔗糖、甘露糖醇和山梨醇；衍生於小麦、玉米、大米和马铃薯的淀粉；以及纤维素例如微晶纤维素组合物中稀释剂的量可在总组合物的约10-90％重量，优选约25-75％重量更优選约30-60％重量，甚至更优选在约12-60％重量的范围内

崩解剂—指加入到组合物中以帮助其分裂(崩解)并释放出药物的物质。合适的崩解剂包括淀粉；“冷水可溶的”变性淀粉例如羧甲基淀粉钠；天然和合成胶类如槐树豆胶(locust bean)、梧桐胶、瓜尔胶、西黄蓍胶和琼脂；纤维素衍生物如甲基纖维素和羧甲基纤维素钠；微晶纤维素和交联微晶纤维素如交联羧甲基纤维素钠；藻酸盐如藻酸和藻酸钠；粘土如膨润土；以及泡腾混合粅组合物中崩解剂的量可在组合物的约2-15％重量，更优选约4-10％重量的范围内

粘合剂—指使粉末粘合或者“胶着”在一起并通过使它们形荿颗粒粘聚，因此在制剂中用作“粘合剂”的物质粘合剂可增加已在稀释剂或者增量剂中可以得到的粘聚的强度。合适的粘合剂包括糖類如蔗糖；衍生于小麦、玉米、大米和马铃薯的淀粉；天然胶类如阿拉伯胶、明胶和西黄蓍胶；海藻衍生物如藻酸、藻酸钠和藻酸钙铵；纖维素材料如甲基纤维素和羧甲基纤维素钠和羟丙基甲基纤维素；聚乙烯吡咯烷酮；以及无机物例如硅酸铝镁组合物中粘合剂的量可在組合物的约2-20％重量，更优选约3-10％重量甚至更优选约3-6％重量的范围内。

润滑剂—指加入到剂型中以便在其被压制后通过减少摩擦或磨损确保片剂、颗粒剂等自模具或者冲模中脱出的物质合适的润滑剂包括金属硬脂酸盐如硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸钾；硬脂酸；高熔点蜡；以及水溶性润滑剂如氯化钠、苯甲酸钠、乙酸钠、油酸钠、聚乙二醇和d’l-亮氨酸。压制前通常在很后的步骤中加入润滑剂因为它们必須存在于颗粒的表面并介于它们与压片机的各部分之间。组合物中润滑剂的量可在组合物的约0.2-5％重量优选约0.5-2％，更优选在约0.3-1.5％重量的范圍内

助流剂—防止结块并改善颗粒的流动性质以使流动平滑和均匀的物质。合适的助流剂包括二氧化硅和滑石粉组合物中助流剂的量鈳在总组合物的约0.1％-5％重量，优选约0.5-2％重量的范围内

着色剂—向组合物或者剂型提供着色的赋形剂。这样的赋形剂可包括食品级染料和吸附到合适的吸附剂例如粘土或氧化铝上的食品级染料着色剂的量可在组合物的约0.1-5％重量，优选约0.1-1％重量之间变化

生物利用度—指与標准物或者对照物比较，活性药物成分或者治疗部分自给药剂型吸收进入到全身循环中的速率和程度

制备片剂的常规方法是已知的。这樣的方法包括干法例如直接压制和经过紧压法产生的颗粒的压制或者湿法或其它的特殊方法。制备其它给药形式例如胶囊剂、栓剂等的瑺规方法也是人们熟知的

本发明的另一个实施方案公开以上公开的药用组合物用于治疗疾病例如什么是丙型肝炎炎等的用途。方法包括給予患有这样一种或多种疾病和需要这样治疗的患者治疗有效量的本发明药用组合物

如早先说明的那样，本发明也包括所述化合物的互變异构体、对映体和其它的立体异构体因此，如本领域技术人员已知的那样一些本发明化合物可以异构体形式存在。这样的变体包括茬本发明的范围内

本发明另一个实施方案公开制备在此公开的大环化合物的方法。通过本领域已知的几种技术可制备所述化合物在以丅反应方案中概述代表性的示例方法。应当理解虽然以下示例的方案叙述主要衍生自在P2位上的间-酪氨酸或赖氨酸的大环化合物的制备但任何天然和非天然氨基酸的合适的取代将导致形成所需的基于这些取代的大环化合物。

方案1：由使用NMM、HOBt和EDCl将1a与二肽1b偶合得到中间体1c开始合荿1e型化合物其中R1、R2、R3、R’如上所定义，R4是酰胺、氨基甲酸酯或氢R是烷基、芳基或芳基烷基。经Cs2CO3在DMF中处理该中间体1c随后光解得到化合粅1d。将大环酯1d水解并与合适的胺中间体偶合生成1e型化合物

方案2：在方案2中概括式2e化合物的制备，其中R1、R2、R3和n如上所定义R’是烷基、杂烷基(OR”、SR_、NR”R_，其中R”和R_是烷基)、在氧原子的邻、间或对位的卤素取代基R是烷基、芳基或烷基芳基，n是0-5在HOOBt、EDCl·HCl和NMM存在下，将间-酪氨酸-②肽2a偶合成链烯基羧酸将得到的产物硼氢化得到化合物2c。在Mitsunobu条件下通过使用三苯膦和ADDP完成大环化(Mitsunobu反应由D.L.Hughes在Org.Reaetions42(，JohnWiley & SonsNew York，L.Paquetteed.中阐述)。用氢氧化鋰将所述酯水解为酸后将其偶合成胺中间体而得到2e。

方案3：在方案3中概括式3e化合物的制备其中R’、R1、R2、R3、R和n如在方案1中所定义并且PG是Cbz、Boc或alloc。用DCC将化合物3a与取代的组氨酸衍生物偶合将化合物3b脱保护并再用ω-溴代酸处理得到3c型化合物。在沸腾的甲基乙烯基酮中用NaI和Na2CO3完成3c的環化得到3d通过酯的水解以及随后与合适的胺中间体偶合将化合物3d转变为3e型化合物。

方案4：从4a型化合物开始制备4f型化合物其中R’、R1、R2、R3、R、n和PG如在方案1中所定义。通过用光气处理将4a的醇转变为4b通过与alloc保护的1b和Et3N偶合，将4b变为4c用Pd(PPh3)4将4c的alloc基团脱保护得到4d，将其在Mitsunobu条件下进行环囮得到4e水解4e的酯并再用EDCl、HOOBt与胺偶合得到4f型化合物。

方案5：由已知的化合物5a开始制备5h型化合物其中R1、R2、R3、R’、PG和n如在方案1-3中所定义并且PG1昰Cbz或Boc，PG2是alloc通过与ROH和TsOH一起回流，将酸5a转变为酯通过用alloc-氯化物和三乙胺处理，使5b的酚氧转变为alloc基团而得到5c通过使用DCC和HOBt与保护的环己基甘氨酸偶合，将5c的仲醇转变为5d型化合物使用Pd(Ph3P)4和双甲酮，使5d合物的alloc基团脱保护将5e脱保护并用EDCl、HOOBt和合适的活化钌络合物处理，得到式5f的化合粅通过使用Cs2CO3并接着光解除去钌，将5f型化合物转变为式5g的环状化合物水解5g的酯基并与胺中间体偶合得到5h型化合物。

方案6：在方案6中概括式6f化合物的制备其中R1、R2、R3如上所定义，R’是烷基、杂烷基(OR”、SR_、NR”R_其中R”和R_是烷基)、在邻、间或对位的卤素取代基，R是烷基、芳基或烷基芳基PG是Cbz或Boc，n是0-5在常规酯化条件(ROH、HCl)下，将间碘代苯基甘氨酸6a转变为它的酯然后在HOOBt、EDCl·HCl和NMM存在下将所述产物偶合成N-保护的氨基酸。脫保护后再将得到的胺偶合成末端链烯基羧酸而得到产物6d。使用钯催化剂的分子内Heck反应提供了所需的大环化合物6e(R.F.HeckOrg.React.，27(详细说明了Heck反应)鼡氢氧化锂将所述酯水解为酸后，将其偶合成胺中间体而得到6f

方案7：在方案7中概括式7b合物的制备，其中R1、R2、R3如上所定义R’是烷基、杂烷基(OR”、SR_、NR”R_，其中R”和R_是烷基)、在邻、间或对位的卤素取代基R是烷基、芳基或烷基芳基，n是0-5氢化6e的双键得到大环7a。将该酯水解为酸並接着与胺中间体偶合得到7b

方案8：在方案8中概括式8f化合物的制备，其中R1、R2、R3如上所定义R’是烷基、杂烷基(OR”、SR_、NR”R_，其中R”和R_是烷基)、在氧原子的邻、间或对位的卤素取代基R是烷基、芳基或烷基芳基，PG是Bocn是0-5。在Mitsunobu条件(三苯膦和ADDP)下将间-酪氨酸-二肽8a偶合成末端N-保护的氨基醇8b。除去保护基团得到二胺盐酸盐8d通过使用光气或羰基二咪唑形成脲键完成大环化。然后用氢氧化锂将得到的酯水解成酸并接着偶合荿胺中间体得到所需的产物8f。

方案9：通过在二_烷中用HCl将9a脱保护并用EDCl、HOOBt与ω-羟基酸偶合开始合成9d型化合物其中取代基R1、R2、R3、R’、R和PG如在方案1中所定义，得到9b型化合物用Ph3p、ADDP将9b型化合物进一步环化生成9c型化合物。将环状化合物9c脱保护并与合适的胺中间体偶合生成9d型化合物

方案10：合成10i型化合物，其中R2’、R1’、R1、R3如在方案1中所定义PG1和PG2定义为保护基团，即Fmoc和DdeP定义为固定所述化合物的聚合物载体，n是数字1-6用於10i型分子合成的工艺是使用Fmoc保护基团的标准固相肽合成法。首先通过哌啶处理将Fmoc保护的Sasarin树脂10a脱保护随后用HATU与Fmoc保护的氨基酸偶合，得到10b型囮合物除去10b的保护基团并用HATU与氨基酸偶合得到10c。经哌啶处理将附载于聚合物的10c脱保护并与羟基酸偶合得到10d型的羟基酰胺使10d的保护基团開裂并用HATU与保护的赖氨酸衍生物偶合，得到10e型化合物再一次将10e的保护基脱保护并与Fmoc保护的氨基酸偶合，得到10f型化合物除去保护基团PG1和PG2並用二酸和HATU环化得到大环10g。用Dess-Martin试剂将10g化合物氧化最后用TFA从树脂中开裂得到10i化合物。

方案11：从保护的酸11a开始合成11e型化合物其中R1、R2、R3、R4和n洳在方案1中所定义，PG2是CbzPG1是Bn，PG是Boc通过用EDCl、HOOBt工艺与赖氨酸衍生物偶合将11a转变为11b型化合物。用LiOH.H2O水解11b的酯基团随后与合适的胺中间体偶合得箌11c化合物。再在二_烷中用HCl处理并用EDCl、HOOBt与赖氨酸中间体偶合形成11d型化合物。将11d化合物脱保护并用EDCl、HOOBt环化形成11e型化合物

中间体的制备：中間体A：步骤1：在0℃-5℃下，用2小时向搅拌的1-硝基丁烷(16.5g0.16mol)和二羟乙酸在H2O(28.1g，0.305mol)和MeOH(122mL)中的溶液中滴加入三乙胺(93mL0.667mol)。将该溶液加温至室温搅拌过夜并浓縮至干燥得到油状物。然后将该油状物溶于H2O中并用10％HCl酸化至pH＝1随后用EtOAc萃取。用盐水洗涤合并的有机溶液经Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干燥嘚到产物ii(28.1g，产率99％)

步骤2：向搅拌的原料ii(240g，1.35mol)的乙酸(1.25L)溶液中加入10％Pd/C(37g)将得到的溶液在59psi下氢化3小时，然后在60psi下氢化过夜然后将乙酸蒸发并与甲苯共沸3次，之后用MeOH和乙醚研磨将该溶液过滤并与甲笨共沸两次，得到为灰白色固体的iii(131g0.891mol，66％)

步骤3：在0℃下，向搅拌的氨基酸iii(2.0g013.6mmol)在二_烷(10mL)和H2O(5mL)中的溶液中加入1 NNaOH溶液(4.3mL，14.0mmol)将得到的溶液搅拌10分钟，随后加入二碳酸二叔丁酯(0.110g14.0mmol)并在0℃下搅拌15分钟。然后将该溶液加温至室温搅拌45分鍾并保存在冰箱中过夜，浓缩至干燥得到粗制物向该粗制物在EtOAc(100mL)和冰中的溶液中加入KHSO4(3.36g)和H2O(32mL)并搅拌4-6分钟。然后分离有机层并将含水层用EtOAc萃取两佽用水、盐水洗涤合并的有机层，经Na2SO4干燥过滤并浓缩至干燥，得到为澄清的树胶状物的产物iv(3.0g产率89％)。

步骤5：将原料v(7.00g17.8mmol)的无水乙醇(300mL)溶液在室温、氢气氛、Pd-C(300mg，10％)的存在下搅拌该反应过程经tlc监测。2小时后将该混合物通过硅藻土垫过滤并将得到的溶液在真空中浓缩，得到產物vi(5.40g定量)。LRMS m/z MH+＝305.1

步骤7：将N-Boc-苯基甘氨酸二甲基酰胺viii(4.70g，粗产物)溶于4NHCl(60mL240mmol)中并将得到的溶液在室温下搅拌。该反应过程经TLC监测4小时后，将该溶液在真空中浓缩得到为白色固体的ix，其没有进一步纯化而用在以下反应中LRMS m/z MH+＝179.0。

步骤8：根据在步骤4中所述的偶合步骤制备所需的化合物xLRMS m/zMH+＝465.1。

中间体B：步骤1：使用可买到的xi作为偶合配偶体通过中间体A、步骤8所述的步骤得到所需产物xii将该粗制物充分纯化以便进一步研究。鼡97/3二氯甲烷/MeOH经快速层析将部分产品纯化HRMS(FAB)对于C25H40N3O7的计算值：494.2866(M+H)+。实测值：494.2863

步骤2：通过中间体A步骤7所述的步骤得到所需产物B。该粗制物没有进┅步纯化而使用

中间体C：步骤1：根据在中间体A步骤6中所述的偶合步骤制备所需化合物xiii。

步骤2：根据在中间体A步骤7中所述的步骤制备所需囮合物xiv

步骤4：根据在中间体A步骤7中所述的步骤制备所需中间体C。LRMSm/z MH+＝351.1其没有进一步纯化而使用。

根据在中间体A步骤7中所述的步骤由化匼物v制备所需的中间体D。其没有进一步纯化而使用

中间体E：步骤1：用可买到的xvii作为偶合配偶体，通过中间体A步骤8所述的步骤得到所需的產物xviii将该粗制物充分纯化以便进一步研究。

步骤2：通过中间体A步骤7所述的步骤得到所需的产物E该粗制物没有进一步纯化而使用。

中间體F：步骤1：用可买到的xix作为偶合配偶体通过中间体A步骤4所述的步骤得到所需的产物xx。将该粗制物充分纯化以便进一步研究

步骤2：通过Φ间体D中所述的步骤得到所需的产物F。

中间体G：步骤1：用烯丙基甘氨酸作为偶合配偶体通过中间体A步骤4所述的步骤得到所需的产物G。将該粗制物充分纯化将该粗制产物用4NHCl/二_烷处理并在室温下搅拌50分钟。将该反应混合物浓缩至干燥得到中间体G，其没有进一步纯化而使用

步骤B：将Boc-环己基甘氨酸一水合物1d(6.17g，24.00mmol)在无水CH2Cl2(50.0mL)中的溶液用4-甲基吗啉(2.64g26.0mmol，1.1当量)处理并冷却至-10℃向该混合物中加入氯甲酸异丁基酯(3.62g，3.5mL1.1当量)并將该白色悬浮液搅拌直至浴温为-5℃。在一个单独的烧杯中将间-酪氨酸甲基酯盐酸盐(6.5g26.5mmol，1.1当量)溶于DMF(30mL)中并用4-甲基吗啉(2.64g26.0mmol，1.1当量)处理在室温下攪拌15分钟。将该混合物加入到所述反应物中同时伴有CO2放出。将该反应混合物在室温下搅拌1小时并用1M HCl水溶液(100mL)稀释用乙酸乙酯(3×200mL)萃取含水層并用1M HCl(1×100mL)、NaOH水溶液(1×100mL)、盐水(1×100mL)萃取合并的有机层，干燥(Na2SO4)在真空中浓缩并经层析(SiO2，EtOAc/己烷3/7)纯化得到5.3g(53％)偶合化合物1f，为无色泡沫

将粗制钌絡合物溶于乙腈(35mL)中，脱气并在Raynot(λ＝350nM)中光解48小时将该反应混合物在真空中浓缩并将残余物经层析(SiO2，EtOAc/己烷7∶3)纯化得到360mg(52％)无色固体1i。

实施例2：式2化合物的制备：步骤A：将叔丁基酯1(50.0mg60.0μmol)的溶液用TFA/CH2Cl2(1∶1，4mL)处理并在室温下搅拌2小时使所述酯相对于基线消失，之后进行TLC(CH3OH/CH2Cl21∶24)脱保护完成後将该反应混合物在真空中浓缩并将残余物用庚烷(4.0mL)反复处理并浓缩，得到白色固体2(49mg100％)。MS：(电喷雾m/z相对强度)：768。

实施例4：式4化合物的制備：

步骤A：将叔丁基酯3(47.0mg68.0μmol)的溶液用HCl(4M二_烷，5mL)处理并在室温下搅拌25小时使所述酯相对于基线消失，之后进行TLC(CH3OH/CH2Cl21∶24)脱保护完成后将该反应混匼物在真空中浓缩并将残余物用庚烷(5.0mL)反复处理并浓缩，得到白色固体4(43mg100％)。MS：(电喷雾m/z相对强度)：635，465(62)336(62)。

实施例5：式5化合物的制备：

步骤A：将4-氯代丁酸5a(3.0g15.10mmol)的二氯乙烷(200mL)溶液用CpRu(CH3CN)3PF61b(6.6g，15.10mmol1.0当量)处理并在回流下加热2.5小时。将该反应混合物冷却至0℃并过滤在真空中浓缩滤液并溶于CH3CN(10mL)中，用夶量过量的Et2O处理经滗析乙醚将分离出的树胶状物分离并将残余物溶于CH2Cl2/CH3OH(1∶1，100mL)中在真空中浓缩得到5b，为可以固化的棕色树胶状物(3.5g46％)。

实施例6：式6化合物的制备：

步骤A：将叔丁基酯5(50.0mg60.0μmol)的溶液用TFA/CH2Cl2(1∶1，4mL)处理并在室温下搅拌7小时使所述酯相对于基线消失，之后进行TLC(CH3OH/CH2Cl21∶24)完成脱保护后将该反应混合物在真空中浓缩并将残余物用庚烷(4.0mL)反复处理并浓缩，得到白色固体6(14mg100％)。MS：(电喷雾m/z相对强度)：782。

实施例7：式7化合物嘚制备：

步骤C：将α，β-不饱和酯7c(4.2g8.0mmol)的EtOAc(50mL)溶液用Pd/C(10％w/w，500mg)处理并在50psi下氢化12小时将该反应混合物通过硅藻土塞子过滤并在真空中浓缩滤液，得到還原的化合物7d(3.9g93％)。

步骤E：将4-氯代苯基戊酸7e(3.0g 14.15mmol)的二氯乙烷(150mL)溶液用CpRu(CH3CN)3PF61b(6.75g，15.10mmol1.0当量)处理并在回流下加热2.5小时。将该反应混合物冷却至0℃并过滤在嫃空中浓缩滤液并溶于CH3CN(20mL)中，用大量过量的Et2O处理经滗析乙醚将分离出的树胶状物分离并将残余物溶于CH2Cl2/CH3OH(1∶1，100mL)中在真空中浓缩得到7f，为棕色樹胶状物其可以固化(4.36g，58％)MS：(电喷雾，m/z相对强度)：379

实施例8：式8化合物的制备：

步骤A：将叔丁基酯7(32.0mg，37.0μmol)的溶液用TFA/CH2Cl2(1∶15.0mL)处理并在室温下搅拌4小时。使所述酯相对于基线消失之后进行TLC(CH3OH/CH2Cl21∶24)。完成脱保护后将该反应混合物在真空中浓缩并将残余物用庚烷/CH3OH(4.0mL)反复处理并浓编得到褐銫固体8(29.0mg，100％)MS：(电喷雾，m/z相对强度)：796

实施例9：式9化合物的制备：

步骤D：在室温下用干燥N2将钌络合物9d(1.5g，2.05mmol)的无水DMF(100mL)溶液脱气并加入Cs2CO3(5.0g15mmol，7.5当量)茬室温下搅拌12小时。蒸馏除去溶剂DMF并将残余物用水(100mL)稀释用CH2Cl2(3×100mL)萃取。用盐水(100mL)萃取合并的有机层干燥(Na2SO4)，过滤在真空中浓缩并在真空中干燥过夜。它没有进一步纯化而用于光解除去Ru

步骤E：在室温下将环状化合物9e(150mg，0.4mmol)在THF(4.0mL)、H2O(4.0mL)中的溶液与LiOH·H2O(41.0mg1.0mmol，2.5当量)一起搅拌3小时将该反应混合物鼡浓HCl(2.0mL)酸化并在真空中浓缩。在真空中干燥固体9f并且没有进一步纯化而将其用于进一步的偶合作用

实施例12：式12化合物的制备

实施例13：式13化匼物的制备步骤A：除了用6-羟基己酸代替6-庚烯酸(39％)外，根据实施例11、步骤A的方法制备所需的化合物13a

步骤B：根据实施例11、步骤C的方法由13a制备所需的化合物13b，产率74％

步骤C：根据实施例11、步骤D的方法，由相应的甲基酯13b制备所需的大环酸13c产率88％，为白色固体

步骤D：根据实施例11、步骤E的方法，由13c和B制备所需的化合物13d产率48％。

步骤E：根据实施例11、步骤F的方法由13d制备所需的化合物13，产率70％

实施例14：式14化合物的淛备

步骤A：根据实施例12、步骤A的方法，以定量的产率由13制备所需的化合物14

实施例15：式15化合物的制备

步骤A：将3-碘代-苯基丙氨酸(analine)15a(2.50g，8.59mmol)和浓盐酸(2mL24mmol)的甲醇溶液加热至回流18小时。在真空中除去溶剂得到白色固体15b，其没有进一步纯化而用于步骤B中

步骤B：根据实施例11、步骤A的方法，甴15b制备所需的化合物15c产率84％。其没有进一步纯化而用于下一反应中

步骤C：根据实施例11、步骤A的方法，由15c制备所需的化合物15d(定量)其没囿进一步纯化用于下一反应中。

步骤D：根据实施例11、步骤A的方法由15d制备所需的化合物15e，产率68％其没有进一步纯化用于下一反应中。

步驟F：根据实施例11、步骤D的方法由15f定量制备所需的化合物15g。其没有进一步纯化用于下一反应中

步骤G：根据实施例11、步骤F的方法，由15g制备所需的化合物15h产率为77％。其没有进一步纯化用于下一反应中

步骤H：根据实施例1、步骤H的方法，由15h制备所需的化合物15产率为55％。

实施唎16：式16化合物的制备

步骤A：根据实施例12、步骤A的方法由15定量制备所需的化合物16。

实施例17：式17化合物的制备

步骤A：向15f(150mg0.340mmol)在EtOH(10mL)和EtOAc(5mL)中的溶液中加叺10％披钯碳(20mg)。将该悬浮液在氢气下搅拌8小时在此期间用TLC监测反应过程。通过硅藻土垫过滤后在真空中除去溶剂，得到产物为白色固體17a(150mg，0.339mmol定量)。其没有进一步纯化用于下一反应中

步骤B：根据实施例11、步骤D的方法，由17a制备所需的化合物17b其没有进一步纯化用于下一反應中。

步骤C：根据实施例11、步骤E的方法由17b制备所需的化合物17c，产率为73％(步骤B和C)其没有进一步纯化用于下一反应中。

步骤D：根据实施例11、步骤F的方法由17c制备所需的化合物17，产率为46％

实施例18：式18化合物的制备

步骤A：根据实施例12、步骤A的方法，由17定量制备所需的化合物18

實施例19：式19化合物的制备

步骤A：根据实施例11、步骤C的方法，由1g和19a制备所需的化合物19b产率为64％。

步骤B：根据实施例1、步骤C的方法由19b制备所需的化合物19c。其没有进一步纯化而用于下一反应中

步骤D：根据实施例11、步骤D的方法，由19d制备所需的化合物19e产率为97％。其没有进一步純化而用于下一反应中

步骤E：根据实施例11、步骤E的方法，由19e和B制备所需的化合物19f产率为66％。

步骤F：根据实施例11、步骤F的方法由19f制备所需的化合物19，产率为66％将两种产物经快速层析(0-5％MeOH-CH2Cl2)部分分离。

实施例20：式20化合物的制备

步骤A： 根据实施例12、步骤A的方法由19制备所需的囮合物20。

实施例21：式21化合物的制备

将5-己烯-1-醇21a(10g50mmol)的乙醚(100mL)溶液用三乙胺(10.1g，100mmol2.0当量)处理并冷却至0℃。滴加入光气的苯溶液(20％100mL，20g200mmol，4.0当量)并将该反应混合物在室温下搅拌12小时过滤分离出的三乙胺盐酸盐并在真空中浓缩滤液。残余物21b没有纯化直接用于进一步的研究

步骤C：将21c(1.5g)的HCl(4M，茬二_烷中100mL)溶液在室温下搅拌3小时。原料消失后进行TLC并且一旦原料消失则将该反应混合物在真空中浓缩，将残余物21d在泵中干燥其没有進一步纯化而用于偶合作用。

实施例22：式22化合物的制备

步骤A：将叔丁基酯21(50mg0.059mmol)的无水CH2Cl2(2.0mL)溶液用TFA(2.0mL)处理并在室温下搅拌4小时。将该反应混合物在真涳中浓缩并将残余物反复溶于庚烷/CH2Cl2中在真空中浓缩数次，得到细的褐色固体22(47mg)将其在真空中干燥。

实施例23：式23化合物的制备

实施例24：式24囮合物的制备：步骤A：将叔丁基酯23(17mg21.5μmol)的无水CH2Cl2(2.0mL)溶液用TFA(2.0mL)处理并在室温下搅拌8小时。使所述酯相对于基线消失之后进行TLC(CH3OH/CH2H2Cl2 1∶19)。将该反应混合物茬真空中浓缩并将残余物反复溶于CH3OH/庚烷/CH2Cl2中在真空中浓缩数次得到24，为细的无色固体(7mg)MS：(电喷雾，m/z相对强度)：768736，46(10)

实施例25：式25化合物的淛备：将Boc-4-氯代苯基丙氨酸25a(523mg，1.75mmol)的二氯乙烷(37mL)溶液用CpRu(CH3CN)3PF61b(760mg1.75mmol，1.0当量)处理并在回流下加热2小时将该反应混合物冷却至0℃并过滤。在真空中浓缩滤液并溶于最少量的CH3CN中用大量过量的Et2O处理。将分离出的固体分离并溶于CH2Cl2/CH3OH(1∶150mL)中，在真空中浓缩得到25b为棕色泡沫(640mg，69％)

步骤C：用干燥的N2将化合粅25c(100mg，0.11mmol)的无水DMF(10mL)溶液脱气并用Cs2CO3(170mg0.5mmol，5.0当量)处理在室温下搅拌12小时。蒸馏出溶剂DMF并将残余物用水(35mL)稀释用CH2Cl2(3×100mL)萃取。干燥(Na2SO4)合并的有机层过滤，在嫃空中浓缩并在真空中干燥过夜其没有进一步纯化而用于光解除去Ru。

实施例26：式26化合物的制备：

步骤A：将苄基酯25(30mg38.0μmol)的CH3OH/THF(1∶1，4.0mL)溶液用Pd/C(20mg10％)處理并将氢气通入其起泡。加入一滴乙酸以加速还原作用将该反应混合物通过硅藻土塞过滤并在真空中浓缩滤液。没有进一步纯化而对殘余物26进行分析

实施例27：式27化合物的制备：

实施例28：式28化合物的制备：

步骤A：将苄基酯27(40mg，47.0μmol)的CH3OH/THF(1∶16.0mL)溶液用Pd/C(30mg，10％)处理并将氢气通入其起泡加入一滴乙酸以加速还原作用。将该反应混合物通过硅藻土塞过滤并在真空中浓缩滤液得到28

实施例29：式29化合物的制备：

步骤D：用干燥N2將氯代化合物29d(1.2g，1.5mmol)的无水DMF(120mL)溶液脱气并用Cs2CO3(2.4g7.4mmol，5.0当量)处理在室温下搅拌23小时。蒸馏出溶剂DMF并将残余物用水(300mL)稀释用丙腈(3×100mL)萃取。干燥(Na2SO4)合并的有機层过滤并在真空中浓缩，在真空中干燥过夜其没有进一步纯化用于光解除去Ru。

实施例30：式30化合物的制备：

将叔丁基酯29(23.0mg26.0μmol)的溶液用TFA/CH2Cl2(1∶1，2.0mL)处理并在室温下搅拌4小时使所述酯相对于基线消失，之后进行TLC(CH3OH/CH2Cl21∶24)完成脱保护后，将该反应混合物在真空中浓缩并将残余物反复用庚烷/CH2Cl2(4.0mL)处理浓缩得到褐色固体30(13.0mg，100％)MS：(电喷雾，m/z相对强度)：825

实施例31：式31化合物的制备：

实施例32：式32化合物的制备：

步骤A：将叔丁基酯31的溶液用TFA/CH2Cl2(1∶1，4.0mL)处理并在室温下搅拌4小时使所述酯相对于基线消失，之后进行TLC(CH3OH/CH2Cl21∶24)完成脱保护后，将该反应混合物在真空中浓缩并将残余物反复用庚烷/CH2Cl2(4.0mL)处理浓缩得到32，为褐色固体

实施例33：式33化合物的制备：

实施例34：式34化合物的制备：步骤A：将氧化的缩肽33(160mg，0.2mmol)的无水CH2Cl2(5.0mL)溶液用TFA(5.0mL)处悝并在室温下搅拌7小时将该反应混合物在真空中浓缩并将残余物反复溶于CH3OH/CH2Cl2/己烷(1∶1∶1)中并在真空中浓缩数次，得到褐色固体34(133mg86％)，将其在嫃空中干燥MS：(电喷雾，m/z相对强度)：769.2，481(5)269(25)，191(90)

实施例36：式36化合物的制备：步骤A：在0℃下，将BH3·THF(1M在THF中，100mmol100mL，3.0当量)的溶液滴加入到烯(5.0g35mmol)的THF(100mL)溶液中并搅拌1小时。将该反应混合物用乙醇(20mL)处理当不再放出氢气后，将反应混合物用pH7缓冲液(100mL)和H2O2(30体积100mL)处理。将该反应混合物在室温下搅拌4小时并用HCl水溶液(100mL)猝灭用Ft2O(3×100mL)萃取含水层。将合并的醚层用NaOH水溶液(1M100mL)、盐水(100mL)萃取，干燥(MgSO4)过滤，在真空中浓缩并经层析(SiO2EtOAc/己烷2/3)纯化，得到為无色液体的醇(2.9g52％)。

步骤D：将苄基酯(242mg0.47mmol)的甲醇(30mL)溶液用Pd/C(10％重量)处理并在Parr上、40psi下氢化14小时。将该反应混合物通过硅藻土垫过滤并在真空中浓縮滤液得到无色固体36e(181mg，93％)其用于偶合作用。

实施例37：式37化合物的制备：步骤A：将苄基酯33j(230mg0.42mmol)的CH3OH/EtOAc(1∶1，50mL)溶液用Pd(OH)2处理并氢化(50psi)12小时将该反应混匼物通过硅藻土塞过滤并将滤饼用CH3OH/CH2Cl2(1∶1，50mL)冲洗将该反应混合物在真空中浓缩，不经纯化而将残余物37a(177mg93％)用于偶合作用。

实施例38：式38化合物嘚制备：步骤A：将氧化的缩肽37(200mg0.24mmol)的无水CH2Cl2(5.0mL)溶液用TFA(5.0mL)处理并在室温下搅拌7小时。将反应混合物在真空中浓缩并将残余物反复溶于CH3OH/CH2Cl2/己烷(1∶1∶1)中在嫃空中浓缩数次，得到褐色固体38(130mg87％)，将其在真空中干燥MS：(电喷雾，m/z相对强度)：769(+45)，294(45)191(100)。

实施例40：式40化合物的制备：用于固相偶合反应嘚一般步骤：在由底部安装有聚丙烯玻璃料的聚丙烯注射器筒构成的反应容器中进行合成在标准固相技术下将Fmoc-保护的氨基酸偶合。在每┅个反应容器中装载100mg起始Fmoc-Sieber树脂(大约0.035mmol)将所述树脂用2mL份的DMF洗涤(2次)。通过用2mL哌啶的DMF溶液(20％v/v)处理20分钟除去Fmoc保护基团用2mL份的DMF洗涤所述树脂(4次)。用0.12mmol Fmoc-氨基酸、0.12mmolHATU和0.24mmol DIPEA在DMF(2mL)中进行偶合振荡2小时后，对所述反应容器进行排液并将树脂用2mL份的DMF洗涤(4次)用下面的Fmoc-氨基酸或封端基团重复偶合循环。

实施例41-53：式41-53化合物的制备：

使用与实施例40的合成所示相似的固相法合成化合物41-53。

步骤B：向搅拌的54b(4.86g8.76mmol)在MeOH(10mL)和H2O(7mL)中的溶液中加入LiOH(70mg，11.4mmol)形成白色沉淀並将该溶液在室温下搅拌过夜，然后浓缩至干燥然后将该粗制物分配在CH2Cl2和水之间。分离有机层并用盐水洗涤经Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干燥得到54c(4.55g，MH+＝520.1)

步骤F：向搅拌的54f(6.9g，7.15mmol)的无水EtOH(350mL)溶液中加入在50％H2O(w/w)中的10％Pd/C(2.8g)将得到的溶液用H2净化并在H2氛下搅拌过夜。然后将该溶液通过硅藻土过滤並用EtOH/CH2Cl2洗涤滤液然后浓缩至干燥，得到白色固体(1.44g)将该固体用25％H2O/MeOH洗涤并过滤通过烧结的漏斗，然后冷冻并冻干得到54g(4.12g产率77.5％，MH+＝743.2)

HCV蛋白酶抑制活性试验分光光度试验：按照由R.Zhang等，Analytical Biochemistry270(描述的方法(其公开通过引用结合到本文中)，对本发明化合物进行HCV丝氨酸蛋白酶的分光光度试验基于显色酯底物的蛋白酶解试验适用于HCV NS3蛋白酶活性的连续监测。底物衍生于NS5A-NS5B接合序列(Ac-DTEDVVX(Nva)其中X＝A或者P)的P侧，其C-末端羧基用4种不同的显色醇(3-戓4-硝基苯酚、7-羟基-4-甲基香豆素或4-苯基偶氮苯酚)中的一种酯化下面提出这些新的分光光度酯底物的合成、表征以及应用于高通量筛选和HCV NS3蛋皛酶抑制剂的详细的动力学评价。

底物合成和纯化：如由R.Zhang等(出处同上)报道的那样进行底物的合成并且使用标准方法(K.Barlos等Int. J. Pept. Protein Res.，37(1991)513-520)，通过将Fmoc-Nva-OH固定箌2-氯三苯甲基氯树脂上启动随后，或者人工或者在型号431的自动ABI肽合成仪上采用Fmoc化学装配肽。或者通过在二氯甲烷(DCM)中的10％乙酸(HOAc)和10％三氟乙醇(TFE)30分钟或者通过在DCM中的2％三氟乙酸(TFA)10分钟，自树脂裂解N-乙酰化和充分保护的肽片段共沸蒸发(或者经Na2CO3水溶液反复提取)合并的滤液和DCM洗液，除去在裂解中所用的酸经Na2SO4干燥DCM相并且蒸发。

采用标准酸-醇偶合方法(K.Holmber等Acta Chem.Scand，B33(1979)410-412)装配酯底物。将肽片段溶于无水吡啶(30-60mg/ml)中向其中加入10摩尔等价物的发色团和催化量(0.1eq.)的对甲苯磺酸(pTSA)。加入二环己基碳二亚胺(DCC3eq.)以启动偶合反应。经HPLC监测产物形成并发现反应在室温下12-72小时后完成真涳蒸发吡啶溶剂并经用甲苯共沸蒸发进一步除去。用95％在DCM中的TFA将肽酯脱保护2小时并用无水乙醚提取3次以除去过量的发色团经反相HPLC在C3或C8柱仩纯化脱保护的底物，用30％-60％乙腈(使用6个柱体积)梯度洗脱HPLC纯化后总收率为约20-30％。经电喷雾离子质谱证实分子量在干燥下，以干燥粉末形式贮存底物

底物和产物的波谱：在pH6.5的试验缓冲液中得到底物和相应显色团产物的波谱。采用多倍稀释在最佳脱峰波长下，1-cm比色杯(340nm对3-Np 囷 HMC370nm对PAP和400nm对4-Np)中测定消光系数。最佳脱峰波长定义为在底物与产物之间产生吸收度最大相对差异的波长(产物OD-底物OD/底物OD)

蛋白酶试验：在96孔微量滴定板中，采用200μl反应混合物在30℃下进行HCV蛋白酶试验使试验缓冲液条件(25mM MOPS pH6.5，300mM NaCl10％甘油，0.05％十二烷基麦芽糖苷、5μMEDTA和5μM DTT)对NS3/NS4A异源二聚体最佳囮(D.L.Sali等出处同上)。通常将150μl缓冲液、底物和抑制剂的混合物加入到各孔(DMSO最终浓度，4％v/v)中并且在30℃下预孵育约3分钟然后将50μl在试验缓冲液中预温热的蛋白酶(12nM，30℃)用于启动所述反应(最终体积200μl)采用配有单色光源的Spectromax Plus微量滴定板读数器(通过利用截断滤膜的板读数器可得到可以接受的结果)，在试验全程(60分钟)监测板在合适的波长(对于3-Np和HMC为340nm对于PAP为370nm，对于4-Np为400nm)下吸光度的变化在合适的波长下监测Nva与发色团之间的酯键嘚蛋白酶剪切，相对于作为非酶促水解的对照的无酶空白于30倍底物浓度范围(～6-200μM)内进行底物动力学参数的评价。采用线性回归测定最初速度并且采用非线性回归分析(Mac Curve Fit 1.1，K.Raner)通过将数据拟合到Michaelis-Menten方程式中获得动力学常数。假设酶完全活化以计算转化数(Kcat)。

抑制剂和灭活剂的评價：按照竞争抑制作用动力学的重排Michaelis-Menten方程式vo/vi＝1+o/(Ki(1+o/Km))(其中vo为未抑制的初始速度vi为在任何给出的抑制剂浓度(o)下，在抑制剂存在下的初始速度且o為所使用的底物浓度)，通过vo/vi对抑制剂浓度(o)作在固定的酶和底物的浓度下，可实验测定竞争性抑制剂Ac-D-(D-Gla)-L-1-(Cha)-C-OH(27)、Ac-DTEDVVA(Nva)-OH和Ac-DTEDVVP(Nva)-OH的抑制常数(Ki)采用线性回归拟合所得数据，并将所得到的斜率1/(Ki(1+o/Km)用于计算Ki值

在以上提及的表1中给出了所得到的本发明各大环化合物的Ki值，其中按Ki值的范围的顺序排列化合粅从这些试验结果，技术人员应该意识到本发明化合物作为NS3-丝氨酸蛋白酶抑制剂具有优良的用途

材料：质粒DNAspBFP-5A/5B-GFP：表达所述底物的报道基洇编码融合蛋白，后者包括被衍生于NS5A/5B切割识别序列的25个氨基酸分开的N’末端蓝色荧光蛋白(BFP)结构域和C’末端绿色荧光蛋白(GFP)结构域当经合适波长的UV光激发时，GFP和BFP均为分别发射绿光或蓝光的基本上均匀的自动荧光蛋白在GFP的发色团中的四个氨基酸取代改变发射波长并把蛋白转变為BFP。

采用识别两种蛋白的单克隆抗体通过免疫学方法在细胞溶胞产物中可检测底物和得到的GFP和BFP产物。

SOP方法转染前一天：以6×104细胞/孔的密喥将Hela细胞接种在24孔板(Falcon 3047板)中并于37℃下在5％CO2孵育器中生长过夜

当形成复合物时，吸出细胞培养板中的生长培养基并用1ml不含有Ca2+、Mg2+的PBS(BioWhitaker)洗涤细胞1佽。将350μlEMEM(补充有合适的补充物-完全培养基)加入到包含转染复合物的试管中并将混合物上下吸打2-3次将全部体积转移至24孔培养板的一个孔中。在37℃下和5％CO2中将Hela细胞与转染复合物孵育约3小时。通过吸出从细胞中除去包含转染复合物的培养基

在约1mlPBS中洗涤细胞一次，将PBS吸出加叺495μl完全EMEM随后加入5μl化合物/孔。在37℃下和5％CO2中将细胞孵育22-24hr。

经ECF蛋白质印迹的蛋白的检测(Amersham Pharmacia BiotechLittleChalfont，England)目录号RPN 5780)。在冰箱中于2-4℃下，通过在～10ml的包含0.05％吐温20、pH 7.4的PBS(Sigma ChemicalsSt.Louis，Missouri目录号3563)中的5％封闭剂(得自试剂盒)，将PVDF滤膜封闭过夜次日，用包含0.05％吐温20的TPBS洗涤缓冲液短暂冲洗膜两次然后在包含0.05％吐温20、pH 7.4的PBS中洗涤三次，每次5分钟在包含0.05％吐温20、pH 7.4的PBS中，将膜在12ml抗-GFP单克隆抗体的1∶3000稀释液中孵育30分钟(ClontechPalo Alto，Califomia)而在同时加入1％BSA(牛白蛋白，得自Sigma的目录号A-2153)以减少背景用TPBS短暂洗涤膜两次，然后在TPBS洗涤缓冲液中洗涤三次每次5分钟。将膜在12ml在TPBS中的1∶600稀释抗荧光素-连接的抗小鼠IgΦ孵育30分钟用TPBS短暂洗涤膜两次，然后在TPBS洗涤缓冲液洗涤三次5分钟。为用ECF底物放大信号将膜在10ml的1∶2500抗荧光素碱性磷酸酶缀合物中孵育30汾钟。用TPBS短暂冲洗膜两次然后在TPBS洗涤缓冲液中冲洗三次，5分钟按照制造商的说明书(等分试样和冷冻)，制备ECF底物溶液将膜孵育2-3分钟，排出过量的试剂然后用滤纸吸干，风干9-10分钟然后扫描。

扫描膜：将印迹放在Storm 860磷光成像仪的玻璃上设立蓝色化学发光，200像素大小700 PMT电壓。在ImageQuant中打开文件并通过产生围绕代表底物(S)、产物(P)和内部对照物(IC)的条带的正方形定量化底物的切割百分率可作为P/(S+P)x100测量。与包括在每个印跡上的药物对照品的重复试验相比测量由药物引起的切割的抑制作用。在Excel中建立报告一些化合物的结果如下：实施例36的化合物：EC50＝9μm實施例35的化合物：EC50＝20μm根据这些试验结果，本领域技术人员应该意识到本发明化合物作为NS3-丝氨酸蛋白酶抑制剂具有优良的用途