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荧光原位杂交技术
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荧光原位杂交技术作者：贝蒂&（Beatty&Barbara），王瑛，张诗武&著出版社：天津科技翻译出版公司出版时间：本书介绍了FISH技术的概括以及由其派生和发展的多色FISH（mFISH），比较基因组杂交（CGH）等技术及应用领域；阐述了FISH技术在各种具体实例上的应用
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学兔兔 - 工程技术交流与学习网站！荧光原位杂交技术操作的常见问题分析--《临床与实验病理学杂志》2015年12期
荧光原位杂交技术操作的常见问题分析
【摘要】：正目前,荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization,FISH)因具有灵敏度高、特异性强、定位明确及结果客观等优点[1],在临床上已应用于产前染色体数目检测、肿瘤基因检测,如多发性骨髓瘤检测和慢性淋巴细胞性白血病等的检测,担负着辅助病理诊断和指导临床用药的重任。日常病理诊断中,应用FISH技术检测乳腺癌HER-2和TOP2A基因扩增,可以判断预后,指导靶向治疗和辅助化疗;在非小细
【作者单位】：
【关键词】：
【基金】：
【分类号】：R440【正文快照】：
目前,荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridiza-tion,FISH)因具有灵敏度高、特异性强、定位明确及结果客观等优点[1],在临床上已应用于产前染色体数目检测、肿瘤基因检测,如多发性骨髓瘤检测和慢性淋巴细胞性白血病等的检测,担负着辅助病理诊断和指导临床用药的重任
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实验方法原理
荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。
杂交所用的探针大致可以分类三类：1）染色体特异重复序列探针，例如α卫星、卫星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测；2）全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3）特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。
探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。间接标记是采用生物素标记DNA探针，杂交之后用藕联有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同时还可以利用亲和素-生物素-荧光素复合物，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp的片段。而直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸或磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三磷酸掺入。直接标记法在检测时步骤简单，但由于不能进行信号放大，因此灵敏度不如间接标记的方法。
试剂、试剂盒
仪器、耗材
一、实验材料准备
实验用具及材料
相关溶液的配制
（1）20×SSC：175.3 g NaCl，88.2 g柠檬酸钠，加水至1 000 mL（用10 mol/L NaOH调pH 至7.0）。
（2）去离子甲酰胺（DF）：将10 g混合床离子交换树脂加入100 mL甲酰胺中。电磁搅拌30 min，用Whatman l号滤纸滤。
（3）体积分数70%甲酰胺/2×SSC：35 mL甲酰胺，5 mL 20×SSC，10 mL水。
（4）体积分数50%甲酰胺/2×SSC：100 mL甲酰胺，20 mL 20×SSC，80 mL水。
（5）体积分数50%硫酸葡聚糖（DS）：65℃水浴中融化，4℃或-20℃保存。
（6）杂交液：8 μL体积分数25%DS，20 μL 20×SSC混合。（或40 μL体积分数50% DS，20 μL 20×SSC，40 μL ddH2O混合）取上述混合液50 μL，与5 μL DF混合即成。其终浓度为体积分数10% DS，2×SSC，体积分数50% DF。
（7）PI/antifade溶液
PI原液：先以双蒸水配置溶液，浓度为100 μg/mL，取出1 mL，加39 mL双蒸水，使终浓度为2.5 μg/mL。Antifade原液：以PBS缓冲液配制该溶液，使其浓度为10 mg/mL，用0.5 mmol/L的NaHCO3调pH值为8.0。取上述溶液1 mL，加9 mL甘油，混匀。
PI/antifade溶液：PI与antifade原液按体积比1:9比例充分混匀，－20℃保存备用。
（8）DAPI/antifade溶液：用去离子水配制1mL/mg DAPI储存液，按体积比1:300，以antifade溶液稀释成工作液。
（9）封闭液I：体积分数5% BSA 3 mL，20×SSC 1 mL，ddH2O 1mL，Tween20 5 μL混合。
（10）封闭液II：体积分数5%
BSA 3mL，20×SSC 1mL，goat serum 250 μL，ddH2O 750 μL，Tween20 5 μL混合。
（11）荧光检测试剂稀释液：体积分数5%
BSA 1mL，20×SSC 1mL，ddH2O 3mL，Tween20 5μL混合。
（12）洗脱液：100 mL 20×SSC，加水至500 mL，加Tween20 500 μL。
二、实验方法及步骤
将探针在75℃恒温水浴中温育5 min，立即置0℃，5～10 min，使双链DNA探针变性。
（1）将制备好的染色体玻片标本于50℃培养箱中烤片2～3 h。（经Giemsa染色的标本需预先在固定液中退色后再烤片）。
（2）取出玻片标本，将其浸在70～75℃的体积分数70% 甲酰胺/2×SSC的变性液中变性2～3 min。
（3）立即按顺序将标本经体积分数70%、体积分数90%和体积分数100%冰乙醇系列脱水，每次5 min，然后空气干燥。
将已变性或预退火的DNA探针10 μL 滴于已变性并脱水的玻片标本上，盖上18×18盖玻片，用Parafilm封片，置于潮湿暗盒中37℃杂交过夜（约15～17 h）。由于杂交液较少，而且杂交温度较高，持续时间又长，因此为了保持标本的湿润状态，此过程在湿盒中进行。
此步骤有助于除去非特异性结合的探针，从而降低本底。
（1） 杂交次日，将标本从37℃温箱中取出，用刀片轻轻将盖玻片揭掉。
（2） 将已杂交的玻片标本放置于已预热42～50℃的体积分数50%甲酰胺/2×SSC中洗涤3次，每次5 min。
（3） 在已预热42～50℃的1×SSC中洗涤3次，每次5 min。
（4） 在室温下，将玻片标本于2×SSC中轻洗一下。
（5） 取出玻片，自然干燥。
（6） 取200 μL复染溶液（PI/antifade或DAPI/antifade染液）滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。
杂交信号的放大（适用于使用生物素标记的探针）
（1） 在玻片的杂交部位加150 μL封闭液I，用保鲜膜覆盖，37℃温育20min。
（2） 去掉保鲜膜，再加150 μL avidin-FITC于标本上，用保鲜膜覆盖，37℃继续温育40 min。
（3） 取出标本，将其放入已预热42～50℃的洗脱液中洗涤3次，每次5 min。
（4） 在玻片标本的杂交部位加150 μL封闭液II，覆盖保鲜膜，37℃温育20 min。
（5） 去掉保鲜膜，加150 μL antiavidin于标本上，覆盖新的保鲜膜，37℃温育40 min。
（6） 取出标本，将其放入已预热42～50℃的新洗脱液中，洗涤3次，每次5 min。
（7） 重复步骤（1）、（2）、（3），再于2×SSC中室温清洗一下。
（8） 取出玻片，自然干燥。
（9） 取200 μL PI/antifade染液滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。
可采用不同类型的封片液。如果封片液中不含有Mowiol（可使封片液产生自封闭作用），为防止盖片与载片之间的溶液挥发，可使用指甲油将盖片周围封闭。封好的玻片标本可以在-20～-70℃的冰箱中的暗盒中保持数月之久。
荧光显微镜观察FISH结果
先在可见光源下找到具有细胞分裂相的视野，然后打开荧光激发光源，FITC的激发波长为490 nm。细胞被PI染成红色，而经FITC标记的探针所在的位置发出绿色荧光。
所用不同荧光材料的激发光和发射光波长及滤光镜选择
试剂、试剂盒
仪器、耗材
石蜡切片或细胞的杂交：按“”的基本方案步骤1~7，对载玻片进行脱蜡、水化、 封闭和脱水处理。将标本晾干（或在干燥器中干燥），随后贮于加有干燥剂的载玻片盒中，置-70℃过夜。
冰冻切片的杂交：按“”的备择方案步骤1~7，进行切片的预处理和乙酰化处理， 随后进行切片的脱水。
对每一杂交实验，可用乙醇沉淀10~15 ng 探针，重溶于10 ml 去离子的甲酰胺中，加5 μg（0.5 μl）超声处理的鲑精DNA，在70~80℃温度下热变性探针10 min。
加10 μl 主杂交混合液于变性探针中（探针终浓度为0.1~0.5 μg/μl 混匀），微量离心机以高速稍加离心，然后加于载玻片上。覆加22 mm2 盖玻片，轻压以赶去大的气泡。放入加湿盒中，在37℃温育2~4 h。
杂交最后30 min 期间，以37℃水浴，在Coplin 广口瓶中，预热50 ml 50%甲酰胺/2×SSC洗液和50 ml 2×SSC。
从加湿盒中取出载玻片，剥去橡皮泥（如有使用的话）并小心移去盖玻片。在37℃ 50%甲酰胺/2×SSC中，清冼杂交过的玻片15 min；接着以37℃2×SSC洗15 min；再于室温以1×SSC洗15 min。
玻片在室温下，以4×SSC平衡5 min。取出载玻片吸去残余缓冲液，在此过程中任何时候都不要使玻片干涸。
加50 μl 生物素检测液，地髙辛检测液或生物素/地高辛检测液于杂交过的载玻片上。用22 mm2 的Parafilm 膜覆盖，放在一用铝箔包裹的加湿盒中，于37℃温育45 min。
室温下，按顺序在裹以铝箔的Coplin 广口瓶中，分别用4×SSC、0.1%Triton X-100/4×SSC和4×SSC浸洗切片。毎种溶液中浸洗10 min。
加50 μl DAPI 或碘化丙锭染色液于切片上，以一块22 mm2 的Parafilm 膜覆盖。室温下染色5 min。在盛有1×SSC的Coplin 广口瓶中快速浸洗，以除去多余染液。吸去残液但不要使切片干涸。
加7 μl 适当的防褪色固片介质于已染色的切片上，覆以盖玻片。轻轻挤压除去多余的防褪色固片介质，注意勿损伤组织切片。以指甲油密封盖玻片，放在有干燥剂的玻片盒中，贮于-20℃。
用具落射光源，以及有适合实验中所用荧光染料的滤光片的荧光显微镜，观察实验结果。
用Ektar-1000或Ektachrome-400彩色感光片照相。
最新实验心得
(共3个心得)
FISH是对设备和经验要求很高的技术，尽管做现在人们已经做的很多，但是能够达到很好的检测结果，还是不多的。各方面的影响因素很多，还是需要经验的。
发表于 07:04
将自己的一些感受说出来与大家分享，主要是FISH的特点以及FISH的一些关键步骤需要注意的。
原位荧光杂交（FISH）主要试剂以及操作步骤简介。
发表于 00:17
(共7个问题)
相关实验Protocol
谁能提供实验帮助？
谁做这个实验？
还在学习阶段，这个对我还是挺有帮助的。
订探针就累觉不爱了
实验步骤比较多，烦杂
需要很大耐心
实验还可以。
谁关注这个实验？
丁香通采购热线：400-
Copyright (C)
DXY All Rights Reserved.荧光原位杂交（FISH）的实验步骤
来源:上海远慕生物科技有限公司
浏览人数: 1072
荧光原位杂交（FISH）的实验步骤
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&Yuanmu
0.05%SDS（&L）
50mMTri-HCl（&L）
5mol&NaCl（mL）
甲酰胺（mL）
蒸馏水（mL）
Ntspa662&NSO1225&Nmv
表1-2&淋洗缓冲液（Washing&Buffer）
50m&MTri-HCl
（a）吸取2mL杂交缓冲液遍布在杂交盒内折好的吸水纸上，将已固定好样品的载玻片放入杂交管中，然后在46℃杂交炉中放置数分钟。
（b）吸取10&L探针贮存液和80&L杂交缓冲液混合后，用箔纸包好放入46℃杂交炉中
预热数分钟；探针贮存液浓度为25ng/&L，用无菌水稀释购买的探针，实验用的探针序列及杂交条件见表1-3所示。
表1-3用于检测样品中AOX、NOX的寡核苷酸探针及杂交条件
探针序列(5&～3&)
标记细菌种属
CGCCATTGTATTACGTGTGA
Ammonia&oxidizing&beta-proteobacteria
CCGTGACCGTTTCGTTCCG
Nitroso-spira,&-lobus,&-vibrio
TCCTCAGAGACTACGCGG
Nitroso-coccus
GGAATTCCGCGCTCCTCT
Nitrospira
CCTGGCTCCATGCTCCG
Nitrobacter
CGGTGCGAGCTTGCAAGC
Nitrococcus&mobilis
TTCCCAATATCAACGCATT
Nitrospina&gracilis
（a）&表示杂交缓冲液中去离子甲酰胺浓度（%）
（c）吸取9&L预热后的探针稀释液涂于载玻片待测样品上，然后将载玻片迅速地移回杂交管中于46℃下进行杂交（黑暗中进行），杂交时间为2～3h；
（d）杂交后的洗脱：打开恒温水浴槽，加热到48℃，对杂交缓冲液、淋洗缓冲液进行预热。杂交盒中取出载玻片用杂交缓冲液冲洗样品后，快速放入淋洗缓冲液，48℃水浴20min后用4℃冰水，冲洗样品，样品洁净台中挥干。
&&&&每孔滴9uLDAPI，4℃暗处5min，4℃冰水（BPS缓冲溶液）冲洗，挥干。用带有360&nm激发波长，460nm发射波长的滤光片的荧光显微镜观察细胞。DAPI（4，6-diamido-2-phenylindole）染色用于全细胞计数。
&&&&涂封片剂，盖盖玻片，无气泡后指甲油封装。
荧光显微镜进行检测
&&&&每个样品及每个探针都采集20个不同区域。每个区域中的细胞个数要超过1000个，然后进行平均以获得每个探针对于每个样品的杂交结果。细菌丰度或细菌数&目（cells/g或cells/L）为AS1/(S2V)，其中A为视野中细菌平均数；S1为样品涂抹面积；S2为视野涂抹面积；V为样品体积。
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