NF-κB特异的RNAi腺病毒载体的构建及其对血管内皮细胞增殖凋亡的影响--《2008中国医师协会内分泌代谢科医师分会年会论文汇编》2008年
NF-κB特异的RNAi腺病毒载体的构建及其对血管内皮细胞增殖凋亡的影响
【摘要】：目的:构建针对NF-κB p65基因的RNAi腺病毒表达载体,从转录后水平抑制p65基因表达,为研究NF-κB信号通路提供技术工具;并利用构建的RNAi腺病毒感染血管内皮细胞,抑制p65表达,观察NF-κB信号通路对血管内皮细胞增殖和凋亡的影响。方法:设计合成三对针对p65 mRNA不同位点的shRNA编码序列,克隆到腺病毒穿梭质粒中,然后通过体外同源重组构建重组RNAi腺病毒表达载体;在HEK293A细胞中包装并扩增病毒、空斑实验法进行病毒滴度测定,获得高滴度的病毒上清;腺病毒感染血管内皮细胞ECV304,Western Blot和免疫细胞化学法检测构建的RNAi腺病毒对p65表达的抑制效果,并探讨不同的感染复数(MOI值)及病毒感染后不同时间对p65抑制效应的差别;利用RNAi腺病毒抑制p65表达,探讨NF-κB信号通路对ECV304细胞增殖和凋亡的影响。结果:1.成功构建了针对p65基因三个不同位点的RNAi腺病毒表达载体,经PCR和测序鉴定干扰片段的碱基序列及插入位点完全正确;2.在HEK293A细胞中包装、扩增腺病毒,获得高滴度腺病毒上清;测定扩增第二代的病毒液滴度在3.0×109pfu~2.5×1010pfu之间,可满足后续实验需要;3.构建的三个RNAi腺病毒感染ECV304细胞后均可使p65表达量明显下降,RNAi腺病毒MOI值15~25即可以实现对ECV304细胞p65表达的有效抑制;4.RNAi腺病毒感染ECV304细胞后48h开始检测到p65表达量下降,且随时间延长p65表达量进一步减少,抑制效应可持续六天以上;5.腺病毒感染ECV304细胞3d、5d、7d后MTT检测,RNAi腺病毒组与空病毒组相比,细胞增殖率明显下降(p0.05或p0.01);但流式细胞检测结果提示对ECV304细胞凋亡的影响不明显。结论:构建NF-κB p65特异的RNAi腺病毒表达载体能有效抑制p65基因的表达,可以作为研究NF-κB信号通路的重要技术手段;NF-κB信号通路对正常条件下血管内皮细胞ECV304的增殖有重要影响。
【作者单位】：
【分类号】：R3416【正文快照】：
NF-κB特异的RNAi腺病毒载体的构建及其对血管内皮细胞增殖凋亡的影响@陈刚$福建省立医院内分泌科!350001
@乔玉芳$福建省立医院内分泌科!350001
@林旭$福建省立医院内分泌科!350001
@林丽香$福建省立医院内分泌科!350001目的:构建针对NF-κB p65基因的RNAi腺病毒表达载
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而必须使细胞处于持续培养状态。腺病毒则能感染几乎所有的细胞类型，以人类细胞作为宿主。而腺病毒则除了卵细胞以外几乎在所有已知细胞中都不整合到染色体中。最简单的方法是将含有两个基因的双表达盒插入腺病毒转移载体中。腺病毒可感染一系列哺乳动物细胞。大多数人类蛋白都可达到高水平表达并且具有完全的功能，腺病毒被极其广泛地应用于体外基因转导、体内接种疫苗，它可以使转化细胞和原代细胞中得到的结果直接进行对比，因此在大多哺乳动物细胞和组织中均可用来表达重组蛋白，无插入致突变性
逆转录病毒可随机整合到宿主染色体，导致基因失活或激活癌基因。7，在人群中早已流行（70-80%成人体内都有腺病毒的中和抗体存在）。人类感染野生型腺病毒后仅产生轻微的自限性症状. 能有效进行增殖，滴度高
腺病毒系统可产生VP/ml。特别需要指出的是：腺病毒具有嗜上皮细胞性，而人类的大多数的肿瘤就是上皮细胞来源的。另外腺病毒载体的优点1. 宿主范围广。3;ml，这一特点使它非常适用于基因治疗。4. 与人类基因同源
腺病毒载体系统一般应用人类病毒作为载体，浓缩后可达1013VP&#47，腺病毒的复制基因和致病基因均已相当清楚。大量事实证明悬浮293细胞可在1～20L的生物反应器中表达重组蛋白，除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤细胞。腺病毒是研究原代非增殖细胞基因表达的最佳系统, 对人致病性低
腺病毒载体系统可广泛用于人类及非人类蛋白的表达，且病毒唑治疗有效。2. 在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因
逆转录病毒只能感染增殖性细胞，因此DNA转染不能在非增殖细胞中进行，因此为人类蛋白进行准确的翻译后加工和适当的折叠提供了一个理想的环境。5。在卵细胞中整合单拷贝病毒则是产生具有特定特征的转基因动物的一个较好的系统。6. 能在悬浮培养液中扩增
293细胞可以适应悬浮培养，这一调整可使病毒大量扩增. 能同时表达多个基因 这是第一个可以在同一细胞株或组织中用来设计表达多个基因的表达系统，或者用不同的重组病毒共转染目的细胞株来分别表达一个蛋白。测定不同重组病毒的MOI比值可正确估计各重组蛋白的相对共表达情况。
正是由于具有以上一些优点. 不整合到染色体中，因此不会干扰其它的宿主基因
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腺病毒载体操作手册中文版 腺病毒重组系统 AdEasyTM 操作手册 目 录第一章 简介 1 第二章 应用重组腺病毒的优点 2 第三章 AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM 系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章 主要流程 4 4.1 将基因克隆入 AdEasyTM 转移载体 4 4.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组 AdEasyTM 转移载体 5 4.2 细菌内 AdEasyTM 重组子的产生 5 4.2.1 共转化的一般原则 5 4.2.2 共转化方法 5 4.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM 重组质粒的筛选和扩增 6 4.4 AdEasyTM 重组子转染 QBI-293A 细胞 6 4.4.1 细胞铺板 6 4.4.2 磷酸钙转化技术 7 第五章 常用技术 8 5.1 QBI-293A 细胞培养 8 5.1.1 QBI-293A 细胞的初始培养 8 5.1.2 QBI-293A 细胞的维持培养和增殖 8 5.1.3 QBI-293A 细胞的冻存 8 5.2 QBI-293A 细胞的转染和病毒空斑的产生 9 5.2.1 感染 QBI-293A 细胞 9 5.2.2 病毒空斑形成 9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞 9 5.3 MOI 测定 10 5.4 腺病毒感染力测定 10 5.4.1 X-Gal 染色 11 缩写 英文全称 中文全称 Ad Adenovirus 腺病毒 Ad5 Adenovirus serotype 5 血清 5 型腺病毒 AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体 Amp Ampicillin 氨苄青霉素 β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶 bp Base Pair 碱基对 BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白 cDNA Complementary DNA 互补 DNA cccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋 DNA CPE Cytopathic Effect 细胞病理效应 CsCl Cesium Chloride 氯化铯 DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM 培养基 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化 11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送 11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增 12 5.5.3 Western 杂交 13 5.5.4 Southern 杂交和点杂交 13 5.5.5 病毒裂解产物 PCR 14 5.5.6 免疫测定 14 5.5.7 功能测定 14 5.6 病毒颗粒在 QBI-293A 细胞中的大量扩增 15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒 16 5.7.1 不连续密度梯度离心 17 5.7.2 连续密度梯度离心 17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集 17 5.8 病毒滴度测定 18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 5.8.2 空斑测定法 20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法 20 第六章 疑难解答 22 6.1 QBI-293A 细胞培养 22 6.2 感染力测定 22 6.3 转移载体克隆 23 6.4 在 BJ5183 细胞中共转化和重组 24 6.5 转染 QBI-293A 细胞 25 6.6 筛选和测定 25 6.7 在 QBI-293A 细胞中表达 26 6.8 重组腺病毒的扩增 26 6.9 纯化 26 6.10 病毒滴度测定 27DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜 DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇 EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸 EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭 FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清 Hr Hour 小时 ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复 Kan Kanamycin 卡那霉素 kb Kilobases 千碱基对 KDa KiloDaltons 千道尔顿 LB Luria-Bertani ( broth ) LB 培养基 MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点 Min Minute 分钟 MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数 mRNA Messenger RNA 信使 RNA MWCO MOIecular Weight Cut-offPAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳 PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液 PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位 pi Post Infection 感染后 RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒 RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复 SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠 TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四 乙酸 TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50%组织培养感染 剂量 TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白 TE Tris/EDTA TE 溶液 wt Wild Type 野生型 X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴 -4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章 简 介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗 体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。人类基因组计划和正不断发展的基因治疗同样急需发展快速有效和 治疗性的分析工具。为解决这一问题，基因输送技术(通常使用病毒载体如增殖缺陷的腺病毒)通过基因工程不断发展，致 力于生产基因表型药物。重组腺病毒提供了一类在基因转移系统发展中有极大潜力的新的生物治疗剂。 1953 年对普通感冒病因的探索和研究导致了腺病毒的发现。 迄今为止已发现了 40 多种不同血清型和 93 种不同种类的腺病 毒，它们通常感染眼、呼吸道或胃肠上皮（Fields 等，1996） 。1977 年，Frank Graham 博士建立了一种细胞株，可在无辅助 病毒的情况下产生重组腺病毒（Graham 等，1977） 。此后，腺病毒载体作为极具潜力的哺乳动物基因转移载体而得到广泛 应用，尤其是在基因治疗相关领域。迄今为止已有大量关于腺病毒及其应用的综述发表，我们给感兴趣的读者推荐以下文 章：Hitt et al，1999 和 Wivelet al，1999。腺病毒亦可被用来在人体细胞中过量表达蛋白（Massie et al，1998 A, B） 。但迄今 为止还只有熟知腺病毒的研究人员才会采用腺病毒系统。昆腾生物科技公司是第一个提供完备而且能广泛应用的重组腺病 毒试剂盒 Adeno-QuestTM 系统及其相关产品和客户服务的公司，这个系统的基础是在 293 细胞中产生重组腺病毒。现在介 绍的 AdEasyTM 系统以细菌内重组取代哺乳动物细胞（He et al，1998） ，使获得重组腺病毒对任何有细胞培养设备的分子 生物实验室都更方便。重组腺病毒事实上可在任何细胞或组织中用来研究表达重组蛋白。AdEasyTM 转移载体可允许插入 7.5kb 的外源 DNA，目前正研究腺病毒其它区的缺失以提高腺病毒在基因治疗中的应用。 这本手册提供了重组腺病毒技术中所有必须遵循的原则，并详细描述了产生一个重组腺病毒的所有实验步骤，包括重组腺 病毒在 QBI-293A 细胞中扩增并纯化到 1012VP 的操作步骤。 AdEasyTM 载体系统包含了生产 5 型重组腺病毒所需的全部试 剂，所有成分购买后即可使用。第二章 应用重组腺病毒的优点1. 宿主范围广, 对人致病性低 这套腺病毒载体系统可广泛用于人类及非人类蛋白的表达。腺病毒可感染一系列哺乳动物细胞，因此在大多哺乳动物细胞 和组织中均可用来表达重组蛋白。 2. 在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因 逆转录病毒只能感染增殖性细胞，因此 DNA 转染不能在非增殖细胞中进行，而必须使细胞处于持续培养状态。腺病毒则 能感染几乎所有的细胞类型，除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤细胞。腺病毒是研究原代非增殖细胞基因表达的最佳系统， 它可以使转化细胞和原代细胞中得到的结果直接进行对比。 3. 能有效进行增殖，滴度高 这套腺病毒系统可产生 1010 到 1011VP/ml，浓缩后可达 1013VP/ml，这一特点使它非常适用于基因治疗。4. 无需辅助病毒，可容纳 7.5 kb 外源 DNA： 5. 与人类基因同源为提供克隆空间，此腺病毒缺失了 E1 和 E3 早期区。此外，此腺病毒可包装比正常病毒 DNA 稍大的 DNA 分子（105%） 。这些特点允许插入腺病毒的基因或多基因表达盒可达 7.5kb。 该腺病毒载体系统应用了人类病毒作为载体，以人类细胞作为宿主，因此为人类蛋白进行准确的翻译后加工和适当的折叠 提供了一个理想的环境。大多数人类蛋白都可达到高水平表达并且具有完全的功能。 6. 不整合到染色体中，无插入致突变性 逆转录病毒可随机整合到宿主染色体，导致基因失活或激活癌基因。而腺病毒则除了卵细胞以外几乎在所有已知细胞中都 不整合到染色体中，因此不会干扰其它的宿主基因。在卵细胞中整合单拷贝病毒则是产生具有特定特征的转基因动物的一 个较好的系统。 7. 能在悬浮培养液中扩增： 293 细胞可以适应悬浮培养，这一调整可使病毒大量扩增。大量事实证明悬浮 293 细胞可在 1~20L 的生物反应器中表达重组蛋白。 8. 能同时表达多个基因 这是第一个可以在同一细胞株或组织中用来设计表达多个基因的表达系统。最简单的方法是将含有两个基因的双表达盒插 入腺病毒转移载体中， 或者用不同的重组病毒共转染目的细胞株来分别表达一个蛋白。 测定不同重组病毒的 MOI 比值可正 确估计各重组蛋白的相对共表达情况。第三章 AdEasyTM 技术3.1 技术概览 AdEasyTM 系统是由 T.C.He 等（1998）构建的用来代替传统腺病毒重组系统的一个快捷系统。在这个系统中，只需二步即 可产生重组腺病毒：先将表达盒装入转移载体，然后再通过同源重组插入腺病毒基因组。将外源基因插入腺病毒的最有效 途径是通过同源重组， 原因是： 腺病毒 DNA 是大型的线性分子， 1） 含有几乎所有的内切酶切位点； 基因组过大 2） （36kb） ， 难于操作。 在 AdEasyTM 载体系统中，含有大部分腺病毒基因组的载体为超螺旋质粒，而不是线性 DNA，同源重组则在大肠杆菌进 行。相对于传统系统而言，这二点改进使病毒 DNA 操作更容易，同时由于利用了大肠杆菌的高效率同源重组特性而使重 组载体的筛选更为简单。在本系统中，首先将基因 cDNA 插入一个转移载体，将得到的质粒用 PmeI 线性化，然后在大肠 杆菌 BJ5183 中与病毒 DNA 质粒 pAdEasy-1 进行同源重组。pAdEasy-1 缺失了 E1 和 E3 区，其 E1 区功能将在 293A 细胞 中得到互补。重组子通过卡那霉素筛选，用内切酶进行鉴定分析。最后将得到的重组腺病毒用 PmeI 线性化，暴露其反向 末端重复序列（ITR，Iaverted Termined Repeats） ，转染 QBI-293A 细胞后产生重组病毒颗粒。 同源重组在线性化的转移载体和完整的超螺旋腺病毒质粒之间进行。应用完整的腺病毒质粒而不用内切酶进行线性化，对 于产生重组腺病毒至关重要。转移载体中的卡那霉素抗性基因则可用来筛选重组子。由于线性化的转移载体产生卡那霉素 抗性克隆的背景较低，因此此同源重组系统有较高的信噪比。大肠杆菌 BJ5183 有 recA 活性，但同时缺失介导细菌重组的 其它酶，具有高效的转化和重组能力。一旦重组子经确定，则可转入普通的无 recA、endA 活性的细菌株如 DH5α 等进行 扩增。由于缺乏 recA 活性，DH5α 不能用于腺病毒的同源重组。 3.2 Ad EasyTM 系统中产生重组腺病毒的时程 与传统系统相比，AdEasyTM 系统中筛选和纯化腺病毒所需的时间大大缩短了。克隆和筛选约需 1-3 周，重组后需验证重 组病毒质粒是否含有目的基因。重组子在 DH5α 中扩增后转入哺乳动物细胞 293A，最后将 293A 细胞中产生的重组病毒颗 粒进行纯化和滴定。最终得到的重组腺病毒只能在提供 E1 区功能的 293A 细胞中进行增殖。 一般来说，用传统方法产生重组腺病毒并不需要大量工作，每天只需 1 小时进行细胞传代和观察空斑形成。但由于病毒空 斑形成速度慢，整个过程就需要很长时间。而 AdEasyTM 载体系统用大肠杆菌产生重组病毒，大大缩短了所需时间。 我们强烈建议初学者用 QBI-Infect＋阳性对照进行感染力测定（见 5.2.2） 。进行这些测定之前，必须先扩增 QBI-293A 细胞 （见 5.5.1） 。感染力测定使你能观察到病毒增殖导致的细胞表型的改变，获知你所用细胞对腺病毒的敏感性，而病毒空斑 测定可让你观察到病毒空斑的形成。第四章 主要流程4.1 将基因克隆入 AdEasyTM 转移载体 AdEasyTM 系统中有 2 种转移载体可供进行重组腺病毒构建： pShuttle 和 pShuttle-CMV， 2 个载体都含有多克隆位点 这 （MCS） 供插入基因。pShuttle 不含有启动子和多聚腺苷酸位点（polyA） ，允许插入含特定启动子和 polyA 位点的表达盒。 pShuttle-CMV 含有单拷贝 CMV 启动子和 polyA 位点供基础表达和高表达重组蛋白，你只需将目的基因插入 pShuttle-CMV 的多克隆位点。表 1 提供了各转移载体的特性。表 1 AdEasyTM 转移载体特性 载体名称 克隆能力 启动子 polyA 位点 克隆位点 线性化位点 说明 pShuttle 7.5kb ― ― MCS 共转化位点 PmeI（ECoRI） 转染位点（PacI） 将完整的表达盒装入多克隆位点（MCS） pShuttle-CMV 6.6kb CMV + MCS 共转化位点 PmeI（ECoRI） 转染位点（PacI） CMV 启动子能在大多数哺乳动物细胞中高效表达蛋白 4.1.1 克隆的一般原则 AdEasyTM 转移载体的特殊设计使其极易在克隆中应用，但在设计克隆策略时应考虑以下因素： 1） 在 BJ5183 中进行共转化之前必须将转化载体线性化。确证表 1 中所列的线性化位点不存在于插入的基因中。注意： 在 pShuttle 中用 EcoRI 线性化时，需要用 RecA 辅助的限制性内切酶进行酶切。如果插入基因含有所有线性化酶切位点， 那么必须进行定向突变。 2） 重组腺病毒质粒在转染 QBI-293A 细胞之前也必须用 PacI 进行线性化。同样，插入基因中不能含有 PacI 位点，如果有 则必须进行定向突变。 3） 克隆能力是指质粒载体能够克隆并且不影响病毒增殖能力的插入基因的最大长度。各转移载体的克隆能力见表 1，建 议插入基因的长度最好不超过它的上限。在 pShuttle 和 pShuttle-CMV 中分别插入大于 7.5kb 和 6.6kb 的基因将大大降低整 个系统的效率。尽管也可能得到重组子，但可能会发生 DNA 重排，生长速度也将减慢。 4） 如果要插入多个表达盒，应避免以头对头方向插入相同的元件（如 CMV 启动子） ，否则同源重组时两个元件之间的部 分可能会发生丢失。 5） 在进行构建腺病毒之前最好测定重组蛋白的暂时性表达。这里没有提供详细的操作方法，但在 CMV 或其它强力启动 子控制下的基因很容易进行暂时性表达实验。但某些启动子控制下的蛋白表达水平在无病毒增殖时可能不足以达到检测水 平。 6） 载体 DNA 可用氯化铯溴化乙锭平衡密度梯度离心或亲和柱法进行纯化。我们不主张用小量粗制的 DNA 进行转化和转 染实验，因为污染的 DNA 将大大降低菌落和空斑的形成数。 4.1.2 构建重组 AdEasyTM 转移载体 构建重组 AdEasyTM 转移载体的一般指导如下，但我们建议对于详细的克隆技术和操作方法还需参考通用的分子生物学手 册。 1． 若 cDNA 含有位置正确的粘性内切酶位点，则可将它直接克隆入转移载体。如果没有，可以使用钝末端内切酶位点， 也可用含合适的酶切位点的引物进行 PCR 或连接含有酶切位点的接头使 cDNA 产生新的酶切位点。PCR 插入酶切位点的 方法较快速，但对于长 cDNA 则应使用连接接头，因为在扩增过程中 Taq 酶可能会使序列的某些位点发生突变。 2． 插入基因的鉴定可以用限制性内切酶分析或 PCR 的方法。 3． 转化之前用 PmeI 或 EcoRI 将转移载体重组子线性化，消化应尽可能彻底，以减少背景信号。 4． 琼脂糖凝胶上观察消化产物，若消化已完全，放入 65℃ 20 分钟进行灭活。 5． 凝胶纯化线性化载体。尽管胶纯化可能会降低转化效率，但不完全消化往往产生较高的背景，从而降低重组率。将线 性化质粒去磷酸化也有助于降低背景信号。 6． 重悬纯化的 DNA，浓度至少为 0.2ug/ul。每个转化实验取 1ug 进行，包括对照。 4.2 细菌内 AdEasyTM 重组子的产生 4.2.1 共转染的一般原则 1） 将线性化转移载体和 pAdEasyTM-1 DNA 共转化 BJ5183 必须要用高活性的感受态细胞。 试剂盒中提供的细菌为电穿孔 感受态，有很高的转化效率。如果不用电穿孔法进行转化，那么必须制备化学敏感性感受态细胞，并在应用之前试验其转 化活性（108 已足够） 。 2） DH5α 不可用于转化，因其不支持重组，它只是用来扩增重组病毒 DNA。 3） 本实验需要 2ug 线性化胶纯化的重组转移载体，共转化和对照各需 1ug。 4.2.2 共转化方法 同时进行实验组和对照组的转化实验： 实验组共转化：1ug 线性化重组转移载体（5ul）和 1.0ul pAdEasyTM-1 载体（100ug/ul） 对照组转化：1ug（5ul）线性化重组转移载体 1． 将 BJ5183 感受态细胞和电穿孔杯置于冰上。将细胞分为 2 管，每管 40ul。2． 40ul 感受态细胞中至多加入 6ul DNA，且 DNA 必须溶于水，避免含有离子。 3． 将 BJ5183 转入 2mm 电穿孔杯，防止有气泡形成。 4． 按电穿孔供应商的使用说明转化 BJ5183，Bio-Rad 仪器一般使用的参数为：200 Ohms、25uF、2.5KV；BTX 仪器则为： 5 Ohms、2.5KV、C=0。 5． 用 1mlLB 重悬转化物。 6． 转入 15~50ml 离心管中，37℃震荡培养 60 分钟。 7． 将转化物铺 3~5 块 LB/Kan（50ug/ml）培养板，37℃培养 24 小时。建议分别铺 100、300 和 600ul，以提高至少在一 块板中得到可分离菌落的机率，应该得到 40~100 个菌落。 8． 挑出 24 个最好的克隆，转入 2ml LB/Kan（50ug/ml）培养液中培养 10~15 个小时。不要储存 BJ5183 培养液，因有可 能产生非目的重组子。尽快抽提重组 AdEasyTM 质粒。 9． 用传统碱裂解法小量制备质粒，取一半进行 0.7%琼脂糖凝胶电泳，验证超螺旋质粒的大小。玻璃珠或树脂制备质粒的 试剂盒应避免使用，但粘粒 DNA 抽提试剂盒可以用。重组质粒大小约 40kb，由于它是低拷贝质粒，所以小量制备时应相 应调整具体操作。 4.2.3 预期结果 20%以上的菌落应含有大质粒（近 40kb） ，这些是侯选重组子。与对照培养板生长的菌落进行对照即可大概估计线性化转 移载体再连接所致的背景强弱。由于在此高效重组 recA+细菌中重组转移载体会形成多聚体，因此背景将表现为一个梯度。 4.3 AdEasyTM 重组质粒的筛选和扩增 将侯选重组子进行酶切分析，验证其结构。比如：PacI 酶切后通常得到约 30kb 的片段和一个 3.0 或 4.5kb 的小片段。小片 段的大小因重组位置在左臂还是复制子而不同。建议同时用克隆基因的内切酶进行分析，鉴定是否含有插入基因。挑选最 佳阳性重组子转入 DH5α 中进行扩增：转化 DH5α 只需 1-5ul 小量制备的重组子。这一步对于扩增时保持重组 DNA 的结构 是必需的，因为 AdEasyTM 这样的大质粒在 recA+细菌株如 BJ5183 中是不稳定的，会迅速出现缺失,而在 DH5α 中能很容 易地获得大量 DNA。 1． 将 DH5α 感受态细胞和电穿孔杯置于冰上。 2． 将 1-5ul DNA 加入 40ul DH5α 感受态细胞中，DNA 必须用水溶，避免含有离子。 3． 将 DH5α 感受态细胞转入 2mm 电穿孔杯，防止形成气泡。 4． 按照说明转化 DH5α：Bio-Rad 仪器一般使用的参数为：200 Ohms、25uF、2.5KV；BTX 仪器则为：50 Ohms、2.5KV、 C=0。 5． 将转化混合液重悬于 1ml LB 中。 6． 转入 15-50ml 离心管中，37℃振荡培养 60 分钟。 7． 培养后用 LB 按一定梯度稀释转化的 DH5α（1:10、1:100 和 1:1000） 8． 取 100ul 转化液铺在 LB/Kan（50ug/ml）板上，37℃培养 24 小时。未用的转化液可在 4℃保存-2 周。 9． 每个重组子挑 1~3 个克隆转入 5ml LB 扩增，以备有足够量质粒。这时，用内切酶再次分析重组 DNA，以确证含有插 入基因，以及重组子的稳定性。 10． 用柱纯化试剂盒制备至少 5ug 高质量的重组 DNA。 11． 取 5ug 质粒用 PacI 消化，酚/氯仿抽提一遍，乙醇沉淀后在无菌条件下溶于 50ul 0.1× 溶液。具体要求参见磷酸钙 TE 技术一章中有关转染前 DNA 制备的内容。 4.4 AdEasyTM 重组子转染 QBI-293A 细胞 注意：培养细胞前先参阅 5.1 章中有关 QBI-293A 细胞培养的内容。磷酸钙技术中的注意点： 无菌 在整个过程中保持所有成分的无菌是至关重要的。昆腾公司提供的试剂盒中所有成分均是无菌的，但使用者还必须保证所 用其它试剂也均为无菌。 DNA 纯度 磷酸钙转染中所用的 DNA 必须是高纯度的，一些 DNA 污染物对培养的细胞具有很强的毒性，那些成功转染的细胞往往会 被污染物杀死。 沉淀时间 以前的资料都建议磷酸钙- DNA 共沉淀颗粒在加入细胞和培养液之前至少应反应 20 分钟。然而与此相反，最近的研究 （Jordan 等，1996）显示长时间共沉淀会形成聚合沉淀块，从而降低转染效率。因此，建议共沉淀成分混合后 1 分钟即可将沉淀加入细胞培养板。这一时间上的调整可产生小而稳定的沉淀，能更有效地被细胞摄入。 4.4.1 细胞铺板 每块板都用 DMEM5%进行培养，这样细胞在铺板后第二天即可达到 70%汇合率。由于共转染是通过细胞表面完成的，因 此转染时细胞必须是分离的，而不是汇合的。 1． 转染前一天以 7.5× 105 QBI-293A 细胞在 60mm 培养皿中铺板， DMEM5%培养， 用 第二天的细胞数应达到 1.0~1.5× 106。 37℃ CO2 孵箱中培养。CO2 孵箱有助于保持合适的 PH，培养皿在不进行操作时必须始终保存在 CO2 孵箱中。 2． 转染前 3-4 小时换成新鲜培养液，以保证在转染过程中细胞具有超常的生长力。将培养皿放回 CO2 孵箱中。 4.4.2 磷酸钙转化技术 1． 每个转染都必须用 5ug 无菌的线性化重组腺病毒 DNA。 2． 标记一个 1.5ml 离心管为编号 1。用微量移液枪加入 169ul 无菌水和 5ul 2M 氯化钙溶液。上下吸打二次混匀，然后一 滴一滴加入 50ul AdV DNA 溶液和 26ul 2M 氯化钙，再用移液枪慢慢吹打混匀。此时缓冲液的体积为 250ul，含有 0.25M 氯 化钙和 5ug DNA。 3． 准备第 2 管离心管（编号 2） ，加入 250ul 2× HBS 缓冲液。 4． 用 1ml 移液枪吹打 2 号管中的溶液形成气泡，在吹打的同时逐滴加入 1 号管的溶液。加完后继续吹打 5 秒以使其完全 混匀。这一步骤对于形成的共沉淀颗粒的大小至关重要，小颗粒转染效率更高，而吹打可以形成较小的颗粒。等一分钟后 再加入细胞培养皿内。 5． 在超净台内将磷酸钙-DNA 共沉淀混合物逐滴加入到培养皿中，覆盖范围尽可能广。培养液稍后即会透明，十字形晃 动培养皿使沉淀均匀分布。 6． 培养皿放入孵箱培养过夜。4 小时后，沉淀颗粒在 200× 倒置显微镜下应清晰可见，尤其在无细胞的培养皿表面。 7． 第二天，去除含共沉淀颗粒的培养液，用 PBS 制备的 1mM EDTA 溶液洗一次，PBS 洗 2 次。 注意：转染后细胞都十分脆弱，容易脱壁。清洗时应十分轻柔，将 PBS 沿培养皿壁加入，然后轻轻旋转培养皿。用移液枪 反复将培养液直接加在细胞上，即可使细胞脱落，然后收集。由于这一时期细胞十分脆弱，切勿使用胰酶消化。 8． 将细胞分装入 4 个 60mm 培养皿（每个培养皿中加 5ml DMEM5%）或一块 6 孔板中（每孔加 3ml DMEM5%） ，静置 6 小时使其贴壁。6 小时后覆盖琼脂糖以供形成病毒空斑。 第五章 常用技术 5.1 QBI-293A 细胞培养 昆腾公司的 293A 细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆，具有易使用和易转染的特性。该细胞株对于高细胞密度很敏感， 当细胞超过 70%汇合时，一些细胞可能会丢失它们的表型。若细胞密度持续在 70%以下，QBI-293A 细胞则能连续培养 3~4 个月维持原有细胞特性。若以购买得到的 293 作为第一代，则 30 代内能得到最佳结果。一旦到了 30 代，最好复苏一管细 胞开始新的培养。所以，我们建议你在收到细胞后应尽快建立自己的 QBI-293A 细胞库。 QBI-293A 细胞在 DMEM 培养液中培养， 该培养液还含有 4.5g/L L-葡萄糖、 110mg/L 丙酮酸钠、 2mM 谷氨酰胺和胎牛血清。 血清浓度为 2%~10%，视实验需要来调节细胞生长速度。为简化此操作说明，培养基描述为 DMEM 后加血清浓度（如： DMEM5%表示：含有 4.5g/L L-葡萄糖、 110mg/L 丙酮酸钠、 终浓度为 2mM 的谷氨酰胺和终浓度为 5%的热灭活胎牛血清） 。 QBI-293A 细胞需按标准的细胞培养规程进行操作，在健康状态时，它们呈成纤维细胞样并在培养瓶中贴壁形成单层细胞。 被感染的细胞则变圆脱落，即所谓的细胞病理效应（CPE） 。所有的细胞培养操作都应严格遵循无菌原则，这一点是至关重 要的。抗生素可用可不用，但无抗生素条件对于操作质量来说通常是一个好的对照。 QBI-293A 细胞生长的相对密度见下表： 表 2：汇合率与细胞数量汇合率(%) 60mm 培养皿 100mm 培养皿 50 1.60× 106 3.5× 106 75 2.40× 106 5.25× 106 100 3.20× 106 7.00× 106 5.1.1 QBI-293A 细胞初始培养 1. 将冻存的一管 QBI-293A 细胞在 37℃水浴轻轻晃动融化。 2. 融化后在超净台无菌条件下用 70%乙醇将冻存管的盖沿擦拭干净。 3. 将细胞转入 15mL 无菌离心管中，加入 10mL DMEM 10%，600× 离心 5 分钟使细胞沉淀。 g 4. 弃去上清。 5. 将细胞用 10mL DMEM 10%重悬，轻轻打匀6. 转入 75cm2 培养瓶或 100mm 培养皿中培养。 7. 在 5% CO2 孵箱中 37℃培养过夜。 8. 第二天观察细胞汇合率，若合适则可进行实验，否则按 5.1.2 所述继续培养。 5.1.2 QBI-293A 细胞的维持培养和增殖 QBI-293A 细胞必须按 1:10 到 1:20 传代 1. 室温下胰酶消化 1~3 分钟使贴壁细胞脱落 2. 拍打培养瓶边缘使细胞脱落，在倒置显微镜下观察细胞是否变圆，是否已从培养瓶表面脱落。 3. 按需要用新鲜培养液稀释细胞悬液，转入新的培养瓶中。 在 5% FBS 中，细胞倍增的时间是 26 小时，在 10% FBS 中稍短一些。 5.1.3 QBI-293A 细胞的冻存 建立细胞库时必须使培养的细胞汇合率低于 50%，以保证亚克隆的特定表型。 1. QBI-293A 细胞必须在含 10%高质量 FBS 的 DMEM 中培养。 2. 将健康生长的 QBI-293A 细胞离心沉淀。 3. 以最小体积的 DMEM 10%重悬细胞。 4. 用血球计数器进行细胞计数。 5. 用 DMEM5% + 10% DMSO + 40% FBS 重悬细胞，细胞终浓度为 1× 106/mL。 6. 无菌操作将 1mL 细胞悬液转入 2mL 冻存管中。 7. 将冻存管放入冻存盒中，-80℃储存 24 小时。这一简便措施可保持约 1℃/分钟的降温速率，适于冻存细胞。 8. 第二天将冻存的细胞转入液氮罐或-150℃冰箱中长期保存。QBI-293A 细胞若正确冻存，则可在液氮罐中保存数年。 5.2 QBI-293A 细胞的感染和病毒空斑的产生 感染 QBI-293A 细胞和产生病毒空斑在这本手册的多种操作中都得到应用，其具体操作视不同的实验目的而稍有差异（如 滴度测定、大规模扩增和纯化） 。这一节提供了一个基本的操作说明，并详细描述了 QBI-293A 细胞感染后不同时间的具体 变化。 5.2.1 感染 QBI-293A 细胞 QBI-293A 细胞中腺病毒的感染周期表现为光镜下可见的细胞表型的改变，此周期始于病毒和细胞接触后。被感染细胞的 表型变化与病毒接触的时间以及病毒细胞比率相关，这个比率称为感染复数（MOI） 。病毒控制细胞并阻止细胞的生长需要 几个小时的时间。 10~20 的 MOI 值通常用于需要同时感染所有细胞时，此时细胞汇合率应该在 90~95%左右，因为细胞在感染数小时内将停 止生长。加入病毒的量可通过 MOI 值测定（见 5.3）或病毒滴度测定（见 5.8）确定。在这个 MOI 值条件下，被感染细胞 的形态在 1~2 天后就会完全改变：细胞变圆并逐渐从壁上脱落（见 5.2.2） 。随着病毒的增殖，细胞核将占据细胞的大部分， 这一表现称为细胞病理效应（CPE） 。感染后 3 天，所有细胞都将呈现 CPE。 当 QBI-293A 细胞在 MOI 值为 1 或更低的情况下被感染，则只有一部分细胞能被感染。此时感染所有的细胞必须产生完整 的感染周期并释放病毒，整个过程大概需要 4 天。在这个过程中，未被感染的细胞将继续生长，细胞可能在未被全部感染 时达到 100%汇合率而停止生长。感染后的表现是多种多样的，但典型的表现是在感染后 5 天可见大多数细胞呈现 CPE 而 其余的细胞表现为原来未被感染的形态。 感染的操作很简单，只要将病毒与细胞接触。为增加感染的有效性，在最初 2 小时感染中最好将培养液的体积减到最小， 这样病毒与细胞接触得会更紧密，然后再增加培养液。此外，缓慢而持续地晃动培养板（Mittereder et al. 1996）可使病毒 分布更均匀，从而使感染效果更好。 注意：处理细胞和病毒时都必须使用消毒的枪头。 5.2.2 病毒空斑形成 病毒空斑形成源于一个细胞被一个病毒感染后，经过多次完整的感染周期释放病毒再感染周围的细胞。病毒空斑的形成是 一个缓慢的过程，甚至在光镜下能观察到空斑之前，细胞已经达到 100%汇合。为限制病毒的扩散，通常在培养液中加入 琼脂糖，但在琼脂糖覆盖下观察细胞形态的改变则要稍微困难一些。 感染后 7 天左右可以在显微镜下看到小的空斑，表现为一定区域内细胞呈现 CPE。第 10 天可以在光镜下看到形态完整的 空斑，有经验的研究者则能凭肉眼观察到培养板底部有小的空白斑点形成。到 14 天，空斑可非常容易地被挑选出来。 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞 将琼脂糖覆盖细胞不是一项容易的技术，你必须在琼脂糖凝固之前迅速地将它在单层细胞上完全铺匀。但是如果铺得太快太重，那么细胞往往会脱壁。但通过几次实验后，这一步应该比较容易了。 琼脂糖/DMEM 混合物制备： 1. 用无菌 PBS 制备 5% SeaPlaque 琼脂糖（FMC 产品）储存液，高压消毒后每管 10mL 分装在 50mL 塑料离心管中，4℃保 存。 2. 使用之前先在微波炉中融化 5% SeaPlaque 琼脂糖（避免沸腾） ，然后冷至 45℃。防止琼脂糖沸腾最好的办法是在沸水浴 中加热，如果没有完全融化的话再在微波炉中加热数秒。 3. 加入 30mL 预平衡至 37℃的 DMEM5% 后充分混匀，这样琼脂糖的终浓度为 1.25%。立即使用。 覆盖 QBI-293A 细胞： 在进行下一步操作之前，请确认细胞是否已贴壁完好。 1. 移去培养液，用 1.25%琼脂糖/DMEM 混合物覆盖单层细胞。 2. 沿着培养板的边缘将琼脂糖轻轻加入，加入的具体体积参考表 3，然后放回 CO2 孵箱培养。 表 3：不同培养器皿应用的琼脂糖体积 培养皿大小 首次量 追加量 100 mm 10 mL 5 mL 60 mm 6 孔板 5 mL 3 mL 3 mL 1.5 mL空斑应在 10~21 天内形成，为保持细胞活力，每 4~5 天或培养基变黄时追加琼脂糖/DMEM 混合物。 5.3 MOI 测定 这一实验用来粗略估计病毒上清中病毒颗粒的数量 （精确测定病毒颗粒数量见 5.8 节的滴度测定） MOI 测定通常在扩增病 。 毒尤其是在大量扩增的时候使用，以确定感染的最佳条件。 这一实验可在含有 1× 106QBI-293A 细胞/孔的 6 孔板中进行。 1. 移去培养液，每孔加入 500μL 新鲜的培养液 2. 一孔为对照，其余每孔分别加入 2、5、10、25、50μL 病毒上清。 3. 不断缓慢晃动培养板，培养约 3 小时。 4. 加入 1.5mL 新鲜培养液培养 72 小时。 观察每孔细胞是否出现 CPE，根据预先的估计，感染后 3 天细胞完全出现 CPE 的病毒 MOI 值为 10~20。这样，根据感染 的细胞数量，你就可以估计出上清中的病毒量。 5.4 腺病毒感染力测定 这一实验的目的是确定腺病毒是否能将 DNA 转导入 293 之外的某一细胞株。该实验至关重要，因为它将确定腺病毒是否 可应用于这个细胞株，以及如果能应用则需要多少的病毒量（也就是需要大量扩增的程度）来完成整个研究。这个实验中， 如果用的是 Ad5-CMV-LacZ 则检测 β-半乳糖苷酶，Ad5-CMV-GFP 或 Ad5-CMV5-GFP 则检测 GFP。这些高滴度的产品都 可单独向昆腾公司购买。本实验的阳性对照（β-半乳糖苷酶检测）亦可向昆腾公司购买，但由于病毒滴度太低而不适于直 接进行实验，通常需要扩增以达到理想的病毒滴度（扩增步骤见 5.6） 。 腺病毒转导的效率各个细胞株都不太一样，其中尤以淋巴细胞株最难转导。 腺病毒感染力测定通常在多孔板中进行，MOI 为 1~200，当测定淋巴细胞株时 MOI 可至 1000。对大多数细胞株来说，1~50 的 MOI 值可将报告基因转入所有的细胞而不会出现任何的毒性。在高 MOI 情况下，某些病毒蛋白的高表达可对某些细胞 产生毒性。无论 MOI 为多少，感染时都必须用最小的培养液体积并不断晃动，以使感染效果达到最佳。 1. 按 5.2.1 中所述方法在 6 孔板中用不同数量病毒感染细胞（合适的 MOI 范围） ，培养 48 小时。 2. 进行 X-gal 染色（见下述） 。注意细胞与病毒培养后不必清洗细胞，在整个实验过程中让病毒留在培养液中。 5.4.1 X-gal 染色 1. 弃去培养液，用 37℃预热的 PBS 冲洗一遍，然后加入足量固定液（戊二醛或多聚甲醛）以覆盖细胞，0.05%戊二醛室温 孵育 5~15 分钟或 2%多聚甲醛室温孵育 60 分钟。 2. 弃去固定液，室温下用 PBS 彻底洗 3 遍：第一遍将冲洗液立刻弃去，第二、第三遍则让冲洗液保留 5 分钟。 3. 加入最小体积的 X-gal 溶液。 4. 37℃孵育 1 至 12 小时（过夜） ，阳性细胞将被染成蓝色。染色完成后可将培养板置于 4℃保存。 溶液： a） 戊二醛固定液使用前将戊二醛用 PBS 稀释至终浓度为 0.05%。 b） 多聚甲醛固定液 1. 将 2g 多聚甲醛溶解在 50mL 预热至 55℃的水中。 2. 加入 2 滴 10 N NaOH，溶液将变澄清。 3. 待多聚甲醛溶解后，加入 10mL 0.2M 磷酸二氢钠（2.76g/100mL）和 40mL 0.2M 磷酸氢二钠（无水，3g/100mL） 。 4. 固定液在 37℃条件下加入，在室温下固定。多聚甲醛固定液可在 4℃最长保存一个星期。 c） X-gal 溶液 用 PBS 制备（PH7.4） ： 20 mM 氰铁酸钾 ( K3Fe(CN)6 ) 20 mM 氰亚铁酸钾 ( K4Fe(CN)6?3H2O ) 2 mM MgCl2 或 MgSO4 使用前加入 X-gal 储存液（20mg/mL 溶于 N,N-二甲基甲酰胺） ，终浓度为 1mg/mL。 上述三种 X-gal 染色用的溶液可在室温下保存数月， 溶于 N,N-二甲基甲酰胺的 X-gal 储存液则可于-20℃在玻璃容器中储存， 用箔包裹后避光保存。 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化 腺病毒转移载体和腺病毒 DNA 通过在体同源重组产生重组腺病毒，这涉及到复杂的反应和基因重排或突变，导致病毒呈 现不同的表型。虽然重组腺病毒 DNA 在细菌内重组后已筛选到含有插入基因，但我们还是建议按照下面的操作步骤对细 胞内产生的重组腺病毒进行鉴定。 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送 重组腺病毒的挑选取决于病毒表达蛋白和增殖的能力。比如有两个不同特性的克隆，第一个克隆蛋白表达很好而且病毒可 增殖至 5000VP/细胞，而第二个克隆虽然蛋白表达水平只达到第一个克隆的 75%，但是却可以增殖到 10000VP/细胞。扩增 的时候，第二个克隆 10L 产量中的病毒数量即可达到第一个克隆 20L 的产量，这样当需要大量扩增病毒时第二个克隆是较 好的选择，而且产物足以产生生物学效应， 。 筛选方法的选择取决于病毒最终的应用。如果用于蛋白表达，那么必须使用能监测蛋白表达水平的方法；如果要挑选能有 效扩增的克隆，那么就用能定量检测 DNA 产量的方法。 简单的重组腺病毒筛选可用 PCR 方法，这一技术只检测病毒中的重组 DNA，而不能筛选特定的表型。其它技术不但能筛 选重组病毒，同时也能挑选特定的表型。克隆的挑选可根据： 1. 每个细胞产生病毒的数量。这可以用 Southern 杂交的方法，因为病毒 DNA 量与每个细胞的病毒含量有关。能产生高水 平病毒量的克隆有利于生产高滴度的病毒储存液，但是增殖最佳的克隆未必能最有效地表达蛋白。 2. 每个细胞蛋白表达的水平。这可以用 Western 杂交或功能测定的方法。 请注意有些最佳克隆可能会较难培养。因此筛选方法的选择取决于用来观察生物学效应的蛋白表达水平和重组腺病毒的最 终应用。 表 4 提供了选择最佳筛选方法的向导。报告基因、表达蛋白的抗体和功能测定的敏感性将影响操作方法的选择。得到最初 结果的时间对方法的选择也很重要，但这一原则必须慎重考虑，因为如果最终目的是生产大量病毒，那么一个 10 倍量高产 的克隆只需扩增 1L 即能达到原来 10L 的病毒量，这时使用快速筛选方法所节省的时间会在大量扩增过程中完全耗费掉。 表 4：各种筛选方法的特性 筛选方法 优点 缺点 Western 杂交? 显示表达蛋白的完整性 ? 显示插入基因的蛋白表达水平 ? 需要表达蛋白的抗体 可以用与其它蛋白有交叉反应的抗体，因为蛋白会在胶上得到分离 ? ? 得到最终结果需两个星期 Southern 杂交 或点杂交? 使用克隆基因作为探针，无须特殊试剂 通过信号强弱间接测定每个细胞内的病毒数量? 需从病毒储存液中额外扩增，整个流程需要一周时间 ? ? 仅能检测克隆的基因 PCR? 迅速，使用扩增病毒的储存液只需 1 天时间 ? 仅能检测克隆的基因且无法定量 ? 可能需要优化克隆基因的 PCR 条件免疫测定? 相对快速，总共需要 3 天时间 ? 需要与细胞蛋白无交叉反应的特异性抗体 ? 显示插入基因的蛋白表达水平 功能测定? 直接显示蛋白的完整性和功能 ? 需从病毒储存液中额外扩增，整个流程需要一周时间 对于大多数方法来说，信号密度与蛋白的表达水平、病毒 DNA 的增殖程度以及病毒保存液的纯度有关。空斑总量中的阳 性率提示克隆的纯度高低。比较不同克隆间的信号密度水平时克隆的纯度非常重要，也就是说必须保证所有筛选出来的空 斑必须 100%阳性。 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增 通过 AdEasyTM 系统纯化得到的细菌克隆而产生的病毒空斑应该几乎都是（95%）重组病毒。每个细菌克隆最好测定至少 1~2 个空斑的表型。 操作步骤 1. 从培养板上挑选 6~12 个空斑，标上圆圈。 2. 无菌条件下用 200μL 枪头挑出克隆并转入含 0.5mL DMEM5%/孔的 24 孔板。 3. 37℃病毒 24 小时。 4. 铺一块每孔含 1× 105 QBI-293A 细胞的 24 孔板。 5. 移去培养液，轻轻加入 100μL 步骤 3 中清洗的病毒（约 103 病毒颗粒） ，切勿将细胞吹起，十字型轻轻晃动 3 次，转入 CO2 孵箱 37℃培养 90 分钟。 6. 加入 DMEM5%，使总体积为 1mL，轻轻混匀。 7. 37℃ CO2 孵箱培养直至完全出现 CPE，在此 MOI 值下一般需要 5~10 天。如果 10 天后还没出现 CPE，说明此克隆的病 毒量太低，需要进行第二轮扩增。 8. 为从细胞中释放病毒，在-20℃和 37℃中充分冻融细胞 3 次。 9. 收集细胞，在 15mL 离心管中打碎。台式离心机上以最大转速离心 10 分钟，收集上清并储存于-80℃。这一冻存液中大 约有 5× 107VP/mL。如步骤 7 中所述，如果在第一次扩增后 CPE 不完全，则进行第二轮扩增。 由于 QBI-293A 细胞含有腺病毒基因组的 E1 区，因此 E1 区缺失的腺病毒与人染色体发生同源重组而产生有增殖能力的腺 病毒（RCA）的机率很低。发生这种回复突变的机率大约为 1/107，这种腺病毒的增殖速度比重组腺病毒快。首轮扩增产 生的腺病毒保存液是十分重要的，因为它含有 RCA 的可能性最低。这种保存液必须节约使用，并保存好所有低代病毒， 以便进行大量扩增，不可用已传过数代的病毒进行大量扩增。低代病毒 DMEM5%溶液可在-80℃条件下保存数年。所以， 保存好低代病毒可避免进行重复筛选和纯化病毒克隆的工作。 在这一期间可以选择适当的方法来筛选重组病毒，当所有病毒空斑 100%为正确的重组病毒时可以认为这个克隆为纯的。 如果此时病毒仍然不纯，则可以进行第二轮空斑纯化，然后再用适当方法进行筛选。 5.5.3 Western 杂交 以下内容提供了进行 Western 杂交的一般指导。 按照本手册制备的初次病毒扩增保存液已足够用来检测大多数腺病毒蛋白， SDS-PAGE、抗体反应和检测系统的具体操作请参考标准实验手册。 1. 在 5× 105 细胞/孔的 24 孔板中每孔加入 500μL DMEM5%培养液， 然后再每孔加入 200μL 初次病毒扩增保存液感染 48 小 时。 2. 确证所有细胞均出现 CPE，如果 CPE 不完全则再延长感染 24 小时。 3. 取出 400μL 转入 1.5mL 试管中，其余-80℃冻存。 4. 800rpm 离心 5 分钟，弃上清后用 20μL PBS 重悬细胞，用 P20 移液枪充分混匀重悬细胞。 5. 加入 20μL 2 × Laemmli 缓冲液（注意：对于某些蛋白和抗体，这一步使用不含巯基乙醇的缓冲液至关重要） 。 6. 煮沸 5 分钟。 7. SDS-PAGE 上样。 不同克隆抽提物中的蛋白含量变化很大，上样量勿过量。在显微镜下先测定每个样品的蛋白含量对于获得好的结果十分重 要，每孔的蛋白上样量大约为 5~10μg。 5.5.4 Souther 杂交和点杂交 1． 六孔板中加入 2× 106 QBI-293A 细胞，然后加入含 500-1000ul 初次扩增病毒保存液的 DMZM 5% 3ml，感染 48-72 小 时，直至完全出现 CPE。 2． 600× 离心 5 分钟沉淀细胞。 g 3． 500ul TE 重悬细胞，然后加入 SDS、EDTA 和蛋白酶 K，至终浓度分别为 0.6%、10MM 和 200mg/ml。4． 37℃孵育 2 小时。 5． 加入 5M Nacl 储存液至终浓度为 1M。 6． 冰浴 3 小时以上，或 4℃过夜。 7． 14000× 4℃离心 30 分钟，小心移走上清。 g 8． 加入 1 倍体积双蒸水稀释，以降低盐浓度。 9． 将 DNA 依次用 TE 缓冲的酚/氯仿/异戊基乙醇（25:24:1） 、氯仿/异戊基乙醇（24:1）抽提一遍。 10． 加入 2 倍体积 100%乙醇，用最大速率离心，使 DNA 沉淀。 11． 加入 50ul 双蒸水重悬 DNA（此沉淀中亦含有 RNA） 。 上述操作可获得足够 DNA 进行各种试验，如按标准进行 Souther 杂交和点杂交。所需 DNA 的量和所采用的技术有关（检 测单拷贝基因所需的 DNA 量） 由于每个细胞可产生
个拷贝的重组病毒， 。 膜上每点的 DNA 量可降低 150~1000 倍而不会影响信号。 5.5.5 病毒裂解产物 PCR 理论上讲，这是筛选重组病毒最快的方法，但是很难预料一对引物能否正常工作，因此常常需要优化 PCR 条件。如果把优 化 PCR 条件的时间也计算在内，那么获得最终结果需要的时间可能和其它定量方法差不多。PCR 反应可直接用初次扩增 得到的病毒保存液进行（5.5.2，第 9 步） 。一个 25ul 反应体积的标准 PCR 反应需要 4ul 病毒保存液（无需抽提） ，25pM 引 物和 1 单位 Taq 酶，取 5-10ul 进行电泳分析。标准的 PCR 过程请参考通用的分子生物学手册。 如果 PCR 扩增无效，则反应前需象 Souther 杂交一样抽提 DNA（Hirt 法） 。其实，每个克隆用酶切反应进行分析更为合适， 因为尽管酶切和 PCR 需要相同的时间，但酶切分析更能确认重组病毒的序列结构。 5.5.6 免疫测定 这是最快的筛选方法。免疫测定可直接在培养孔进行，一天内即可完成。但这方法需要特异的抗体，而且无法定量。具体 操作请参考相应的标准免疫测定方法。 1． 如 5.2.1 中所述，用初次扩增的病毒保存液感染细胞。 2． 4%多聚甲醛固定感染的细胞 20 分钟， PBS 洗 2 次， 如果需要可用 0.075%曲拉通/ PBS 渗透， PBS 洗 2 次以上， 2%BSA 阻断 60 分钟。 3． 加入一抗 37℃培养 60 分钟。 4． PBS 洗两次。 5． 加入标准的二抗（FITC，缄性磷酸酶，辣根过氧化物酶等）进行孵育。 6． 用相应方法进行蛋白显色。 5.5.7 功能测定 有些蛋白的功能可直接进行测定。如果目的是进行蛋白表达，那么建议用评价蛋白功能的方法来筛选病毒，必须应用能准 确评价蛋白质量的方法，操作应视需要进行相应调整。以下是分离含有完整蛋白的被感染细胞的一般方法： 1． 在每孔含 5× 105 细胞的 24 孔板中，每孔加入 700ul 含 200ul 首次病毒扩增保存液（5.5.2，第 9 步）的 DMEM5%，培 养 48 小时。 2． 观察细胞直至完全出现 CPE，如果 CPE 不完全，再延长感染 24 小时。 3． 取出 400ul 转入 1.5ml 离心管中，将剩余的 300ul 冻于-80℃。 4． 800rpm 离心 5 分钟，弃上清，将沉淀用 20ulPBS 重悬，用 P20 移液器使细胞充分混匀，重悬。 此时，可按照能保留蛋白功能的操作方法提取蛋白。注意，细胞抽提物含有大量病毒 DNA，从而会提高溶液的粘滞度。如 果粘稠性影响操作，可用超声降解 DNA 或用 20G 针头将 DNA 打碎。但细胞浆抽提物则不存在此问题。对于 DNA 结合蛋 白，蛋白功能测定通常是观察其迁移，对某些酶则进行比色测定。 5.6 病毒颗粒在 QBI-293A 细胞中的大量扩增 一旦重组病毒已被纯化和鉴定，即可在 QBI-293A 细胞中进行大量扩增。本手册提供了递增培养规模和腺病毒感染周期的 基本方法，按这一方法最终得到的病毒量约为 3× 1011~3× 1012。由于一个细胞中所含的病毒颗粒为 ，因此 1L 培养细胞可得到约 5× 1012 病毒颗粒。如果要把病毒用氯化铯梯度离心纯化，则必须至少 3× 108 的细胞，这样才能正确分 辨出病毒带。对于蛋白表达，则根据需要可在任何一步扩增步骤中停止，离心沉淀细胞后按照适当的操作方法进行蛋白抽 提（根据蛋白类型的不同抽提上清或细胞沉淀） 。为优化时间进程，每个感染周期必须与下一次细胞扩增培养同步。如果由 于各种原因不能同步，则必须将病毒冻存，直至下一次细胞培养开始后再融化病毒。注意每次扩增都将会剩下一些病毒， 这些病毒先不必丢弃，以便下一步扩增失败时备用。每次扩增最好都用最低代的病毒颗粒，这样产生突变型病毒的可能性会大大降低。 操作步骤： 1. 在 100mm 培养皿或 75cm2 培养瓶中加入 10ml DMEM5%培养 5× 106 QBI-293A 细胞。 2. 取 0.5ul 首次扩增的病毒保存液，加入 DMEM5%至 1ml，混匀，这样稀释应得到的 MOI 值约为 5。 3. 移去培养液，小心加入病毒混合液，切勿破坏细胞单层，十字形慢慢晃动 3 次，37℃ CO2 孵箱中培养 90 分钟。 4. 加入 9ml DMEM5%。 5. 再培养 72 小时，这时在 10ml 溶液中大约有 5× 109~5× 1010 个病毒颗粒，进行 MOI 测定以估计病毒颗粒（5.3） 。 如果此时得到的病毒量已足够，可立即进行病毒滴度测定（5.8） 。收集细胞，600× 离心 5 分钟沉淀细胞，去上清后加入 g 最小体积（一般为原始体积的 1/10 即 1ml）病毒保存溶液重悬细胞。-20℃/37℃冻融 3 次，台式离心机上以最大速率离心 去除细胞碎片，收集上清，然后按 5.8 进行病毒滴定。 6. -20℃/37℃冻融 3 次。 7. 转入 15ml 无菌离心管中，台式离心机上以最大速率离心 10 分钟，收集上清冻存于-20℃或-80℃。 8. 3 个 175cm2 培养瓶中各加入 107 QBI-293A 细胞进行培养。 9. 将 3ml 细胞裂解液上清加入 12ml DMEM5%中，混匀。移去细胞培养液，每瓶小心加入 5ml 混合液，十字形慢慢晃动混 匀 3 次，37℃CO2 孵箱中培养 90 分钟。此时 MOI 值约为 25。 10. 加入 DMEM5%至 30ml。 11. 再培养 48~72 小时。此时 10ml 培养液病毒量约为 3× 1010~3× 1011。若需要，进行 MOI 测定（5.3）以估计病毒滴度。 此时如果病毒量已足够，则可立即进入病毒滴定步骤（5.8） 。600× 离心 5 分钟收集细胞，弃上清，加入 1/10 原始体积的 g 溶液重悬细胞。-20℃/37℃冻融 3 次，台式离心机上以最大速率沉淀细胞碎片，收集上清，按 5.8 章中所述进行病毒滴定。 12． 移入 50ml 离心管中，台式离心机上最大速率离心 10 分钟，取出上清保存。 13． 30 瓶 175 cm2 培养瓶中每瓶各加入 107 QBI-293A 细胞。 14． 将 45ml 细胞裂解液上清加入 105ml DMEM5%混匀，从培养瓶中移去培养液，加入 5ml 混合液感染细胞，十字形缓 慢晃动 3 次混匀，37℃培养 90 分钟。此时 MOI 值约为 25。 15． 加入 DMEM5%至 30ml/瓶。 16． 再培养 48-72 小时，此时约有 3× 1011~3× 1012 个病毒。若需要，进行 MOI 测定估计病毒滴度。 如果要收集病毒颗粒，先收集被感染细胞，然后重悬在 5ml DMEM5%中。-20℃/37℃冻融 3 次，离心沉淀细胞碎片。此时 5ml DMEM5%中 3× 1011~3× 1012 个病毒颗粒，浓度为 6× 1010~6× 1011vp/ml。然后按 5.8 章中所述滴定病毒储存液，或者用 标准的氯化铯密度梯度离心法纯化病毒。 在 109 细胞中扩增病毒可获得大量病毒保存液， 而在 1010 细胞中扩增则有一定技术性。 切勿将扩增后的病毒保存液再用来 感染细胞，因这会大大增加 RCA 产生量。有时不得不使用纯化空斑以最大可能降低 RCA 产量。如果已没有纯化的空斑， 那么就不得不重新空斑纯化重组病毒，鉴定克隆后再进行扩增。如果需要大于扩增 4 轮后的病毒量，注意请用早期的病毒 作为扩增源。比如，用第 2 代病毒产生第 3 代病毒。如果没有第 2 代病毒，那么必须用第 1 代病毒来产生新的第 2 代病毒。 按这个原则进行扩增可使 RCA 水平尽可能低。 如果用于表达蛋白，则可以收集细胞后根据蛋白特点选择适当方法抽提蛋白。细胞沉淀中一般可提取 1-5mg 蛋白，建议在 小规模扩增后先测定感染后抽提蛋白的最佳时间，然后再大量扩增蛋白。 表 5：腺病毒扩增 第一代 每瓶细胞数 培养瓶大小（cm2） 感染来源 每瓶接种量 总培养体积 MOI 滴度（VP/mL） 总病毒量 1× 105 75 稀释的空斑 0.1 mL 0.5 mL 或 1 mL 0.01 1× 108~9 1× 108~9 第二代 5× 106 17 首次扩增后的病毒保存液 2.5× 107 10 mL 5 5× 108~9 5× 109~10 第三代 1× 107 51 第二代病毒 1 mL 90 mL 25 3.3× 108~9 3× 1010~11 第四代 1× 107 75 第三代病毒 1.5 mL 900 mL 25 3.3× 108~9 3× 1011~12培养瓶数 24 孔板 1 孔 1 3 305.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒。腺病毒纯化包括 3 步： 1． 不连续氯化铯密度梯度离心去除主要的细胞污染物和缺陷性病毒颗粒。 2． 连续氯化铯密度梯度离心将感染性病毒颗粒和缺陷性病毒颗粒分开。 3． 透析去除氯化铯（去盐） 。 连续密度梯度需要过夜离心。为保证时间安排，建议从早上开始第 1 步，这样大约在午后就可开始过夜离心。按照此时间 安排，完整的一个纯化过程包括去盐在内大约需 2 天时间。 下面所有操作均以 SW28 转子 30ml 离心管为例。理论上讲，溶液体积调整后也可用其它大小的离心管，切记在离心后收 集病毒带。由于有些污染物和成熟的病毒颗粒密度相近，因此这二条带之间的距离很小。在大直径的离心管中，病毒带更 细，离原始位置更远，这样，病毒带在 30ml 离心管中比在 12ml 的管中更易分辨。 5.5.7 不连续密度梯度离心 注意：为确保氯化铯密度梯度后较易分辨病毒带，扩增病毒至少需要 3× 108 细胞。 1． 预冷离心转子至 4℃。 2． 在离心管中缓慢加入 8ml 1.4g/ml 氯化铯（53g+87ml 10mM Trz-HCL，PH 7.9） ，再非常轻缓地加入 6ml 1.2g/ml 氯化铯 26.8+92ml10mM Tris-HCL，PH 7.9） 。病毒最终的纯度有赖于密度梯度的质量。 3． 超净台中在不连续梯度顶部加入 20ml DMEM5%病毒保存液，病毒量必须少于 109 细胞中所得的，否则将超过密度梯 度负荷量。如果保存液的体积少于 20ml，用 PH 7.9 10mM Tris-HCL 调至 20ml。 4． 平衡离心管，100000× g（SW28 转子上为 23000rpw）4℃离心 90 分钟。 5． 超净台中取出离心管，用夹子直立固定离心管。 6． 用 10ml 移液器从梯度顶部吸去大部分杂质。 7． 在离心管外壁的穿刺点上贴上胶带，以防止在穿刺过程中有液体泄露。 8． 用带 18G 针头的 5ml 注射器从离心管外壁稍低于病毒带（最下的一条带）的位置进行穿刺。 注意：感染性和缺陷性病毒颗粒之间的区域通常较浑浊，切勿吸取这一浑浊区。 9． 小心抽吸病毒带，避免吸到其它带和杂质，拔出针头。 10． 取出针头，将含病毒的溶液转移至无菌 15ml 离心管。 11． 加入 1 倍体积 1× TE，这一步对于把溶液密度降低至 1.2 以下是必须的，病毒带的密度大约为 1.345。 5.7.2 连续密度梯度离心 1． 使用连续密度发生器将 12ml 1.4g/ml 和 14ml 1.2g/ml 氯化铯连续密度梯度加入离心管中。 2． 非常缓慢地在密度梯度顶部加入 8-10ml 5.7.1 第 11 步中稀释的病毒悬液。 3． 100000× 4℃离心 16-20 小时。 g 4． 超速离心后，连续梯度溶液和不连续梯度溶液同样分层，但底部没有沉淀，因此通过底部穿刺即可获得感染性病毒带。 溶液上部（含细胞成分）通常更为干净，大部分细胞碎片已通过第一步不连续梯度离心被去除了。 5． 用 10ml 移液器从离心管顶部吸去大部分梯度溶液和杂质，避免吸到底部含病毒的蓝白色条带。这有助于在收集病毒 时降低溶液流出速度。 6． 用 20 G 针头从底部穿刺收集底部蓝白色病毒带。 7． 让底部梯度溶液流入烧杯，当接近病毒带时再转入 50ml 离心管中收集。 8． 蓝白色病毒带收集完后再将剩余的梯度溶液转入烧杯。 说明：当然，病毒带也可以象不连续梯度时一样从侧壁穿刺收集。 5.7.3 病毒溶液去盐和浓缩 氯化铯是通过透析去除的，这一步至关重要，因为高浓度氯化铯可能会影响病毒对细胞或组织的感染。透析液的选择取决 于病毒的最终用途。 如果用于动物， 则应避免使用甘油， 因为含有甘油的溶液极难注射； 如果要使病毒滴度达到 5× 1011vp/ml， 则应避免 PBS-5%蔗糖缓冲液，因其不能提供良好的病毒稳定性，由于溶液 PH 的关系，病毒将会沉淀下来。含 10mM Tris （PH8.0） ，2mM Mgcl2，5%蔗糖的病毒缓冲液可允许病毒浓缩至 1013vp/ml，并且具有良好的稳定性。 （Nyberg-Hoffman 等，1999） 。 将病毒带在分子筛为 25000 道尔顿的纤维素酯膜中进行 4℃透析，去除氯化铯盐。由于病毒分子量较大，大小约 90nm，因 此不能穿过透析膜。缓冲液的体积应为病毒溶液的 200 倍，每次透析一小时，然后更换缓冲液，3 次更换缓冲液后应已无 痕量氯化铯。透析后的病毒溶液可在-80℃中长期保存，-20℃中则可保存较短时间。需要注意的是腺病毒在反复冻融后感 染力将减弱，因此可将病毒分装成小份，一部分进行滴度测定（5.8：病毒滴度测定） ，剩下的用于以后的实验。如果透析后病毒溶液太稀，Millipore 公司的超纯浓集柱可将病毒浓度提高 10 倍。这个过程中所丢失的病毒量小于 10%。纯化柱在 使用前必须用 70%乙醇消毒，然后在加入病毒前再去除痕量乙醇（比如用病毒缓冲液） 。 5.8 病毒滴度测定 有很多名词都用来描述病毒溶液的滴度。 1． VP（病毒颗粒）或 OPV（光学颗粒单位） 2． GTU（基因转移单位）或转导颗粒（BFU 即蓝点形成单位，与 GTU 类似） 3． PFU（空斑形成单位） 4． TCID50（50%组织培养感染剂量） 不同的概念缘于不同的滴度测定方法，这些方法包括 2 类：物理方法（VP）和生物学方法（GTU、PFU、TCID50） 。 1． 测定 VP 的方法是测定病毒颗粒在 260nm 处的吸光度（病毒 DNA 和蛋白的总吸光度中主要为 DNA） 个 OD 值相当 ，1 于 1.1× 1012 个病毒颗粒。用这种方法进行测定在各个实验室中都较为稳定，但它不能区分感染性和缺陷性病毒颗粒。因此 这种方法只能提供病毒的量，至于质，比如是否含有缺陷性颗粒则没有考虑在内。 2． GTU 则测定感染后能表达报告基因的细胞数量。这个过程中，病毒将 DNA 转入细胞，在一个感染周期结束前立即测 定表达报告基因的细胞。如果重组腺病毒含有报告基因如 GFP 或 LacZ 等则可以用这种方法进行测定，病毒保存液通常不 用这种方法来进行描述。 3． PFU 是测定腺病毒滴度最早的标准方法，主要测定单层细胞培养中病毒裂解空斑的形成。空斑形成需要许多个感染周 期，得到最终结果通常需要三个星期。一般来说，这种方法得到的结果很少能在其它实验室重复，即使在同一实验室内， 不同技术员操作也很少能得到相同的结果。 4． TCID50 已被用于测定许多种病毒的滴度，但以前并不用于腺病毒。病毒稀释液与细胞在 96 孔板进行培养，然后监测 每孔是否 CPE。TCID50 方法相对 PFU 方法而言有几个优点，如速度是 PFU 的 2 倍，结果更具预料性，在不同操作个体间 也更稳定。 所有生物学方法所得到的结果在不同实验室之间往往有所差异，它主要与病毒感染方法有关。许多因素如加入的病毒储存 液的量、管子的类型、培养的时间、细胞和培养液的量等都会影响结果。最近，出现了两种测定病毒滴度的改良方法。一 种是用更小体积的病毒液进行感染并在感染过程中不断晃动培养板（Mittereoler 等，1996） ；另一种方法则在感染时将培养 板进行离心（1000 RCF90 分钟） （Nyberg-Hoffman 等，1997） 。这两个实验室所得到的结果更为稳定，并证实以前的方法 低估了病毒保存液中感染性病毒颗粒的数量。迄今为止，尚无一种方法被控制机构认定为测定滴度的标准方法。 对于同一管病毒保存液，不同的方法所得到的结果往往相差 100 倍以上，典型的数据见表 6。所有结果都只是大概的，目 前最有效的生物学方法（离心法感染）能检测到 1 个感染性颗粒/2 个颗粒。 下一部分，我们将详细描述 3 种不同的测定病毒滴度的方法。选择滴定方法要考虑的关键因素包括可重复性、稳定性、敏 感性、易用性和耗时。无论选择那种方法，稀释和滴定过程必须重复操作以得到精确结果。一般来说，用 TCID50 方法得 到的病毒保存液的滴度应为： 106~107 108~109
第一代细胞经冻融后 100 倍数量的细胞经过冻融后 用氯化铯方法纯化后表 6：各滴度测定方法特性 方法 类型 时间 可重复性 滴度* 评注 VP 物理学方法 2 小时 好 5× 1012 GTU 生物学方法 2 天 可变 2× 1011 PFU 生物学方法 21 天 变化很大 5× 1010 传统方法 TCID50 生物学方法 10 天 可变 2.5× 1011 昆腾公司标准方法 *以 VP 法测得的 5× 1012 的病毒保存液为标准 5.8.1 O.D.260 nm（VP/ml） 这种方法只是通过 DNA 量来表示病毒滴度。相关系数为 1.1× 1012/ OD260 单位。由于大多数分光光度计在 OD 值小于 0.1 时不够精确，而样品准备过程中又至少要稀释 10 倍，因此如果 OD 值大于 0.1，我们可以估计病毒量大于 1012。这一方法 只可用于测定氯化铯纯化后溶于缓冲液中的病毒，因含血清培养基会干扰吸光度。同时，它也要求病毒浓度足够高，并且 不含缺陷性颗粒。 1． 4℃融化病毒保存液。2． 在无菌超净台内用病毒裂解液（VLB） （0.1%SDS，10mMTris PH7.4，1mMEDTH）准备二个病毒稀释度。 最小需要量为： 病毒裂解液 52ul 168ul 3． 56℃震荡培养 10 分钟。 4． 准备 1ml 含有 VLB 和透析缓冲液的空白对照溶液，比例同上，以缓冲液代替病毒裂解液。 5． 测定 260nm 处吸光值： 稀释液 1 再稀释 1：5，为稀释液 3。 稀释液 2 再稀释 1：5 和 1：10，分别为稀释液 4 和稀释液 5。 测定稀释液 5（2 次） 、4、3 的 OD260，取此 4 值的平均值作为最终结果。 例如 1． 将 450ulVLB 和 50ul 稀释液即透析缓冲液加入比色杯中。 2． 记下空白管读数后弃去，不要冲洗。 3． 加入 450ulVLB 和 50ul 1：5 稀释样本（稀释液 2） ，组成稀释液 5。 4． 记下读数后弃去。 5． 清洗比色杯，加入样本重复测一次。 6． 清洗比色杯，加入 400ul VLB 和 100ul 1：5 稀释空白液。 7． 记下空白管读数后弃去，不要清洗。 8． 加入 400ul VLB 和 100ul 1：5 稀释样本，组成稀释液 4。 9． 记下读数后弃去。 10． 清洗比色杯，加入 400ul VLB 和 100ul 1：2 稀释空白液。 11． 记下空白读数后弃去，不要清洗。 12． 加入 400ul VLB 和 100ul 1：2 稀释样本，组成稀释液 3。 13． 记下读数后弃去。 将吸光值与稀释度相关系数相乘即可得出病毒滴度： OD260× 病毒稀释度× 测定稀释度× 1.1× 1012= OPU/ml 5.8.2 空斑测定 空法斑法测定滴度的主要原理是病毒感染 QBI-293A 细胞后，通过一个感染周期便可再感染邻近细胞，直至形成一个成熟 的空斑。这是所有生物学方法测定病毒滴度中最具挑战性的方法。由于许多因素如单层细胞质量、操作和观察方法等都可 影响到最后的结果，因此这一方法得到的结果往往最不稳定。 1． 5× 105 细胞/60mm 培养皿用 5ml DMEM5%培养，3-4 小时后等细胞贴壁即可进行病毒感染。或者在病毒感染前一天加 入 3× 105 细胞/60mm 培养皿。 2． 在 12 孔板中稀释病毒，储存于-20℃或-80℃备用。第 1 个稀释孔将病毒保存液稀释至 1ml，其它孔稀释至 3ml，大体 积可提高可重复性。稀释浓度原则视病毒浓度而定（纯化还是未纯化的） ，调节稀释度至 10-100 个病毒/孔，一般为 10-12， 这样稀释比大约为 10-7~10-12。 稀释：将 100ul 病毒保存液加入 900ul DMEM5%。用移液器上下吸打 5 次，此时稀释度为 10-1。换用新枪头将 300ul 10-1 稀释液加入 2.7ml DMEM5%，上下吸打 5 次，稀释度为 10-2。然后分别取 300ul 前一稀释液加入 2.7ml DMEM5%，形成一 系列稀释度，最后 4 个稀释度用于感染细胞。 注意：每次稀释时都必须换用新枪头。 3． 吸去细胞培养液，每个培养皿中加入 1ml 病毒稀释液和 1ml DMEM5%，十字形轻轻晃动混匀，37℃培养 90 分钟。 4． 吸去培养液，按 5.2.2 中所述加入 1.25%琼脂糖培养基。 5． 37℃培养,经常注意是否有空斑形成和是否需要加入新鲜培养基。21 天后应该可以看到空斑形成的白色小斑点。 结果:计数有多少个独立的空斑形成，将此数目乘以稀释度即可得到每毫升产生的空斑形成单位(PFU/ml)。 5.8.3 50%组织培养感染剂量法 此方法基于最高稀释度下在 QBI-293A 细胞中 CPE 的形成，它是昆腾公司用于测定滴度的标准方法。 5.8.3.1 细胞准备： 病毒 52ul 42ul 稀释度 1：2（稀释液 1） 1：5（稀释液 2）注意：病毒滴度高时（1013/ml）用 1：10 和 1：20 稀释度，滴度低时用低稀释度，保证 OD 值在 0.1~1.0 之间。1． 收集一瓶 QBI-293A 细胞，计数。 2． 用 DMEM 2%准备 20ml 105/ml 细胞。 3． 用 12 道排枪在 2 块 96 孔板中每孔加入 100ul 细胞悬液。 5.8.3.2 准备稀释病毒液 1． 第 1 管中加入 0.9ml DMEM 2%，其余加入 1.8ml。第 1 管中再加入 0.1ml 病毒保存液。 2． 上下吸打 5 次混匀。 3． 换用新枪头。 4． 从第 1 管中吸取 0.2ml 加入第 2 管中。 5． 反复稀释至最高稀释度。 6． 用同一管病毒保存液进行第 2 轮稀释。 7． 最后 8 个稀释液加入 96 孔板，每孔 0.1ml，每个稀释度 10 孔，2 孔为阴性对照。阴性对照孔中加入 0.1ml DMEM 2% 监测细胞存活情况。加样时从最高稀释度开始。 8． 37℃培养 10 天。 9． 10 天后倒置显微镜下观察，计算每一排中出现 CPE 的孔数。只要有一小点或是一些细胞出现 CPE 即为阳性，如果无 法确定，可与阴性对照比较。 10． 计算每一排中出现阳性的孔数。 如果阴性对照中无任何 CPE 且细胞生长良好，最低稀释度 100%阳性而最高稀释度 100% 阴性，则本测试即为有效。 图 7：TCID50 的典型结果 稀释度 孔 结果（每排阳性比率） ： 1 2 10-10 ；10-9；10-8；10-7；10-6；10-5；10-4；10-3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 对 照 ： ：CPE 阳性 ：CPE 阴性稀释度与比率分别为：10-10 0/10=0；10-9 0/10=0；10-8 2/10=0.2；10-7 6/10=0.6；10-6 10/10=1；10-5 10/10=1；10-4 10/10=1；10-3 10/10=1 在这一例子中，当稀释度为 10-6 时出现 100%阳性，当稀释为 10-9 时出现 0%阳性。因此，滴度可以用 KARBER 统计法精 确算出：对于 100ul 的稀释液，滴度为 T=101+d（s-0.5） d=log10 稀释度=1（对于 10 倍的稀释度而言） s=阳性比率之和（从第 1 个 10 倍稀释度开始）=1+1+1+1+1+1+0.6+0.2+0+0=6.8。 虽然一些低稀释度在测定中省略了（如 10-1 和 10-2） ，但在计算时仍应以阳性比率为 1 来算。 滴度：T=101+1（6.8-0.5）=107.3（100ul 病毒保存液中） T=100.3≈2×108 TCID50/ml。 说明：我们已经证实，TCID50 法测到的滴度 d=log10 值比标准空斑法高 0.7。 将 TCID50/ml 转换为 PFU/ml： T=1× 108.3 TCID50/ml=1× 108.3-0.7 PFU/ml=1×107.6 PFU/ml≈4×107 PFU/ml。 两次重复试验得到的滴度值应相差≤0.7 个 log10 值（100.7） 。第六章 疑难解答6.1 QBI-293A 细胞培养 表现 可能原因 解决方法 细胞高死亡率/细胞脱壁/培养液发黄 支原体、细菌或酵母菌污染 1） 复苏一管新的细胞 2） 使用抗生素如链霉素和青霉素 细胞生长困难 a) 细胞太少 QBI-293A 细胞传代时至少为 5%汇合率，以保证其在一定时间内恢复生长 b) 细胞密度过高 QBI-293A 如果经常培养密度过高，则有产生突变的危险，细胞汇合率切勿超过 70% 6.2 感染力测定 表现 可能原因 解决方法 感染后细胞高死亡率 a） MOI 过高 降低 MOI b） 细胞内含有内源性病毒（野生型腺病毒可产生辅助病毒样作用，使非重组腺病毒也能感染细胞） 更换冻存的细胞，初 代培养的较适用 c） 一些细胞株有类似 E1 区活性 若一定要使用该细胞株,改用较低 MOI不感染 a) MOI 太低 1) 尝试不同范围 MOI。对于 293 之外的细胞株，MOI 一般为 1~200，对于某些难于感染的细胞株可 能需要更高 2) 如果使用的是 Infect+阳性对照，储存液在应用之前首先应扩增 b) 感染条件不够优化 1）任何感染试验都需以 293 细胞为阳性对照 2）以未感染的 293 作为阴性对照来监测细胞培养条件 c) 一些细胞可拮抗腺病毒的感染,需要很高 MOI 联系技术支持（info?qbi.com） 6.3 转移载体克隆 表现 可能原因 解决方法 转化大肠杆菌后无菌落形成 a） 抗生素应用不当 b） 转化效率差 c） 制备的质粒质量差 使用 50ug/ml 卡那霉素 确证细胞是否具有转化活性；用氯化铯或其它方法纯化质粒；转化后有太多菌落形成 培养基中无抗生素 培养基中加入卡 那霉素 筛选的克隆中无目的基因 a） 不匹配粘末端连接； b） 钝末端连接导致无转化； 连接头太短， c） 不能被有效切割； d） Taq 酶在 PCR 片段末端产生太多突出性腺嘌呤 确证酶切后 DNA 粘末端是否匹配 加大连接酶量，确证克隆位点已正确应用，Klenow 进行钝化 确证连接头之间有足够的碱基对以供正确酶切。详细信息可向内切酶供应商查询 Taq 酶在 PCR 产物 3’末端可产生一个额外的腺嘌呤。必须移去这个额外的腺嘌呤（可用 Klenow）或者使用产生钝末端的 温度稳定性聚合酶 转移载体重组子的分子量不正确 使用了错误的载体或克隆基因 cDNA 用胶纯化，确保连接前无其它载体污染 限制性内切酶无法切割质粒 a） 甲基化 b） 酶已失活，检验切割的序列是否对甲基化敏感，若是，则在对甲基化不敏感 的细菌如 GM33 中扩增质粒使用新鲜的酶和制造商推荐的缓冲液 6.4 在 BJ5183 细胞中共转化和重组 表现 可能原因 解决方法 菌落少或无菌落 a) 转化效率不够；b) 抗生素使用错误或浓度过高；c) 制备的质粒质量差；d) 细胞转化活性 e) 使用了错误的细菌株 1） 按照试验盒说明书进行操作，这是一个关键步骤，必须使用最优条件 2） 向电穿孔仪制造商查询适用于这一细胞的特定操作方法 抗生素为 50ug/ml 卡那霉素 1） 用氯化铯或其它方法纯化质粒 2） 胶纯化可降低背景菌落的形成，但也可能降低了转化效率。当转化效率太低时避免使用胶纯化 1） 试剂盒中提供的细菌都具有电穿孔转化活性，如果使用其它方法进行转化，则必须将细胞制备为化学转化活性 2） 细菌必须正确保存以免丧失转化活性，参照推荐的方法保存 使用试剂盒中提供的 BJ5183 细菌株，DH5α 仅供用于重组子的扩增，因其无重组活性。 菌落过多 a) 转移载体和病毒 DNA 的比率过高 b) 转移载体用 PmeI 线性化不完全 c) 卡那霉素质量差或量不够 1） PmeI 消化后用胶纯化或去磷酸化质粒 2） 共转染时减少转移载体的量，推荐比率为：1ug 转移载体:0.1ug 超螺旋 DAdEasy-1 DNA PmeI 酶切时减少 DNA 量，检查内切酶是否具有活性，使用新鲜的卡那霉素，浓度为 50ul/ml 6.5 转染 QBI-293A 细胞 表现 可能原因 解决方法 无空斑 a） 制备的质粒质量差 用氯化铯密度梯度法纯化用于转染的质粒；b） 时间问题 弃去培养板之前先等 2~3 周或更 长。空斑将在 2~3 周内逐渐形成，如果重组子高表达蛋白，这个过程将更慢；c） 转染操作 用阳性对照来检验转染效率 d） 细胞拮抗腺病毒 从细胞库中复苏另一管细胞 e） 病毒质粒未经 PacI 线性化 闭环质粒不会形成病毒空斑，转化前必须用 PacI 进行线性化 空斑太多 高转染效率导致空斑密度过高 由于太多数被转染细胞都将产生病毒空斑（79.5%） ，转染时请使用较少量的腺病 毒 DNA 转染后细胞高死亡率 a） 转染后钙离子未彻底去除 转染后先后用 PBS/EDTA 和 PBS 各洗一遍，去除钙离子 b）转染后细胞经胰酶消化 细胞在转染后非常脆弱，极易从壁上脱落。不要使用胰酶进行消化，这样做不仅不必要，而且 还可能导致活着的细胞死亡，覆盖的琼脂糖不清澈 琼脂糖被污染 使用无菌的琼脂糖6.6 筛选和测定 表现 可能原因 解决方法 无重组子 a） 挑中了背景空斑（即首先出现或最大的空斑） 挑空斑之前先等 14~17 天 b） 达到或超过了载体的最大克隆能力 确认是否超过最大克隆能力；若有疑问请联系技术支持（） c） 插入基因产物有毒 在 293 细胞中暂时性表达蛋白以评价气度性。若有毒，请替换未可诱导或较弱的启动子 d）插入基因缺失 重组时因某些未知原因可能导致基因缺失，应筛选较多的克隆 扩增后插入基因丢失 有 RCA，当大量扩增时可能发生回复突变 1）检测是否含有 RCA 或感染非允许细胞 2）联系技术支持，请教如何检测和限制这一现象 3）用原始病毒保存液重新空斑纯化病毒 重组时将插入基因丢失 用原始病毒保存液重新扩增 6.7 在 QBI-293A 细胞中表达 表现 可能原因 解决方法 重组蛋白不表达 a）基因未插入重组病毒 用病毒保存液进行 PCR 反应，检测是否含有目的基因 b）表达水平太低，所用方法无法检测到 优化检测蛋白表达的条件 蛋白表达水平太低 a）蛋白表达的克隆设计不够优化，如非翻译区太长、离启动子太远等等 选择最佳蛋白表达克隆。这些 因素在进行克隆设计时就应考虑到 b）启动子不太适合在所用的细胞类型中表达蛋白 用另一类型细胞验证蛋白表达情况 6. 8 重组腺病毒的扩增 表现 可能原因 解决方法 病毒溶液终浓度低 病毒增值速度慢，这和很多因素有关，如插入基因的大小、毒性和重组情况等等 1） 感染时间从 48 小时增加到 72 小时，以产生完全的 CPE 2） 保证三次冻融都很完全 3） 如果需要，用更大的培养器皿和更多的细胞进行更大量的扩增（代数不能太多） 6. 9 纯化 表现 可能原因 解决方法 第一次氯化铯离心后无条带形成 a） 收集的细胞量太少 b）病毒量太多 1） 感染的细胞量不够。至少需要 3× 108 细胞，当病毒生长缓慢时则需更多细胞 2） 降低稀释度 上样量密度过大将使分离失效，适当稀释上样液 第二次氯化铯离心后无条带形成 第一步操作不当导致病毒丢失 吸取病毒带时必须非常小心，宁可吸到污染的杂质也不要 漏吸，第二步将会去除污染的缺陷性颗粒 第二次离心后条带分离不清晰 a) 氯化铯密度梯度制备质量差 b) 离心问题 1） 连续密度梯度必须使用密度梯度发生器小心制备，离心前切勿将梯度打乱 2） 稀释第一步中得到的病毒带 3） 不要使用直径比推荐值小的离心管，否则条带将变大 检查离心记录，速度和时间都会影响分离效果 6.10 病毒滴度测定 表现 可能原因 解决方法 OD260 测得的滴度与空斑测定或 TCID50 测定获得的滴度无相关性 a） 含有大量缺陷性颗粒 b） 稀释错误； c） 细胞密度不够 用两次氯化铯离心纯化病毒，去除缺陷性颗粒，精确测定滴度时，每个稀释度都应有复孔；稀释时必须 换用枪头；进行滴度测定时细胞必须 50~60%汇合 无 CPE 或空斑 a） 保存液滴度太低，无法检测到；b） 时间问题 1） 使用阳性对照，以确保方法和溶液的有效性 2） 降低保存液的稀释度 在推荐时间内等待空斑形成和 CPE 出现 保存后滴度降低 缓冲液不对或储存不当 1） 使用含 2mMgcl2 和 5%蔗糖的 10mM Tris 缓冲液，PH8.0，PH 值对于长期保 存至关重要 2） 将病毒保存于-80℃，不主张长期保存于-20℃；3） 将病毒分装成小份，以免反复冻融后降低滴度