Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification | Protocol (Translated to Chinese)
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&JoVE Biology
选择反应监测质谱法进行绝对定量蛋白质
1Cellular Networks Proteomics Unit, Laboratory of Systems Biology, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health
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Date Published: 8/17/2015, ; doi:
Manes, N. P., Mann, J. M., Nita-Lazar, A. Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification. J. Vis. Exp. (102), e52959, doi:10. (2015).
使用质谱（MS）蛋白质组实验可以设计为使用非靶向（散弹枪）或有针对性的方法。发现蛋白质组学通常依赖于自下而上猎枪质谱，或者通过使用一个传统的数据依赖性获取模式，或者通过使用最近开发的与数据无关的技术之一（ 例如 ，MS E，小水）1,2-。鸟枪蛋白质组学是一个功能强大的工具，高通量肽鉴定和相对定量，但它通常是不适合的绝对定量或用于靶向蛋白质的小，定义集（?数万）。最常用于目标蛋白质组的MS法被选择，因为它的高灵敏度，速度和动态范围3-5的反应监测（SRM）。替代品SRM包括平行反应监测，这需要高分辨率，全MS扫描6的优势。
SRM是使用纳米流逆向工程＆通常进行SED相高效液相色谱法（纳米RP-LC）仪器耦合到纳米电喷雾附着到三重四极质谱仪（QQQ-MS）（纳米ESI）离子源。在典型的实验中，样品的蛋白质被蛋白水解消化，所得的肽色谱分离，解吸和电离。得到的前体离子M / Z过滤由所述第一四极（Q1）和零散的第二四极（Q2）通过与碰撞气体碰撞它们。所得的片段离子是M / Z-过滤在第三四极（Q3）中，并由倍增电极定量。每种前体离子和碎片离子对被称为过渡，并且每个过渡监视在指定的时间段（停留时间;通常2-50毫秒）。在LC-SRM中，通过转换的预定义列表中QQQ-MS周期（占空比是通常≤3秒），并且每个过渡的色谱产生。 替代战略中独立实体为蛋白质定量通常使用的免疫测定，例如斑点印迹，Western印迹，酶联免疫吸附，抗体微阵列，反相蛋白质微阵列，微流体免疫测定，数字的ELISA，以及基于微球的免疫7。最好的免疫测定可以是显著比LC-SRM更加敏感，并且可以通过免疫测定的样品可以是比LC-SRM 5显著更高。然而，开发免疫测定可以是昂贵的和/或费时的，产生的测定法可以是易受交叉反应性和/或干扰，不符合细胞/组织裂解/均匀化的方法，和/或不适合于复用5,8。其中的一些问题可以通过偶联抗体和基于MS的技术来解决。例如，靶蛋白可以通过免疫前蛋白水解和LC-SRM 9-12富集。可替代地，SISCAPA技术采用对蛋白水解随后免疫沉淀在肽LEVE升13,14。除了immunoenrichment策略，高丰度蛋白的免疫耗竭可用于增加LC-SRM灵敏度通过减少干扰由共洗脱被分析物15,16。 基于MS的蛋白质定量可以分为相对和绝对定量，并且也为无标记和稳定同位素标记（ 例如 ，代谢标记，化学标记，以及重标记的蛋白质和肽内标准）。无标记技术可以为相对蛋白定量是有用的，但不适合于精确的绝对定量。通过比较，标记技术具有减少与样品制备和MS方差相关的错误，并且经常被用于相对蛋白定量17。例如，稳定同位素标记蛋白质组（SILAP）标准允许使用潜在生物标志物的相对定量通过人血清18 LC-SRM一个培养的人类细胞制备。精确的绝对蛋白定量由MS需要纯化的，量化的，同位素标记的蛋白质或肽内标准被掺入-成在MS之前的生物样品。重同位素标记的内标准纳入的LC-SRM工作流使已被证明是高度可再现和可转让的实验室16,19之间的绝对定量。 稳定同位素标记的内部标准进行绝对蛋白定量经MS包括肽标准，使用固相合成20，蛋白级联的蛋白酶可切割的肽标准21组成，和全长蛋白质标准22制备。靶蛋白共价修饰和不完整的样品制备（ 即不完整的样品裂解和均质化，和不完全蛋白质溶解，变性，烷基化，蛋白水解和）可以破坏精确的定量。内部protein标准是最不容易受到大多数这些潜在的问题，但是它们通常是最难以制备。另一种方法是分析使用被设计为包括氨基和羧基末端天然侧翼残基的多个内部肽标准每个目标蛋白质。无论哪个内标类型采用的，但是应当掺入-到生物样品在早一个点的样品制备尽可能期间。此外，多个样品制备技术（ 例如 ，不同的变性条件）进行测试。多个正交实验技术（实验交叉验证）的使用是一个可行的战略，以克服最有潜力的量化挑战23-25。 蛋白的LC-SRM量化是一个高度灵活的技术，已在各种各样的应用中被使用。值得注意的是，它已被用于在研究的肽和蛋白质生物标志物临床样品如血清，核心活检，以及细针抽吸5。 LC-SRM也已用于测量蛋白质复合物5,26的化学计量，以检测肉毒神经毒素27，向 信号通路5内量化蛋白磷酸化动力学，并量化改变蛋白质构象28。 我们的实验室使用LC-SRM量化介导的巨噬细胞的趋化，以支持趋途径模拟发展的信号蛋白。该协议的总体方案（ 图1）开始排名暂定目标肽。随后，粗外部肽标准合成并用于开发的LC-SRM测定生物样品的定性分析。如果来源于生物样品的靶肽进行检测，纯化的重标记的内部肽标准进行定量的LC-SRM制备。该协议可以用于交流curately从各种各样的生物样品的定量蛋白质，并支持多种蛋白质目标调查。 Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
注意：此方法已如前所述56。
1.肽目标选择编译靶蛋白的列表，并且包括少量持家蛋白的跨生物样品归一化，并且还包括一个内部蛋白质的标准（ 例如 ，萤火虫萤光素酶）。消化靶蛋白为胰蛋白酶肽在硅片使用的软件工具，如蛋白质的消化模拟器29,30。 要求肽完全胰蛋白酶，不含失踪胰蛋白酶裂解位点。避免肽与邻国的胰蛋白酶切割位点，以避免潜在的不完整的胰蛋白酶消化31。 要求每个肽的长度为5-20个残基。考虑更长的肽，但请注意，他们一般都比较昂贵合成。 避免的肽，如果它对应于天然的遗传变异体（ 例如 ，一个单nucleotidE基因多态性）。还确认胰蛋白酶站点不受影响（步骤1.2）。 避免的肽，如果它对应于翻译后修饰（PTM）的一个位点。同样地，避免肽是否会LC-MS样品制备过程中容易出现的化学修饰。具体地，避免肽容易发生半胱氨酸和甲硫氨酸的氧化，天冬酰胺和谷氨酰胺脱酰胺和氨基末端谷氨酰胺形成焦谷氨酸的。确认胰蛋白酶站点不受影响（步骤1.2）。 此外，避免肽，从蛋白质的氨基和羧基末端起始，因为蛋白质末端易于翻译后修饰（氨基末端蛋氨酸损耗和乙酰化，和羧基末端酰胺化）。 要求每个靶肽是彼此不同的靶蛋白。如果这是不可能的，需要该肽是唯一的一组同种型/同系物。治疗肽仅由亮氨酸/异亮氨酸替代的不同仿佛确定肽的唯一性，因为这些在LC-SRM执行几乎相同，他们是相同的。 如果已经执行（ 例如 ，RNA测序）中的所有生物样品的全面转录分析，确定肽唯一使用的转录物的硅片的翻译序列的32，而不是使用该物种的整个蛋白质组。 要求目标肽是蛋白典型。确定使用的生物样品的猎枪质谱1,2-肽段正在研究中。可替换地，检索从联机蛋白质组学数据库肽段如在NIST质谱的肽鉴定库33（http://peptide.nist.gov/），全球蛋白质组机34（Ⅹ从http HUNTER光谱库：//万维网从http://gpmdb.thegpm.org/ .thegpm.org /猎人/ index.html的，和GPMDB肽鉴定），PeptideAtlas 35 </s向上&（http://www.peptideatlas.org/）和PRIDE数据库36（http://www.ebi.ac.uk/pride/archive/）。 如果定量转录级的生物样品的分析已被执行（ 例如 ，RNA测序，定量PCR），然后避免靶向对应于相对低丰度转录物的肽。 如果需要的话，可以用于靶蛋白直向同源物的LC-SRM测定，选择目标的肽（ 例如 ，为了测定两个人类和小鼠形式的靶蛋白）。 选择每个靶蛋白至少两个目标肽（如果可能）。
2.制备肽标准注：本部分协议描述了一组二十冻干肽标准（每为1纳摩尔数量）为下游分析的准备工作。对于不同数量的肽，或为不同的肽的数量，这将需要进行相应的调整。 <li&准备使用肽合成技术冻干肽标准（≥1纳摩尔），例如SPOT合成20,37。 确保外部肽标准的半胱氨酸残基脲基甲基化（用碘乙酰胺烷基化形成的化学结构）。与此相反，确保内部肽标准的半胱氨酸残基是未经修饰的（这些将样品制备过程中烷基化，如下所述）。 设计内部肽标准，以便它们包含氨基和羧基末端天然侧翼残基（以控制对胰蛋白酶消化效率;每个典型地是三至六个残基长）。 设计内部肽标准，使它们是稳定的同位素标记。选择的肽标记策略时考虑目标肽的天然同位素分布和MS的质量测量的精度。不要使用氘化肽标准，因为肽氘原因反相液相色谱保留时间s到38移。 注意：通常情况下，胰蛋白酶内部肽标准使用?98％的纯合成的[13 C 6，15 N 4]精氨酸和[13 C 6，15 N 2]在羧基末端引入赖氨酸。 纯化使用HPLC 39内部肽标准，并准确地对其进行量化40。 加入100微升的0.1％体积/体积的甲酸，20％体积/体积乙腈（ACN）至每1纳摩尔冻干肽标准，以产生10μM的肽浓度（使用小心，因为在冷冻干燥的肽可以具有非常低的密度并且可以很容易地丢失）。涡旋样品2分钟，浴超声处理他们5分钟，以确保肽溶解完全。 池的溶解肽，并在真空中浓缩所得到的混合物浓缩至80μl的终体积。添加20微升乙腈以溶解任何沉淀的肽。 注：样品现在合作ntains10μM的每种肽和20％体积/体积乙腈。 对于内部肽标准，准备稀释系列定量LC-SRM： 制备100微升1μM的稀释液：结合90微升20％体积/体积乙腈和10微升10μM的肽的混合物。 制备100微升100nM的稀释：结合90微升20％体积/体积乙腈和10微升的1μM的肽的混合物。 对于外部肽标准，制备100微升1μM的稀释为LC-MS通过组合90微升0.1％体积/体积的甲酸和10μl的10μM的肽的混合物。 注意：示例现在包含1μM的每种肽，0.1％体积/体积的甲酸，和2％体积/体积乙腈，并且准备好被用于LC-SRM测定的发展。
3. LC-SRM分析开发通过使用纳米流HPL猎枪质谱分析的外部肽标准（约1-10皮摩尔每次注射每种肽）的混合物耦合到三重四极质谱仪（LC-QQQ-MS（/ MS））C系。 使用配有填充用C-18介质（≤5微米直径，?200埃的孔，长度≥10厘米，编号= 50-100微米）的毛细管柱的LC-MS系统和纳米ESI尖（使用通常产生激光拉出器）。保证每个LC-MS运行包括?60分钟线性梯度（通常，0-40％溶剂B），一个柱再生步骤（?80％溶剂B），和一列再平衡步骤（?0％溶剂B ）（溶剂A = 0.1％体积/体积的甲酸中的H 2 O，溶剂B = 0.1％体积/体积的甲酸的ACN，流速= 200-800升/分钟，ESI电压= 1800伏，Q3隔离宽度= 0.7米/ Z，q2的氩气压力= 1.5毫乇）。 对于每一个母离子扫描，动态地选择顶部?10最激烈的前体离子进行串联质谱（MS / MS）。运行一式两份每个样品使得两个不同的碰撞能量升高使用：一种设计成最佳地分段2的前体离子，而另一个为+3母离子41。 在LC-QQQ-MS（/ MS）分析使用Q3母离子扫描（Q1母离子扫描可能会导致从低能量碰撞氩第二季度产生的前体离子峰拖尾）执行。 确保LC-MS系统由分析QC样品和技术复制充分执行。用新鲜的液相色谱柱和样品之间运行多个空格防止样品残留。 分析用数据库检索针对的外部肽标准42的序列所得到的鸟枪LC-QQQ-MS（/ MS）数据。如果适当的话，则丢弃使用肽识别置信得分（ 例如 ，期望的值），或者通过使用统计建模42暧昧肽鉴定。无论如何，人工审查所有的肽鉴定43，以确保他们都毫不含糊。 使用猎枪MS肽鉴定精读结构体使用的软件程序的光谱库如天际线。 使用每个母离子（3-10最激烈的过渡准备LC-SRM过渡列表+2和+3母离子; +1和+2碎片离子; Y，B超，以及离子是≥2残留长）。 丢弃一个过渡如果前体离子和碎片离子m / z值的QQQ-MS的质量测量精度内重叠（前体离子碎裂有时是不完全的;记得要考虑单同位素和重天然同位素的形式，以及未标记的和重标记的形式）。 同样地，丢弃的过渡，如果碎片离子M / Z，来自相同的前体离子不同碎片离子的重叠。 使用所得到的过渡列表来执行的LC-SRM分析的外部肽标准混合物（如步骤3.1中所述进行质谱; Q1和Q3隔离宽度= 0.7 M / Z;停留时间= 2-50毫秒）。 嘛nually查看生成的LC-SRM数据并删除任何表现不佳的测定（LC-SRM数据的第5节中描述的分析）。 生物样品4 LC-SRM测定准备培养的细胞44的菜肴。如果多个实验条件进行比较，块与随机样本，以减少任何可能的系统性偏差45。 对于每个细胞培养皿，吸出细胞培养基浪费和悬浮细胞在无血清缓冲器44。如果必要的话，洗涤细胞在无血清缓冲以除去任何剩余的细胞外蛋白质。 对于每个样品，通过使用存活力染色（ 例如 ，台盼蓝）和血球或自动细胞计数器44计数存活和总细胞数。 沉淀细胞通过离心，并吸出上清液浪费44（典型的细胞沉淀体积是?30微升）。 <lI&加入400μl尿素的裂解缓冲液，或表面活性剂的裂解液，以每个细胞沉淀（100毫米的HEPES?氢氧化钠pH为8，10μM苯丁抑制素盐酸盐，10μM胃酶抑素A，和任8M尿素或0.1％w / v的表面活性剂（分别为）;新鲜制备的;使用酸不稳定的MS兼容的表面活性剂如RapiGest SF或PPS无声表面活性剂）。如果使用其他的蛋白酶抑制剂，确保它们不抑制胰蛋白酶。 经轻轻吹打混匀每个样品，每个转移到2 ml管（带旋盖与O形环）含有?100微升为0.1mm的氧化锆/硅珠（注意该珠可导致卡扣帽管泄漏）。裂解的细胞通过涡旋样品5分钟以全速（这使细胞溶解通过珠击）。 可替代地，使用不同的机械方法裂解细胞（ 例如 ，使用一个法式压滤或均质化的提示）。 注意：避免离心细胞裂解物，因为这可能会沉淀沉淀的蛋白质，可以加时赛herwise被tryptically消化并通过LC-MS检测。 为表面活性剂变性的样品，孵育它们在90℃下进行10分钟，以帮助样品均质化和蛋白质变性。 浴超声处理样品10分钟，在室温下，以协助均质化和蛋白质变性。 注意：裂解物与裂解缓冲液可以储存在-80℃（裂解缓冲液将用于步骤4.9和4.13）。 执行的裂解物的蛋白质浓度测定46（ 例如 ，一个二辛可宁酸测定法）（和裂解缓冲液作为对照实验的）。 对于定性分析（ 即 ，没有内部肽标准将飙升，到样品）的细胞裂解液，吸管200微克（蛋白质量）到一个新的1.5 ml离心管。对于定量分析，准备四个这样的样本稳定同位素稀释系列。 对于每个样品，添加内部蛋白质的标准（ 例如&/ em&的，加5?皮摩尔的?98％的纯萤火虫荧光素酶）。 对于定量分析，添加稳定同位素稀释系列的内部肽标准的等摩尔混合物（ 例如 ，0，0.2％，2，20皮摩尔的每种肽）的样品。 同时，使用内部肽标准单独准备对照样品（ 即无细胞裂解物）（ 例如 ，0，0.2，2，20皮摩尔各肽）。 还准备使用外部和内部肽标准对照样本（例如：2皮摩尔每个外部肽标准，和0，0.2％，2，和20皮摩尔各内部肽标准的）。 注：可以肯定的肽标准都是免费的甲酸，因为它可能与胰酶消化干扰。 添加裂解缓冲液，使所有的样品是相同的卷。注意：典型的样品体积是70微升，所以该体积将被用于这个协议。 通过加入0减少蛋白质的半胱氨酸残基。7微升的1M DTT（新鲜制备的）向每个样品（最终的DTT浓度为10毫摩尔）并进行培养的样品，在60℃下进行30分钟。 烷基化蛋白胱氨酸加入缓冲碘乙酰胺的7微升（500毫碘乙酰胺，1M HEPES?氢氧化钠pH值8;新鲜制备）向每个样品（终碘乙酰胺的浓度为50毫摩尔）和在室温下孵育样品20分钟在黑暗（碘乙酰胺对光敏感）。如果必要的话，加入DTT至50mM的终浓度淬灭残留的碘乙酰胺。 对于每个样品使用尿素变性，加入482微升100mM HEPES?氢氧化钠pH为8，使最终的脲浓度为1M的（胰蛋白酶在& 1M尿素47显著抑制）。
Tryptically消化蛋白成肽。 为每个包含细胞裂解物样品中，添加8微升0.5微克改性/微升测序级胰蛋白酶，使最终的胰蛋白酶concentrat离子是1:50（蛋白质重量：重量）胰蛋白酶：样品，孵育的样品在37℃下18小时。 对于每个样品不包含细胞裂解物，加0.5微克/微升测序级改良的胰蛋白酶0.5微升，孵育所述样品在37℃进行2小时（每个样品是对照实验中，并通常仅包含10纳克-10微克肽+蛋白质质量）。 对于每个尿素变性的样品，加入440微升2％体积/体积的甲酸（终甲酸浓度为1％体积/体积）。确认这些样品为pH?3。 对于每个表面活性剂变性的样品中，添加914微升0.5％体积/体积的TFA（最终TFA浓度为0.5％体积/体积）。确认这些样品是pH约1.5。孵育这些样品在37℃下60分钟以水解的表面活性剂。 微量所有样品在21000×g的20分钟，在室温以沉淀表面活性剂尾部基团和任何其它PRECipitates将堵塞一个C-18 SPE柱。 使用一次性的C-18 SPE柱固相提取每个上清液（缓冲液A = 0.1％体积/体积甲酸;缓冲液B = 0.1％体积/体积的甲酸，80％体积/体积乙腈;?100毫克C-每盒18树脂）。使用平浮出水面橡胶管，或通过离心盒在15ml离心管在10×g下5分钟强迫通过C-18 SPE柱的流动相，使用提取歧管。 湿通过施加1毫升缓冲液B的柱，平衡它通过施加1毫升缓冲液A洗涤2次，应用该样品，并通过施加1毫升缓冲液A洗两次墨盒。通过施加1毫升缓冲液B的缓慢（?2分钟）洗脱的肽。 集中在真空浓缩各洗脱液以100μl的蒸发远ACN的终体积。加入200微升的H 2 O操作每个样品，每个在真空浓缩器浓缩至98微升的最终体积，以蒸发掉任何可能的重新maining ACN。 添加微升的5％2体积/体积的甲酸的ACN至每个样品（最终样品浓度是0.1％体积/体积的甲酸，2％体积/体积乙腈）。 注：样品可以贮存于-80℃。 分析用LC-SRM中的样品（如步骤3.4）。定性的LC-SRM分析，运行生物样品和外部肽标准，和分析所有得到的数据组合在一起。进行定量的LC-SRM分析，运行同位素稀释系列的每种生物样品的，并且还运行由单独的肽的标准样品，和分析所有得到的数据组合在一起。
5. LC-SRM数据分析注：肽鉴定和定量，可以高度简化和使用软件如地平线部分自动的，但它仍然是强烈建议所有的数据注释进行人工审查。此外，最好是排除手动ANNOT期间蛋白质级信息LC-SRM数据的通货膨胀，防止偏差。 对于每种肽鉴定，确认每个过渡洗脱曲线的形状是大致高斯。对于每一个过渡，确认洗脱曲线是由MS检测器测量多个信号的乘积（ 即 ，不是一个或两个随机尖峰MS噪声的产物）。 对于每个肽识别，确保了整个肽洗脱曲线选择。避免手动调节的肽鉴定（重标记肽的形式中，未标记的形式，从个人前体离子，和个体的过渡）子组件的洗脱曲线边界。 确认每个过渡洗脱轮廓具有信噪比（S / N）≥3。注：“噪音”是指随机MS噪音，无共流出分析重现的信号。色谱平滑功能可以大大有助于噪声数据的分析。 对于每个肽鉴定，确认所有的转换的具有几乎相同的洗脱曲线（不只是等于峰顶倍;洗脱曲线可以具有不同的幅度）。 对于LC-SRM分析大量的肽标准（通常≥100fmol的每个肽）的，确认相应的肽洗脱曲线是非常激烈的（通常是S / N≥100），那肽鉴定是毫不含糊的。注意：这些高度自信标识将用于相应来源于生物样品的肽的鉴定关键的。 对于每个肽鉴定，确认该转型相对强度匹配的理直气壮识别肽标准。如果必要的话，抛弃喧嚣，相对低强度的过渡洗脱曲线，但确认没有一个相对激烈过渡丢失。无视那些显著，毫不含糊地受共相对激烈的过渡洗脱曲线洗脱污染物。 对于每个肽鉴定，估计它是随机（共流出分析随机MS噪声加重现的信号）生产的背景信号的概率。 通过检查整个LC-SRM色谱图，并估计每个肽识别的唯一手动估计这个可能性。产生一组的信心肽鉴定具有5％的估计假发现率（FDR）。用更严格的标准（ 例如 ，罗斯福≤1％），如果一个更高的信心设置标识的要求（使用标准更加宽松，不推荐）。 或者，使用mProphet算法48或审计算法49，但手动检查的结果。 对于每种肽鉴定，确认所观察到的洗脱时间与该肽的疏水性是一致的（地平线被设计来执行此计算）。 对于每个肽，确认其洗脱时间是横跨LC运行一致。 注：LC-SRM分析有时会产生是运行系统之间的扭曲洗脱曲线。系统性的变化是改变仪器如更换色谱柱之后可以预期的。此外，早期洗脱肽可以容易移位（尤其是如果列装载接近容量），和晚期洗脱肽还可以容易移位。肽鉴定现已完成。 为了提高肽量化，每个复检鉴定肽和丢弃的过渡洗脱特征，如果它相比的肽识别其它过渡洗脱曲线特别吵。丢弃一个过渡洗脱曲线如果其相对跃迁强度是错误的（相对于肽标准）。 检查每个前体离子和过渡洗脱曲线的边界。如果有必要，仔细调整洗脱轮廓边界裁剪客场背景信号（或我背景的mProve信号估计）。 对于每一个内部肽标准，检查其是否与污染轻肽的检测量（由LC-SRM决定单独分析的内部肽标准，如上所述）。随后，丢弃任何光线肽洗脱配置文件是显著由光污染肽中的内部肽标准大打折扣。 通过计算其LC峰面积量化每个过渡洗脱曲线。如果适当的话，扣除所估计的背景信号。总结了相应的过渡量化值量化每种肽的洗脱曲线（以下，这被称为“Sum_Peak_Area”值）。对于每个生物样品肽Sum_Peak_Area值，使用从数据计算的生物样品的肽的摩尔丰度的LC-SRM的内部或外部的肽标准（仅使用已成功由两个生物样品肽定量的过渡LC-SRM和该肽标准）。 定量使用外部肽标准（不推荐）： 剧情外肽标准Sum_Peak_Area值与外部肽标准摩尔丰度值。产生的标准曲线拟合线性回归的数据（典型地，应使用的动态范围的唯一的线性分量;任何非线性分量应极度小心使用）。对于每一个生物样品肽Sum_Peak_Area值，用标准曲线计算肽摩尔丰富。 注意：此定量方法不可取，因为它要求该样品制备和LC-SRM是可论证健壮，因为生物样品和外部的肽标准制备和分析通过LC-SRM分开。此外，它不考虑基体效应（由于样品比分析物以外的成分的影响）。 使用内部定量肽标准（推荐）： 对于每一个生物样品肽Sum_Peak_Area值和对应的重标记的内标肽值Sum_Peak_Area，计算轻/重比。使用这个比率，为相应的轻/重肽摩尔丰度比的测量来计算所述生物样品的肽的摩尔丰度。具体地，所述生物样品的肽的摩尔丰度等于内部肽标准摩尔丰度乘以轻/重Sum_Peak_Area比率。 对于每个生物复制和目的肽，通过使用线性回归产生的标准曲线确定的LC-SRM定量的线性范围。具体地，绘制内部肽标准摩尔丰度值相对于重/轻Sum_Peak_Area比率值（请注意，该生物样品的质量是恒定跨数据集）。要求每个生物样品肽Sum_Peak_Area值的线性范围内（typic同盟，动态范围的唯一的线性分量应该使用;任何非线性元件应谨慎使用）。同样，要对每个目标肽转换这一步骤。 注意：分析物定量通过LC-QQQ-SRM应该是线性的在宽动态范围（?10,000）。在低端，背景信号（随机MS噪声加上来自共洗脱被分析物可重现信号）将减少量化准确度和精度。在高端，检测器的饱和会导致非线性（最终，这将导致洗脱曲线是平的起始处的特定信号强度）。 如果适当的话，则执行整个样本，一个全球正常化诸如中央倾向正常化50，以校正尖峰-中的内部肽标准之前在样品量略有不同。如果必要的话，只能使用从1.1步的看家蛋白质。 如果有必要，填充缺失quantificat离子值51,52。 注：这是不正确的，以简单地量化（LLOQ）或检测（LOD）一半的极限下限的一半替换缺失值，因为这样做会人为地降低量化差异，并可能导致一个统计检验（ 例如 ，方差分析）产生假阳性结果（一类错误）。然而，忽略缺失值也可以是有问题的。例如，如果一半的真实丰度值低于检测限，而另一半是LLOQ以上，则平均观测丰度会高估平均真实丰富。 确保检测符合广泛接受的准则LC-SRM 23-25。值得注意的是，要求该定量值的变化系数是通常用于临床试验≤25％，对于非临床试验25≤35％。对于相关医疗或兽医产品或服务的LC-SRM测定所应考虑的法规的应用程序ROVAL，要求该测定法满足用于此类测定法的更严格的精度要求：“在每个浓度水平测定的精度不应该超过的变异系数（CV），除了LLOQ，它不应该超过的20％的15％ CV“23,24。 Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
的信号转导通路预测计算模型的开发是系统生物学53的基本目标之一。不幸的是，即使对于信令已被广泛研究，并具有高的临床意义的途径，它仍然是一般不可能定量预测响应于扰动通路行为（ 例如 ，这是真实的MAPK / ERK通路54）。近日，一项调查采用有针对性的蛋白质组学，转录和计算机建模和仿真研究小鼠巨噬细胞的趋化信号通路56。调查的重点是RAW 264.7细胞（小鼠单核细胞/巨噬细胞系）的鞘氨醇-1-磷酸介导的趋化性。为了方便途径建模，LC-SRM测定法开发并以测量的RAW 264.7细胞中的趋化途径蛋白的绝对丰度。由此产生的丰度值均使用d为1的路径模型的参数。 整体实验方案（ 图1）开始与靶蛋白，其包括?i2的 ，一个异G蛋白α亚单位的列表。整体协议的成功在很大程度上依赖于肽的目标是蛋白典型和quantotypic，如YDEAASYIQSK选择。制备并通过鸟枪LC-QQQ-MS（/ MS）分析的外部肽标准混合物。所得YDEAASYIQSK串联质谱组成几个碎片离子，并且它具有低的背景（ 图2）。光谱被用来撰写包含每个母离子十大最激烈的碎片离子LC-SRM目标名单。
409外部肽标准（“JPT409”）的混合物中一式三份进行定性LC-SRM分析（数据未示出）。此示例包括三项摹I2肽，三个人的鉴定判断有信心。随后，RAW 264.7样品（生物复制“RAW1”和“RAW2”）和JPT409样本分别重复进行定性的LC-SRM分析（两个LC-SRM技术重复）（这六个LC-SRM分析，进行与类似地可能的话）。该YDEAASYIQSK肽自信地在所有六个分析鉴定（ 图3A - C）。所述YDEAASYIQSK过渡强度图案是一致的六种LC-SRM分析，并且这些均大致类似于鸟枪LC-MS（/ MS）图案（以下简称“库”复制图3C的）。 过渡强度的图案单独并不总是足够的信任识别的肽。该肽的疏水性和测定LC保留时间必须一致。另外，外部的肽标准和相应的生物样品的肽必须具有大约等于保留时间。疏水性和YDEAASYIQSK的观察保留时间（使用SSRCalc版本3.0 100埃算法55估计）被发现是一致的（ 图4A）。另外，YDEAASYIQSK保留时间，使用中，RAW 264.7分析和外部肽标准分析测得的，并且所有的保留时间的值大致相等（ 图4B）。 大多数定性LC-SRM的分析生物样品是成功的，所以相应的重标记，纯化，定量的制备和掺入-RAW到264.7细胞裂解液内部肽标准。同位素稀释串联LC-SRM用于分析组成的单独的内部肽标准（样品“R0”），内部和外部的肽标准（样品“R1”），和六的RAW 264.7生物学重复（样品“R2”样品 - “R 7”）。各色二nt的蛋白质变性剂被用来测试对可能有损精确的目标蛋白质定量的任何可能的蛋白质溶解，变性，烷基化，和/或消化问题（样品R 2 -R 4中使用尿素和样品R5?R7中使用RapiGest SF）。轻，重形式YDEAASYIQSK包含几乎相同强度的过渡模式和洗脱曲线（ 图5A - C）。 LC-SRM求和的峰面积比被用作相对的肽丰度的量度，并且YDEAASYIQSK比值被用来计算在每个的RAW 264.7细胞拷贝的单位?i2的丰度值。与此同时，一个第二?I2内部肽标准（IAQSDYIPTQQDVLR）被用来进行相同的RAW 264.7样品的定量?i2的 LC-SRM测定法，和两种测定产生跨所有生物学重复的高度相似?i2的丰度的测量（ 图5D）。这两个图G的协议<s与ub& i2的测定法是强有力的证据，这两种肽是quantotypic，并且所有的定量?i2的 LC-SRM测定中是准确的和精确的。 总体而言，35蛋白用58内部肽标准（ 表1）定量。值得注意的是，内部蛋白质标准的LC-SRM测定（萤火虫荧光素酶;步骤4.11）是准确的和精确的。从本次调查的综合组天际线数据可在全景网LC-SRM数据库（在Manes_RAW_Chemotaxis文件夹中https://panoramaweb.org/labkey/project/NIH_NitaLazar/begin.view）。
图1：该协议三暂定目标肽对于G i2的 概述 （一个异G蛋白α亚单位）被选定为外部肽标准合成。这些都是ANALY通过鸟枪LC-MS（/ MS）捷思发展3?i2的 LC-SRM测定法，和这些测定法用于执行生物样品的定性分析。所有这三个摹I2目标肽进行了鉴定，和两个被选定为内部肽标准品。胰蛋白酶裂解的“JPT-标签”被用来量化使用紫外分光光度法的内部肽标准。内部肽标准被用来进行定量摹I2 LC-SRM RAW 264.7样本化验。
图2：鸟枪LC-MS（/ MS）所描绘的质谱源于对G i2的外部肽标准（YDEAASYIQSK）之一的分析。对于这种前体离子，十大最激烈的转变中（由于其短长，不包括A1 1+碎片离子）选择LC-SRM。
图3：定性LC-SRM?i2的从 JPT409的YDEAASYIQSK色谱分析含有非常低的背景和肽自信地鉴定（A）中 。相应的RAW 264.7分析导致更多的背景信号，但该肽鉴定仍明确的（B）中 。相对跃迁强度模式是一致的，所有六个LC-SRM分析（三个独立样本两次技术重复），而这些人大致西米LAR到相应的猎枪LC-MS（/ MS）的模式（以下简称“图书馆”复制）（C）。
图4：肽滞留时间预测和变化跨越运行使用估计的疏水性线性回归来计算和测量的所有目标肽的定性的LC-SRM洗脱时间，和YDEAASYIQSK的预测值和测量的洗脱时间是一致的（A）中。 。此外，横跨LC-SRM每种肽的观察到的洗脱时间的一致性分析进行测定。 YDEAASYIQSK的洗脱时间跨越一系列?40秒，这是与LC-SRM仪器所使用的精度是一致的（值是峰顶时+/-在半最大值全宽，以及在峰值的底）（B）的全宽。
图5：定量的LC-SRM?i2的生物样品的肽（A）和内部肽标准（B）的一致的相对跃迁强度的过渡色谱图，并进行了总结（℃）（描绘为“R2”分析对于YDEAASYIQSK使用10 fmol的内部肽标准）。轻和重洗脱曲线是一致的（C）中 ，并在这些曲线的面积的比率被用作韧带的量度HT /重型肽丰富。第二?i2的内部肽标准（IAQSDYIPTQQDVLR）用于定量的LC-SRM平行，且产生的G i2的丰度值分别通过这两个六个生物学重复和两个靶肽（整体一致，每组12和CV = 8.38 ％）（D）。
UniProt登录靶蛋白目标肽丰度（飞摩尔/微克） 丰度（拷贝/细胞，标准化） 简历 P08659 荧光素酶 （UV在280纳米）
P08659 荧光素酶 VVDLDTGK
P08659 荧光素酶 VVPFFEAK
P60710 肌动蛋白，细胞质1
IWHHTFYNELR
LISWYDNEYGYSNR
P06151 乳酸脱氢酶 LLIVSNPVDILTYVAWK
P99024 微管蛋白β5
ALTVPELTQQVFDAK
P20152 波形 SLYSSSPGGAYVTR
QKPITPETAEK
ETLYETIIGYFDK
ISSSPTHSLYVFVR
ALTTKPSSLDQFK
SAIDISILQR
WTAPEAALFGR
GIHEYDFEIK
&TD& 68467
VFLQYLPAIR
Gα（i）两 IAQSDYIPTQQDVLR
Gα（i）两 YDEAASYIQSK
EYQLNDSASYYLNDLDR
ISQTNYIPTQQDVLR
AGVLAGHDNR
DALLLGVPAGSNPFR
36％ </TR&
EDPLLTPVPASENPFR
GPVYVPDPTSSSK
IIEDNEYTAR
P43406 整合素αv
AGTQLLAGLR
P43406 整合素αv
SHQWFGASVR
VIEDNEYTAR
PI3K的监管5
AGFPGILDTASPGK
PI3Kα监管 LYEEYTR
PI3Kα监管 TWNVGSSNR
PI3Kα监管 VLSEIFSPVLFR
PI3K调节β
DTPDGTFLVR
PI3K调节β
HEVQEHFPEALAR
ITEEEQLQLR
PIP3 5磷酸酶1
IVVLAKPEHENR
PIP3 5磷酸酶1
LSQLTSLLSSIEDK
PIP3依赖Rac的全球环境基金1
DSVLSYTSVR
PIP3依赖Rac的全球环境基金1
ASSQVNVEGQSR
WASSLENLLEDPEGVQR
AEANQHVVDEK
LIYEDYVSILSPK
B9EKC3 卢GAP 5
DGLAQELANEIR
Q99PT1 卢GDI 1
SIQEIQELDK
Q99PT1 卢GDI 1
VAVSADPNVPNVIVTR
Q61599 卢GDI 2
Q61599 卢GDI 2
Q61210 卢GEF 1
FDGAEGSWFQK
Q61210 卢GEF 1
SGLELEPEEPPGWR
RhoA的 QVELALWDTAGQEDYDR
GAFGEVQLVR
LEGWLSLPVR
S1P裂解酶1
AGYPLEKPFDFR
S1P裂解酶1
TPEIVAPESAHAAFDK
表1：LC-SRM RAW定量264.7细胞蛋白三十五个RAW 264.7细胞蛋白用58的内部肽标准和六个生物学重复量化。五个目标蛋白质中，持家蛋白（肌动蛋白，GAPDH，乳酸脱氢酶，微管蛋白，和波形蛋白），并进行量化，以使整个生物样本（步骤1.1）正常化。此外，内部蛋白质标准物掺入-到每个细胞裂解液和定量通过LC-SRM（4.765皮摩尔每萤火虫荧光素酶的200微克样品; 98％的纯度通过SDS-PAGE;在280nm处定量分光光度;步骤4.11）。该CV值计算整个使用全球标准化的丰度值六生物学重复（除萤光素酶;步骤5.15）。 Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
绝对蛋白定量是生物医学应用，如生物标志物验证和信号转导通路造型非常多元化至关重要。近日，采用LC-SRM针对性的蛋白质组学得益于改进众多技术，包括肽标准配制，HPLC，QQQ-MS和LC-SRM数据分析。因此，它已成为一个强大的替代免疫。免疫测定可以是非常敏感的，高通量的，但开发强大的免疫测定可以是非常具有挑战性的，因为免疫测定可以是易受交叉反应性和/或干扰，不符合细胞/组织裂解/均匀化的方法，和/或不适合进行复5,8。例如，最全面的测试交叉反应性是执行使用源自基因敲除，这可以是具有挑战性，制备样品的免疫测定。 本协议描述的目标PEPTIDE的选择，LC-SRM研发分析，定性和定量LC-SRM，和LC-SRM数据分析。它被用来测量的RAW 264.7细胞56内的绝对丰度的36趋化途径蛋白，但其适用性远远超出这个具体应用。虽然它的目的是要量化细胞沉淀中的蛋白质，它可以用于其它生物样品（ 例如 ，生物流体）以及其它的SRM目标（ 例如 ，磷酸）的分析来调节。例如，改变均质化和/或蛋白质的消化协议可显著改善溶解，变性，烷基化，消化，并量化特别困难的靶蛋白（ 例如 ，膜蛋白），或者可能使特别具有挑战性的样品（ 例如 ，样品的分析含&100微克蛋白质量）。 最初选择的目标肽是关键的，但可能是耗时的。对于hundre靶蛋白的ds，特设评分可用于为每个标准和暂定目标肽可以基于分数之和来排序，如先前已56完成。另外，这种分析可以使用PeptidePicker，一个Web界面，大大简化了目标肽选择30被自动化（/）。 后的目标肽已被选定和LC-SRM分析被开发出来，该生物样本的定性的LC-SRM测定法来进行，因为即使一个高度蛋白典型和quantotypic肽不会被检测，如果该蛋白的表达在这一点至关重要低于仪器的灵敏度阈值水平，或如果背景干扰是特别有问题的。分离的第二维度（ 例如 ，强阳离子交换HPLC，高pH值反相HPLC，和无凝胶电泳）可以增加蛋白质的深度，但将需要显著更多仪器时间和数据分析。可替代地，富集策略（ 例如 ，肽和蛋白质水平immunoenrichment和细胞分级）能提高蛋白质组深度，高度丰富的蛋白的免疫耗竭可用于通过共洗脱被分析物，以减少干扰。
LC-SRM的数万?样品?数百或数千?过渡通常需要大量的仪器的时间。尽管它不用于本研究中，LC-SRM调度（在预先指定的洗脱时间窗测量过渡）使得能够每次运行多个转换的分析。此外，调度减少在LC梯度的相对空闲时期在SRM占空比，并且这可以导致改进的肽鉴定和定量。然而，调度要求肽洗脱时间满怀信心从定性LC-SRM分析确定。微妙的变化样品制备到的LC-MS仪器，或LC-MS方法会导致调度作物甚至完全错过目标肽。例如，生物样品YDEAASYIQSK洗脱曲线轻微相对于那些外肽标准（ 图4B），这可能是由于基体效应移位。 总之，一步一步的协议提出了LC-SRM的绝对蛋白定量的开发和应用。蛋白质通过LC-SRM的绝对定量已被证明是可再现的实验室16,19之间。蛋白质组学技术，包括样品制备（ 如 ，自动化），液相色谱法，质谱法，和数据分析，正在迅速提高，并且正在使LC-SRM成为实用的大规模研究和临床应用。特异性，灵敏度，准确度，重现性和高通量定量LC-SRM使它成为强大的工具，基础研究和生物医学。 Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Catalog Number
Acetonitrile (ACN), LC-MS grade
BCA (bicinchoninic acid) protein assay kit
Beads for bead beating, zirconia-silica, 0.1 mm
BioSpec Products
Bestatin hydrochloride
B8385-10MG
Cell culture DMEM (with glucose, without L-glutamine)
Cell culture EDTA, 500 mM, pH8
Cell culture fetal bovine serum (FBS)
Atlanta Biologicals
Cell culture L-glutamine
Cell culture phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4
Cell culture Trypan Blue viability stain, 0.4% w/v
Cellometer Auto T4 cell counter
Nexcelom Bioscience
Cellometer Auto T4
Cellometer Auto T4 disposable counting chambers
Nexcelom Bioscience
CHT4-SD100-014
Dithiothreitol (DTT)
Formic acid, LC-MS grade, ampules
A117-10X1AMP
Hemocytometer, Neubauer-improved, 0.1 mm deep
Marienfeld-Superior
HEPES, 1 M, pH 7.2
Hydrochloric acid, 37% w/w
Iodoacetamide
Laser Based Micropipette Puller
Sutter Instrument Co.
LC coated silica capillary, 50 &m id
Polymicro Technologies
LC vial, autosampler, 12 mm x 32 mm polypropylene
LC vial screw cap, autosampler, pre-slit PTFE/silicone
Luciferase, from Photinus pyralis
Pepstatin A
EMD Millipore
pH strips colorpHast (pH 0.0-6.0)
EMD Chemicals
PhosStop phosphatase inhibitor cocktail
RapiGest SF
Sep-Pak SPE, C18 1 ml 100 mg cartridge
Sep-Pak SPE, extraction manifold, 20 position
Sep-Pak SPE, flat-surfaced rubber bulb
Sodium hydroxide (NaOH)
SpeedVac vacuum concentrator
Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade
Trypsin, sequencing grade, modified
Tube decapper for Micronic tubes
USA Scientific
Tubes, 2 ml microcentrifuge, o-ring screw-cap, sterile
72.694.006
Water, LC-MS grade
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Mol Cell Proteomics. Forthcoming.
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