双缩脲法测定血清总蛋白实验报告(共5篇)
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双缩脲法测定血清总蛋白实验报告(共5篇)
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篇一：双缩脲法测定血清总蛋白的方法学评价
双缩脲法测定血清总蛋白的方法学评价
摘要：目的
评价双缩脲法测定血清总蛋白的方法性能。方法
配制双缩脲试剂，并用所配双缩脲试剂和标准血清蛋白进行批内重复性试验、回收试验、线性范围测定。结果
双缩脲法测定血清总蛋白的批内重复性试验的变异系数CV%为6.42，回收试验平均回收率为109.3%，线性范围测定的R2为0.9877。结论
双缩脲法测定血清总蛋白的性能不高，本人测得的批内重复性试验的变异系数CV%偏大，回收率偏高，线性范围一般，或许这是个人操作因数，因为还有其他同学的结果比较好的。 关键词：双缩脲法；血清总蛋白；方法学评价 双缩脲法测定血清总蛋白至今已经有近100年的历史，其间该方法也得到不断改进，是目前测定血清总蛋白的常用方法之一。《全国临床检验操作规程》推荐Doumas双缩脲配方作为血清总蛋白测定的常规方法[1]。方法学评价对于医学检验专业学生日后在工作中评价检验方法非常重要，对培养学生逻辑思维和实验室质量控制具有重要作用。本文介绍双缩脲法测定血清总蛋白的方法学评价，对学生练习和掌握方法学评价有重要意义。 双缩脲试剂鉴定蛋白质的原理：双缩脲（NH2CONHCONH2）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与二价铜离子形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似的肽键，因此，也能在碱性环境中与二价铜离子结合生成紫红色络合物。此反应不需要加热，被用来定性鉴定蛋白质。但请注意：凡含有2个以上肽键的物质或含有1个肽键和1个一CS—NH2、一CH2一NH2、一CH20H、一CHOHCH2NH2等基团的物质，以及乙二酰乙二胺都有此颜色反应。因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽均有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽[2]。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差，不适合微量蛋白的测定。
1. 仪器与试剂 1.1 仪器 721型分光光度计；水浴箱。 1.2 试剂 牛血清白蛋白；硫酸铜结晶(CuSO4?5H2O)；酒石酸钾钠(NaKC4H4O6?4H2O)；氢氧化钠(NaOH)；碘化钾(KI)；蒸馏水。
2. 双缩脲的配制 2.1 称取6g NaOH溶于新鲜制备的25 ml蒸馏水中，配成6mol/L氢氧化钠溶液。 称取0.75 g硫酸铜，2.25 g酒石酸钾钠，1.25 g碘化钾依次溶解于125 ml蒸馏水中．在搅拌下加人6mol/L氢氧化钠溶液25 ml，用蒸馏水定容至250 ml。配好的双缩脲试剂应贮存于塑料瓶中(或内壁涂以石蜡的瓶中)。此试剂可长期保存，若瓶中有黑色沉淀出现则衙重配。
2.2 通常加入碘化钾可以防止铜离子自动还原形成一价氧化铜沉淀。在配制双缩脲试剂过程中，进行两种不同加试剂顺序，如下 顺序1：硫酸铜→酒石酸钾钠→碘化钾→氢氧化钠 顺序2：硫酸铜→碘化钾→酒石酸钾钠→氢氧化钠 这两种顺序的区别是加酒石酸钾钠和加碘化钾的顺序不同，“顺序1”在加完酒石酸钾钠后溶液是青蓝色的(如图1左)，“顺序2”在加完碘化钾后溶液颜色是褐色的(如图1右)，但两种顺序在加完所有试剂后，颜色都是相同的，都为深蓝色，如图2。这两种不同加试剂顺序的配制方法，虽然过程不同，过程中颜色变化也不同，但最后的结果是相同的。 图1 (左为先加酒石酸钾钠) 图2 (左为先加酒石酸钾钠)
3. 批内重复性试验 3.1 材料 待测样品、双缩脲试剂、蒸馏水、721型分光光度计、水浴箱 3.2 方法 3.2.1 取21支试管放试管架，分别标记空白管1支，重复测定管20支，按表1添加试剂。 表1
试剂添加3.2.2 涡旋混匀后，37℃水浴10分钟，在波长540nm条件下比色，空白管调零，用分光光度计测定各管吸光度。 3.2.3 计算待测样品的标准差S和变异系数CV%值。 3.3 结果 3.3.1 结果记录 3.3.2 批内重复性试验结果处理 计算公式标准差 s? (x?) 2 ?(n?1) ，变异系数CV%?(s?)?100 标准差s=0.0086，变异系数CV%=6.42 3.4 讨论评价 3.4.1 批内重复性试验测得数据的CV%=6.42，CV%值比较大，超过4.0，说明测定的精密度比较低。原因可能有以下几点： ①实验中使用的分光光度计比较老旧，一直性能不稳定，多位同学使用后都表示结果不太好。 ②使用的加样枪很多都老化了，不好用，导致封密性不强，实验误差大。 ③个人加样误差，在一些关键试剂上加样可能有误差。 ④所使用的比色杯经过多次使用，比色杯壁里遗留一些有色物质，影响了测量结果。
3.4.2 通过10位同学结果的比较，如表3，有五位同学的结果小于4，另五个同学的结果大于4，最大的CV值是本人测得，说明本人的结果比较差，双缩脲法测定血清总蛋白的精密度不算太好。 4. 回收试验4.1 回收试验原理 回收试验是反映分析方法准确测定加入样品中已知浓度或量的纯分析物能力的试验，是评价方法准确度的有效方法。回收试验可有效反映方法的比例系统误差，也可反映方法的竞争性干扰。 本实验通过双缩脲法测定蒸馏水中加入的蛋白质的回收率，判断双缩脲法比例系统误差的大小，从而评价方法的准确性。 4.2 回收样品制备4.3 蛋白质浓度测定 4.3.1 蛋白质浓度测定的加样，如表5注：空白管和样品管各做一管，样品管每个样品做2管取平均值，共计1+1+2+2+2+2=10管。 4.3.2 涡旋混匀后，37℃水浴10分钟，在波长540nm条件下比色，空白管调零，用分光光度计测定各管吸光度。 4.4 结果 4.4.1 结果记录 篇二：血清总蛋白测定(双缩脲试剂法)
生物化学实验
专业年级：
生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称 血清总蛋白测定（双缩脲试剂法） 实验地点 指导老师 教师签名 第五实验室 实验日期
合作者 评分
批改日期 一、实验目的 1、掌握双缩脲测定血清总蛋白的基本原理、操作； 2、熟悉血清总蛋白的临床意义； 3、了解双缩脲法测定血清总蛋白的特点和注意事项。 二、实验原理 （一）：双缩脲反应 在碱性溶液中,双缩脲(H2NOC－NH－CONH2)能与Cu2+作用,形成紫色或紫红色的络合物,这个反应叫做双缩脲反应。两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2），因分子内含有两个邻接的肽键，在碱性溶液中可与Cu2+发生双缩脲反应 ，生成紫红色络合物；蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键（-CO-NH-），同样能在碱性条件下与Cu2+发生双缩脲反应，生成的紫红色络合物，且在540nm处的吸光度与蛋白质的含量在10～120g/L范围内有良好的线性关系。 三、材料与方法： 实验材料 样品：大牛血清 试剂：双缩脲试剂、蛋白质标准液（70g/L）、生理盐水（0.9%） 器材：试管、加样枪、刻度吸管、洗耳球 设备：1100分光光度计、水浴锅实验步骤 四、结果与讨论： （一）：实验结果 1、实验现象： a、在实验中首先加入双缩脲试剂，再依次加入0.9%氯化钠溶液、蛋白质标准液、相应的大牛血清后溶液没有明显的颜色变化，呈淡蓝色透明状；b、水浴20分钟之后，B试管试管显淡蓝色；S试管和U试管显浅紫色且S试管的颜色比U试管的颜色稍深。 2、实验数据： 管号 测定次数 平均吸光度
3 S 0.70.1873
U 0.90.1193 3、结果计算： 将大牛血清和蛋白标准液的平均吸光度带入公式：血清总蛋白（g/L)=(Au/As)X蛋白质标准液浓度（g/L),得出结果：血清总蛋白=44.586g/L （二）：结果讨论 查阅资料得知，大牛血清总蛋白含量一般为60-80g/L,可是，实验结果却是44.586g/L,即使按照实验要求及步骤操作,结果还是出现了比较大的误差，实验结果经过讨论，分析如下： 1、成功的方面： a.在本次试验出现了预期的结果：S和U试管溶液显淡紫色，B试管显淡蓝色。S和U试管显淡紫色是因为蛋白质发生了双缩脲反应，但是由于蛋白质的含量偏少显色较浅，B试管显浅蓝色的原因是B试管中没有发生任何反应，显双缩脲试剂的淡蓝色。 b.水浴，吸光度测试等环节都能够按照预定的步骤进行，操作比较严谨。 2、误差分析： a.所测得的蛋白质含量偏低，可能是由于样品存储不当，造成待测的大牛蛋白水解，待测样品中的蛋白质总量本身就很低 b.待测的大牛蛋白溶液正常，但是，标准蛋白溶液的浓度比标示的高，造成测量结果偏低 c.操作过程有偏差，由于量取蛋白质溶液的量比较少，在每个加样步骤的少量偏差，都会造成结果误差较大 五：结论 样品的蛋白质含量偏低 复习思考题 1.什么叫双缩脲试剂？为什么要在双缩脲试剂中加入酒石酸钾钠和碘化钾？ 双缩脲试剂 2.试剂配制过程中，为何NaOH要单独配制，最后加入？ 3.简述血清总蛋白测定的临床意义。篇三：实验一 双缩脲法测定血清蛋白质含量 实验一 双缩脲法测定血清蛋白质含量 【实验名称】：双缩脲法测定血清蛋白质含量 09救援一班
室温：20° （一）实验目的： 1.掌握双缩脲法测定蛋白质的原理。2.学习掌握分光光度计的使用。 3.掌握标准曲线的制作。4.学习分光光度法测定的原理和方法。 （二）实验原理：血清中蛋白质的肽键（-CO-NH-）在碱性溶液中能与2价铜离子作用生成稳定的紫红色络合物。此反应和两个尿素分子缩合后生成的双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2）在碱性溶液中与铜离子作用形成紫红色的反应相似，故称之为双缩脲反应。这种紫红色络合物在540nm处有明显吸收峰，吸光度在一定范围内与血清蛋白含量呈正比关系，经与同样处理的蛋白质标准液比较，即可求得蛋白质含量。 （三）实验材料与仪器： 1.仪器和材料： 分光光度计、7支试管、1毫升刻度吸管3支、移液器、坐标纸。 2.试剂：6mol/L的NaOH、双缩脲试剂、9g/L的NaCl溶液、蛋白质标准液（10g/L)、待测血清样本。 （四）实验步骤和结论: 1.取7支试管，编号，按照图1操作并记录。 表 1 2.在坐标纸上以各管蛋白质含量为横坐标，光吸收值（两管平均值）为纵坐标，绘制标准曲线。 表2
3、由标准曲线查出待测的血清样本的蛋白质浓度，由表1得出测定管的蛋白质的λ光吸收值为0.317，由表2得出测定管的蛋白质的浓度为1.4g/L 4、按照光吸收法计算公式计算，从标准管中选一管与测定管光吸收值接近者，按公式 C标A测C测?A标 计算待测血清样本的蛋白质浓度，从上可选A测 = 0.317 C标=0.354 ,A标=1.6 g/L;
则得到：C测=1.432 g/L
【注意事项】 ： 1.本实验是定量实验，要求所有玻璃仪器必须清洁，整齐、干燥。蛋白质标准液和血清取量必须准确。 2.各管加好样后必须充分混匀。显色反应需在20到30min才完成。 3.3用分光光度计要注意：取吸收池时，应拿毛玻璃两面，切忌用手拿捏透光面，以免粘上油污；液体的体积为比色杯的2/3-3/4;不要将比色杯放在分光光度计上；试验完成后，关闭电源，洗净比色皿。
【思考题】1、蛋白质的肽键（-CO-NH-）在碱性溶液中能与2价铜离子作用生成稳定的紫红色络合物，这种紫红色络合物在540nm处有明显吸收峰，吸光度在一定范围内与血清蛋白含量呈正比关系，经与同样处理的蛋白质标准液比较，即可求得蛋白质含量。 3、各管加好样并充分混匀后，20到30min才能完成显色反应，所以本实验在加入双缩脲试剂20到30min左右的时间才进行比色，在显色后30min内进行显色，且各管测定时间几乎要相同。篇四：血清总蛋白测定(双缩()法) 授课对象：06级检验1-5班 课 时：1学时 血清总蛋白测定(双缩脲法)
目 标：1.掌握双缩脲法测定总蛋白的原理及注意事项。 2.熟练测定操作步骤。 3.了解TP测定的主要临床意义。 实验用品：水浴箱（37℃），721型分光光度计，双缩脲试剂，双缩脲空白试剂，蛋白 标准液（70g/L），生化质控血清等。 内 容： 原理： 蛋白质分子中的肽键在碱性条件下能与铜离子作用生成紫红色的络合物，产生的颜色强度在一定范围内与蛋白质的含量成正比，与同样处理的蛋白标准液比较，经计算或查标准曲线即可求出血清蛋白质含量。 蛋白质分子中的肽键在碱性条件下能与铜离子作用生成紫红色的络合物与两分子尿素缩合后生成的双缩脲在碱性溶液中与铜离子作用形成的紫色物质的反应相似，故称之为双缩脲反应。 ※ 双缩脲结构: H2N—OC—NH—CO—NH2试剂: 试剂： 1．154mmol/L NaOH溶液 2．6mol/L NaOH溶液 3．双缩脲试剂：称取硫酸铜(CuSO4·5H2O)3.0g,溶于500mL新鲜制备的蒸馏水或刚煮沸冷却的去离子水中，加酒石酸钾纳(NaKC4H4O6·4H2O)9.0g，碘化钾5.0g，待完全溶解后，加入6mol/L Na2OH 100ml,最后加蒸馏水至1000mL。 4．蛋白质标准液：市售。 操作：(按下表) 加 入 物(ml) 待 测 血 清 蛋白标准液 154mmol/L NaCl 双缩脲试剂 R(测) 0.1 - 0.4 5.0 S(标) - 0.1 0.4 5.0 B(空) - - 0.5 5.0 混匀,置37℃10min(25℃30min).以”B”管校”0”, λ=540nm比色,读取A值计算。 计算及结果报告： 血清总蛋白(TP)=A测/A标×C标 结果报告： 被检者： TP__________g/L［60～80g/L］ ＿＿＿年＿＿月＿＿日
检查者：＿＿＿＿
附注： 1.由于各种血清蛋白质的分子量不同，故其浓度不宜用mol/L表示。 2.双缩脲反应并非蛋白质的颜色反应。凡分子内含有两个或两个以上氨基甲酰基（－CONH2），不论是直接相连还是通过一个氮或碳原子间接连接，均可呈双缩脲反应。如缩二脲，草酰二胺２，丙二酰胺等 3.双缩脲试剂中酒石酸钾钠的作用是络合铜离子，以维持铜离子在碱性溶液中的溶解性；碘化钾能防止两价铜离子还原． 4.高脂，黄疸及溶血标本应作清空白对照来校正误差。含脂类极多的血清，加入双缩脲试剂后会出现混浊，可用乙醚3ml抽提后再进行比色． 5.血清TP＞100g/L时，需作稀释处理，结果乘上稀释倍数．
临床意义： 1.清总蛋白生理性波动：长久卧床者比直立活动者约低3～5g/L；新生儿比成人低 5～8g/L；60岁以上的老人约比青壮年低2g/L。 2.清总蛋白增高： ①血液浓缩：腹泻、呕吐等。 ②合成增加：如多发性骨髓瘤等。 3.清总蛋白降低： ①血液稀释：过多注射低渗溶液，各种原因引起的水钠潴留。 ②摄入量不足和消耗增加：营养不良、慢性肠胃炎、严重结核病等。 ③合成障碍：肝脏疾病。 ④蛋白质丢失：严重烧伤时大量血浆渗出，肾综合症等。
课后小结：篇五：双缩脲法检测血清总蛋白方法学评价-论文 双缩脲法测定血清总蛋白的方法学评价
摘要：目的
评价双缩脲法测定血清总蛋白的方法性能。方法
配制双缩脲试剂，并用所配双缩脲试剂和标准血清蛋白进行批内重复性试验、回收试验、线性范围测定。结果
双缩脲法测定血清总蛋白的批内重复性试验的变异系数CV%为6.42，回收试验平均回收率为109.3%，线性范围测定的R2为0.9877。结论
双缩脲法测定血清总蛋白的性能不高，本人测得的批内重复性试验的变异系数CV%偏大，回收率偏高，线性范围一般，或许这是个人操作因数，因为还有其他同学的结果比较好的。 关键词：双缩脲法；血清总蛋白；方法学评价 双缩脲法测定血清总蛋白至今已经有近100年的历史，其间该方法也得到不断改进，是目前测定血清总蛋白的常用方法之一。《全国临床检验操作规程》推荐Doumas双缩脲配方作为血清总蛋白测定的常规方法[1]。方法学评价对于医学检验专业学生日后在工作中评价检验方法非常重要，对培养学生逻辑思维和实验室质量控制具有重要作用。本文介绍双缩脲法测定血清总蛋白的方法学评价，对学生练习和掌握方法学评价有重要意义。 双缩脲试剂鉴定蛋白质的原理：双缩脲（NH2CONHCONH2）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与二价铜离子形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似的肽键，因此，也能在碱性环境中与二价铜离子结合生成紫红色络合物。此反应不需要加热，被用来定性鉴定蛋白质。但请注意：凡含有2个以上肽键的物质或含有1个肽键和1个一CS—NH2、一CH2一NH2、一CH20H、一CHOHCH2NH2等基团的物质，以及乙二酰乙二胺都有此颜色反应。因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽均有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽[2]。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris 1缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差，不适合微量蛋白的测定。
1. 仪器与试剂 1.1 仪器 721型分光光度计；水浴箱。 1.2 试剂 牛血清白蛋白；硫酸铜结晶(CuSO4?5H2O)；酒石酸钾钠(NaKC4H4O6?4H2O)；氢氧化钠(NaOH)；碘化钾(KI)；蒸馏水。
2. 双缩脲的配制 2.1 称取6g NaOH溶于新鲜制备的25 ml蒸馏水中，配成6mol/L氢氧化钠溶液。 称取0.75 g硫酸铜，2.25 g酒石酸钾钠，1.25 g碘化钾依次溶解于125 ml蒸馏水中．在搅拌下加人6mol/L氢氧化钠溶液25 ml，用蒸馏水定容至250 ml。配好的双缩脲试剂应贮存于塑料瓶中(或内壁涂以石蜡的瓶中)。此试剂可长期保存，若瓶中有黑色沉淀出现则衙重配。
2.2 通常加入碘化钾可以防止铜离子自动还原形成一价氧化铜沉淀。在配制双缩脲试剂过程中，进行两种不同加试剂顺序，如下 顺序1：硫酸铜→酒石酸钾钠→碘化钾→氢氧化钠 顺序2：硫酸铜→碘化钾→酒石酸钾钠→氢氧化钠 这两种顺序的区别是加酒石酸钾钠和加碘化钾的顺序不同，“顺序1”在加完酒石酸钾钠后溶液是青蓝色的(如图1左)，“顺序2”在加完碘化钾后溶液颜色是褐色的(如图1右)，但两种顺序在加完所有试剂后，颜色都是相同的，都为深蓝色，如图2。这两种不同加试剂顺序的配制方法，虽然过程不同，过程中颜色变化也不同，但最后的结果是相同的。2 图1 (左为先加酒石酸钾钠) 图2 (左为先加酒石酸钾钠)
3. 批内重复性试验 3.1 材料 待测样品、双缩脲试剂、蒸馏水、721型分光光度计、水浴箱 3.2 方法 3.2.1 取21支试管放试管架，分别标记空白管1支，重复测定管20支，按表1添加试剂。 表1
试剂添加3.2.2 涡旋混匀后，37℃水浴10分钟，在波长540nm条件下比色，空白管调零，用分光光度计测定各管吸光度。 3.2.3 计算待测样品的标准差S和变异系数CV%值。 3.3 结果 3.3.1 结果记录 3.3.2 批内重复性试验结果处理 3计算公式标准差 s? (x?) 2 ?(n?1) ，变异系数CV%?(s?)?100 标准差s=0.0086，变异系数CV%=6.42 3.4 讨论评价 3.4.1 批内重复性试验测得数据的CV%=6.42，CV%值比较大，超过4.0，说明测定的精密度比较低。原因可能有以下几点： ①实验中使用的分光光度计比较老旧，一直性能不稳定，多位同学使用后都表示结果不太好。 ②使用的加样枪很多都老化了，不好用，导致封密性不强，实验误差大。 ③个人加样误差，在一些关键试剂上加样可能有误差。 ④所使用的比色杯经过多次使用，比色杯壁里遗留一些有色物质，影响了测量结果。
3.4.2 通过10位同学结果的比较，如表3，有五位同学的结果小于4，另五个同学的结果大于4，最大的CV值是本人测得，说明本人的结果比较差，双缩脲法测定血清总蛋白的精密度不算太好。 4. 回收试验 4.1 回收试验原理
4回收试验是反映分析方法准确测定加入样品中已知浓度或量的纯分析物能力的试验，是评价方法准确度的有效方法。回收试验可有效反映方法的比例系统误差，也可反映方法的竞争性干扰。 本实验通过双缩脲法测定蒸馏水中加入的蛋白质的回收率，判断双缩脲法比例系统误差的大小，从而评价方法的准确性。 4.2 回收样品制备4.3 蛋白质浓度测定 4.3.1 蛋白质浓度测定的加样，如表5注：空白管和样品管各做一管，样品管每个样品做2管取平均值，共计1+1+2+2+2+2=10管。 4.3.2 涡旋混匀后，37℃水浴10分钟，在波长540nm条件下比色，空白管调零，用分光光度计测定各管吸光度。 4.4 结果 4.4.1 结果记录4.4.2 结果计算
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【转载】【讨论】标准曲线浓度能不能低于方法检出限？
国家海洋局《原子荧光法测定海水中砷的技术规程》中,
标准曲线各点浓度为0.5,1,2,4,8,10ug/L
方法检出险为0.5ug/L。
因为我测的海水样品，浓度大都是1ug/L左右，所以把标准曲线各点的浓度调整为0.2，0.5，1，2，4ug/L，让样品浓度在标准曲线中段。
但是测了几次，0.2ug/L这一点的荧光值都偏高，导致曲线的相关系数只有0.998（按标准中的浓度做的话，0.999没问题）。
标准曲线第一点的浓度能不能低于方法检出限？
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一般不应该地域检测线，如果低于检测线他的相应只就不是线性了，所以相关性不好
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一般不能吧
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你在一的下面已经有0.5的点，可以了不必再做更低的点，太低荧光值不稳定。
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国家海洋局《原子荧光法测定海水中砷的技术规程》中,
标准曲线各点浓度为0.5,1,2,4,8,10ug/L
方法检出险为0.5ug/L。
因为我测的海水样品，浓度大都是1ug/L左右，所以把标准曲线各点的浓度调整为0.2，0.5，1，2，4ug/L，让样品浓度在标准曲线中段。
但是测了几次，0.2ug/L这一点的荧光值都偏高，导致曲线的相关系数只有0.998（按标准中的浓度做的话，0.999没问题）。
标准曲线第一点的浓度能不能低于方法检出限？
方法检出限为0.5ug/L，说明0.5ug/L以下已经测量不准确了，因此不能低于方法检出限。
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相关性不是太好
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先明白啥叫检出限，仪器的检出限，方法的检出限。
检出限是仪器检测的能力，而且浓度在检出限附近已经是不准确了。所以不能太低，一般厂家给了的检出限是仪器的检出限，公式：检出限（DL）＝3空白标准偏差（SD）/曲线斜率（K），方法检出限肯定比这个值要高一些的。见意在厂家给出的检出限基础上再＊3，不要超过个值。但是可能也会很低。假如你一定要测低浓度的，最好把灯电流，负高压都上调一些，让标曲的最低点的荧光值大于40~50，这样做肯定就没有问题了。
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这个不太清楚，不过，应该是不能低于检出限的吧。
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本人认为:是不能低于方法检出限.仪器检出限和方法检出限是不同的概论.前者往往应该大于后者.你在0.1左右,那你已经有了0.5也就可以了.当然也可以调整仪器的相关参数,使其的IF值稳定,在60左右
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不能低于的吧蛋白的提取和定量
肺组织用预冷1×TBS洗净后，加入含PMSF的RIPA buffer（冰上操作，310ul,决定未来的蛋白浓度和蛋白液体积）,50-60mg肺组织砸碎放入1.5ml离心管，冰上孵育1h，10000转4℃离心10min，转上清至新管。裂解液分装后保存于-70℃
蛋白质定量：BCA蛋白测定法
①根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50：1）配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。
②完全溶解蛋白标准品(BCA试剂盒中，BSA原浓度2mg/mL),稀释到1mg/mL。 ③将标准品按0，2，5，10，15，20，25 ul标准品孔中，加蒸馏水稀释标准品的
④加样品2uL加到96孔板的样品孔中，加蒸馏水23微升。
⑤各孔加入200微升BCA工作液，37oC放置30分钟。同时打开酶标仪预热。
注：也可以室温放置2小时，或60oC放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适量在较高温度孵育，或延长孵育时间。 ⑥测定A570的波长，根据标准曲线计算出蛋白浓度。
⑦计算调蛋白时所需TBS和RSB的体积（调所有样品浓度至3-5ug/ul）：
总体积=蛋白体积*蛋白浓度/3（ul） RSB=1/5*总体积（ul）
TBS=总体积-RSB-蛋白体积（ul）
先加RSB（对蛋白有保护作用），后加TBS。最后放于-70℃保存。
Western Blot
1. 玻璃板：注意对齐、夹紧，防止漏出，短板朝前。 灌至距绿线1cm左右，用dd水封顶，放置30－40min。状况好时往往能观察到
水与胶的界限。
4. 分离胶凝固后，配制浓缩胶。将水倒掉，灌好浓缩胶，立刻插入梳子，等待40min。在此期间，打开水浴锅（100℃）
注：此步后可停止，将胶连同梳子放入4℃保存一夜，若保存时间较长，为防止水分流失，可加盖湿润的滤纸和保鲜膜。
5．电泳前准备好：待测蛋白、Marker、1＊running buffer。蛋白在沸水中煮3－5min。（第二次后不用煮沸）
6．拔梳子，立即用1＊running buffer冲洗孔道（用塑料吸管）。
7．将玻璃板取出，固定于电泳槽（短面冲里－相对），也要牢固，可先将电泳液倒入两玻璃板槽间观察是否渗漏。
注：标记号1、2板及左右。
8．固定好后，加样。
加入物质及体积
3.5ul Marker (thermo #26616)
9．玻璃电泳槽倒满1＊running buffer，电泳液没过电泳槽中的钢丝即可，注意标记好带的顺序。
黑对黑红对红，电压100V
电泳1－1.5h，等蓝色条带跑出后再等待10－15min。蓝带对应8KD蛋白，根据蛋白样品分子量决定具体的电泳时间，确保不让目标蛋白抛出凝胶。一般可等蓝带完全跑出凝胶后10多分钟停止电泳。
Western-ECL
1. 玻璃板取出，用跷胶片打开，标记好切胶位置，将浓缩胶和分离胶上的空白切掉。切胶时不要划，要切。注意，在右上角切口标记，量胶的长、宽。
2. 将切好的胶（粘在一片玻璃板上）浸入Transbuffer，晃动使胶脱离下来，放上摇床，中速30min。
3. 根据胶的长宽剪滤纸和PVDF膜（不能折，不能用手碰），PVDF膜的右上角与胶一样切口。滤纸不能太大，膜可以大一点。PVDF膜甲醇激活，transbuffer摇床10min。将滤纸浸入Transbuffer。（Transbuffer不倒掉）
4. 转膜装置:
① 滤纸可以采用学校的大张滤纸剪裁，四层叠在一起使用
② 三明治由低层向高层为：四层滤纸――膜――胶――四层滤纸，大小要一致 ③ 滤纸、膜、胶都需要用TRANS BUFFER浸透，上面滴加TRANS BUFFER ④ 100伏转印60分钟。
⑤ 如果转膜结束后不立即做，可以用TRANS BUFFER洗一洗，PBST洗一洗，晾干，保鲜膜包好后置四度保存。
再用之前，甲醇激活，再用TRANS BUFFER洗一洗，PBST洗一洗。即可封闭
1. 将10*TBS稀释至1*（100ml→1000ml），加入1ml Tween 20（0.1％），即TBST。（Tween较粘稠，把枪头剪掉一块。）
2．配封闭液，脱脂奶粉5g，用量筒加100ml TBST，一般50ml足够（2.5g脱脂奶粉，TBST50ml。）
3. 将PVDF膜用PBST洗一下，根据Marker分子量切带（在右上角切口标记,一定要在平的地方切）。
* 若此时停止当日试验，可将NC膜放在保鲜膜上晾干，包好放入冰箱4℃。待使用时，用PBST洗一下，放入封闭液。
4．正面朝上放入脱脂奶粉中封闭1h，放在摇床上。配杂交液：用小瓶称0.2g BSA，用量筒加入PBST20ml。
5．杂交完毕后，用TBST略洗一下膜，加入杂交液将小条没过（3ml即可，可视情况而定）
6．加入一抗，摇床2h。过夜。
7．取出膜，用洗膜液洗3次，5－15min／次。计算杂交液体积，若不足再配。
8. 洗完三次膜加入二抗，摇床1h
9. 用洗膜液洗3次，5－15min／次。
三、发光反应
准备：发光板、滤纸、小镊子、1000μl加样器、发光液1，2（按1：1的量混合先白瓶后黑瓶，混匀，注意换枪头）EP管。
显影：将洗完的PVDF膜放入PBST保持膜湿润，排好条带，记住顺序，用滤纸略吸水，放在发光板上，滴加显影液，用枪头滴在PVDF膜上，等20－30s，发光。存盘。
发光后，如要回收条带，收回后蒸馏水洗净，加入一抗二抗清除液，没过条带，摇床10min,蒸馏水漂洗5min,三次。洗净晾干回收。下次再用继续封闭。 备注：
1. 10×TBS
0.2M Tris base (FW121.14)
1.5M Nacl (FW58.44)
H2O to 500ml
PH=7.2—7.4 with HCL
TBST 1× TWEEN20 TO 0.05﹪
1L 100ml 10× and 500ul TWEEN20
2. RIPA buffer
100ml 可订购
0.607g 溶于90ml水，HCl调PH=7.5，补足到100ml
NaCl 0.8766g
用时按1：1000加入PMSF
每10ml放入一片PhosSTOP
3. PMSF贮备液
配置0.1M储存液，分子量174.19
0.0174g溶于为1ml无水乙醇（或异丙醇），-20摄氏度保存，用时1：1000稀释；
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