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肠道黏膜SIgA的功能及调节_临床医学
【关键词】& 肠黏膜免疫；SIgA；免疫调节
　　［摘要］& 以SIgA为主的体液免疫在肠黏膜免疫系统中起主导作用，它是防御病菌在肠道黏膜黏附和定植的第一道防线。SIgA的分泌受神经、内分泌和免疫系统的调节，在感染过程中肠道黏膜的免疫屏障被破坏，可造成消化道或全身性疾病。研究肠黏膜免疫机制及其网络调节有着重要的现实意义。
　　［关键词］& 肠黏膜免疫；SIgA；免疫调节&&& 　　消化道感染的发病率仅次于呼吸道，在感染性疾病中居第二位。胃肠道不仅是消化、吸收营养物质的场所，而且是体内重要的免疫器官，在肠道黏膜免疫中起重要作用的是分泌型IgA（secretory Immuoglobulin A,SIgA）。肠道黏膜的免疫屏障结构容易受到外界因素的影响，当其屏障功能被削弱时，外来微生物如细菌、病毒和寄生虫易于入侵，轻者出现消化不良、腹泻，重者可能会发生严重感染，甚至危及生命。因此研究肠黏膜免疫机制及其网络调节，对生长发育、疾病的治疗和一些口服疫苗的研制，均有重要意义。
　　1& SIgA
　　1.1& IgA的组成和结构& 人类机体内SIgA有两种类型：一种是7SIgA单体，主要以单体形式存在于血液中，含量较少；另一种为11SIgA二聚体，通过分泌成分（secretory component,SC）和J链（Joining Chain）结合而形成SIgA，主要存在于共同黏膜免疫系统（CMIS）的外分泌液中，含量较多。SC，分子量约80kD，糖蛋白，主要分布在分泌性腺体上皮细胞基底侧膜及游离腔面的细胞质内，作为IgA的特异受体（又称跨膜蛋白）在SIgA的合成、分泌和转运中起重要作用，并能保护SIgA不受蛋白水解酶的降解。J链，分子量约15kD，糖蛋白，由合成Ig的淋巴细胞和浆细胞产生，在SIgA的合成中起聚合作用。人类IgA有2个同种型：IgA1和IgA2。IgA1是黏膜分泌的成分之一，在血清中大部分为IgA1（85%~90%），IgA1对细菌性蛋白酶比较敏感，受酶作用后活性下降；IgA2主要存在于黏膜分泌物中，肠道中IgA1和IgA2各占50%，IgA2对一些细菌所产生的蛋白酶有较强的耐受性。
　　1.2& SIgA的产生合成& 肠道SIgA主要由肠黏膜中的成熟浆细胞分泌，IgA浆细胞在黏膜淋巴滤泡中发育，多沿上皮层分布，弥散定居于黏膜下层各位点。通常IgM+B细胞遭遇抗原刺激和（或）在开关T细胞调节下，可分化为IgA+B细胞；又在Th-2细胞调节下发育成熟为IgA浆细胞。IgA+B细胞在抗原刺激下由黏膜下淋巴管进入血液循环，分化增殖后播散到黏膜下固有层（LP）中成为成熟IgA浆细胞。浆细胞在胞浆内先合成α链、J链和二聚体IgA，再与上皮细胞内表面的SC结合，并通过SC转运到上皮细胞表面形成SIgA，最后释放到外分泌液中。
　　1.3& SIgA的功能& 当肠黏膜上皮表面免疫活性细胞受到细菌黏附素刺激时，黏附局部便产生SIgA，阻止肠道微生物及其毒素分子对肠黏膜的攻击，SIgA是相对非炎性物质，其功能如下：（1）SIgA可抑制肠道内的细菌黏附肠道黏膜表面，SIgA在黏膜表面是通过黏膜内蠕动和绒毛清除来阻止黏膜与病原体的接触［1］，SIg直接阻止或在空间上干涉微生物与介导上皮黏附的蛋白接触，甚至在上皮细胞泡状间隙内阻止病原体［1］。（2）中和肠道内的毒素、酶和病毒，并结合抗原形成免疫复合物，由吞噬细胞吞噬清除，使已被肠道酶类改变的病原体毒力降低。（3）SIgA还有明显的对嗜酸粒细胞和嗜碱粒细胞脱颗粒作用［2］。SIgA对由食物摄入或空气吸入的一些抗原物质具有封闭作用，使这些抗原游离于分泌物，便于清除，使超敏反应不能发生；小肠淋巴细胞表达IgA的Fc受体（FcR），故SIgA具有抗体依赖细胞介导的细胞毒（ADCC）作用；另外，临床上部分患者血清中出现抗食物蛋白的抗体，超敏反应的发生率增加，这可能与SIgA缺乏而不能有效地阻止食物性抗原经肠黏膜入侵有关。（4）激活补体的C-3旁路途径，并与补体和溶菌酶协同抗菌［3］。目前认为SIgA对胃肠道菌群中革兰阴性菌有特异的亲和力，可有效地包绕这些细菌。如果因为使用糖皮质激素、胃肠外营养（TPM）等干扰了SIgA的合成过程，将导致SIgA减少而削弱肠道的免疫功能，可引起肠道菌群失调，发生以脂肪痢为特征的消化吸收障碍，甚至引起肠道细菌的易位而发生肠源性全身感染［4］。新生儿易患消化道感染，可能与SIgA合成较晚有关。　　2& SIgA的调节
　　肠黏膜SIgA免疫系统受神经、内分泌和免疫系统的调节。胃肠道中存在着大量的神经元、丰富的胃肠内分泌细胞和免疫细胞，它们在胃肠黏膜中弥散分布，相互在空间上密切联系；在许多生物活性物质和受体的信息传递作用下，胃肠黏膜的神经、内分泌和免疫3个系统间相互作用、相互调节、形成神经内分泌免疫网络。
　　肠道黏膜神经内分泌系统主要包括血管活性肠肽（VIP）、P物质（SP）、生长抑素（SS）和Th-2型细胞因子等。其中VIP和SS抑制SIgA合成，SP促进Ig的合成。细胞因子中IFN-γ和TNF-α对IgA的分泌有下调作用，IL-4、IL-5、IL-6、IL-10对IgA的分泌有增强和诱导作用，分泌这些因子的细胞主要存在于固有层内，与IgA浆细胞有着密切的空间关系。资料表明［5］：在黏膜组织内IL-15是SIgM+SIgA-和SIgM-SIgA+B-1细胞转化为产生IgA细胞的重要因子，IL-15同IL-5一样在调节B-1细胞分化成产生IgA浆细胞过程中起重要作用，它是调节IgA反应的重要细胞因子［6］。
　　目前，对SIgA的表达及其调节，黏膜神经内分泌免疫网络的调节机制等研究已经有了较大的进展，但还有些问题有待解决：（1）神经内分泌免疫网络的调节环路问题；（2）网络调节中的信息传导机制。（3）肠上皮细胞是否参与免疫功能和网络调节等。此类问题的解决，有助于系统掌握神经内分泌免疫网络的细胞和分子机制，对临床医疗具有重要的指导作用。
　　［参考文献］
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　　6& 刘冬妍，刘沛.肠道分泌型IgA的成分及功能.世界华人消化杂志，）：2846.--博才网
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• 版权所有 Copyright 2011 All rights reserved.SIgA与临床疾病的关系--《四川省卫生管理干部学院学报》2000年04期
SIgA与临床疾病的关系
【摘要】：SIgA是六十年代初Shalicker和Tomas等首先在人体外分泌液中发现的种IgA类抗体 ,其来源、分布、调节和功能有与血清单体IgA差异很大 ,因此形成了SIgA和IgA两个相互独立的抗体体系 ,SIgA存在于呼吸道、唾液、鼻汁、泪以及消化液中 ,担负局部的免疫功能。SIgA的变化与呼吸系统、消化系统的变态反应 ,免疫病患的发生有密切关系。调节SIgA免疫系统有益于临床疾病治疗。
【作者单位】：
【关键词】：
【分类号】：R392.11【正文快照】：
免疫球蛋白Ａ(ＩｇＡ)有两种存在形式,即血清型ＩｇＡ和分泌型ＩｇＡ(ＳＩｇＡ),前者为单体,后者为ＩｇＡ二聚体或三聚体与一个分泌片由Ｊ链连接而成[1]。ＳＩｇＡ是由粘膜和外分泌腺局部的浆细胞合成,这些浆细胞具有同时合成ＩｇＡ分子和Ｊ链的功能,分泌片(ＳＣ)由粘膜上皮
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2012临床助理医师考试辅导：IgA的特性和功能
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虽然IgA仅占血清免疫球蛋白总量的10%～15%，但却是外分泌液中主要的抗体。IgA分两型：血清型IgA和分泌型IgA。血清型IgA为单体，主要存在于血清中；分泌型IgA（SIgA）广泛分布于粘膜表面及相应部位的分泌液如唾液、泪液、初乳和肠道等外分泌液中，是粘膜局部抗感染免疫的重要物质，由两个单体、一条J链和一个分泌片（IgAFcR）连接而成。单体IgA和J链由粘膜固有层中的浆细胞合成。分泌片由粘膜上皮细胞生成，它能保护SIgA不被分泌液中存在的各种蛋白酶裂解破坏。婴儿出生后4～6个月开始合成IgA，12岁达成人水平。IgA不能通过胎盘，婴儿可从母乳中获得SIgA，这对婴儿抵抗呼吸道、消化道病原微生物感染具有重要意义。
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招聘、求职去微信上咨询客服第三节　消化道分泌生IgA胃肠道产生的分泌性IgA（SIgA）在其粘膜表面形成重要的免疫保护层能防止抗原性物质进入粘膜，对局部炎症和肿瘤的发生发展起重要作用，也是近年来研究局部粘膜免疫反应的重要课题。
一、S IgA合成及其功能
人体内主要含有两种形式IgA。一种为s IgA单体，主要存在血清中，多来自脾脏、骨髓和肠系膜淋巴细胞的浆细胞。另一种是与分泌成分（secretory component, SC）结合的二聚体，即SIgA，沉降系数为11S，主要存在唾液、初乳及胃肠道等分泌液中。成人肠道每天能分泌3gSIgA。目前多认为胃肠道是s IgA的中枢器官。SIgA由SC、J链和二个IgA单体组成，形成过程包括：SC的合成、J链和IgA合成、IgA与SC结合和SIgA分泌。SC是分子量为83000dalton左右的糖蛋白，由549～558个氨基酸和20%糖组成，其转录基因在上皮细胞的第1对染色体上。我们用免疫细胞化学染色证实SC主要分布在分泌性腺上皮细胞基底侧膜及游离腔面的胞浆内。杯状细胞含SC很少。SC作为免疫球蛋白的受体在SIgA的合成中起重要作用。目前已经证实SC与胃肠道固有层IgA产生细胞分泌的二聚体和J链形成二硫键。虽然40%IgG和IgD产生细胞也含有J链，但很快被溶解，故SC不能与IgG与IgD相结合。SC能与IgM五聚体结合，但结构不稳定，易被消化酶破坏。SC与IgA结合及SIgA分泌过程是近年来研究的重点课题。SC作为特异性受体位于上皮细胞膜上，其膜外部分（最外层100个氨基酸残基，即SC1）非共价键与J链和IgA的α链可变区（Cα3）结合，SC紧靠细胞膜部分（SC5）与IgA二聚体的另一条链α链（Cα2）形成二硫键。结合的SIgA通过细胞吞饮作用（pinocytosis）进入胞浆，在上皮细胞腔面释放，近年的研究表明，小白鼠的肝细胞和人胆管上皮细胞也能合成SC。人胆汁中含有IgA单体多来自血液，少部分来自门脉区及胆管内皮细胞下浆细胞。有趣的是有人发现慢性肝硬化患者周围血B淋巴细胞也能产生IgA二聚体，其机理还不清楚。
SIgA分布在粘膜表面，能封闭细菌和病毒等抗原表面及其受体结合部位或与之凝集成团状，阻止病毒和细菌和粘附。SIgA与相应抗原结合还可激活补体的替代途径，造成抗原溶解，近年来也有人发出IgA也能通过ADCC发挥细胞毒作用。有人发现先天性缺乏SIgA的病人恶性肿瘤的发病率比正常人高20～50倍。小肠之所以很少发生恶性肿瘤，粘膜中含85%以上的IgA产生细胞是重要因素之一。因此，深入研究SIgA与消化道炎症，感染和肿瘤发生发展的关系有临床实用价值。
二、对比免疫荧光染色
1．染色特点
（1）要进行SC和IgA组织定位，必须有相应特异抗血清。SC抗血清国内没有生产。国内商品IgA抗血清的抗原多来自人乳中的SIgA，具有双重抗原性（SC和IgA），不能特异进行IgA组织定位，最好采用抗人α-重链抗血清。
（2）SC是糖蛋白，IgA是免疫球蛋白。在组织处理上虽然有人提出用冷冻切片或福尔马林固定胰酶消化的方法，我们的体会用冷酒精直接固定法既简单又方便。
（3）SC和IgA除一部分在细胞内，也可以分布于间质和粘膜表面。为了提高特异性，除了染色前用琼脂扩散、对照试验、吸收试验和抑制试验等方法检验抗体的特异性和敏感性外，可采用伊文氏蓝作对比染色。伊文氏蓝肉眼下是蓝色，在荧光镜下是红色，混合染色后能衬托FITC的绿色荧光，同时抑制非特异性荧光，不影响抗原抗体结合。如果特异性染色后再加伊文氏蓝，比较费时间，效果不一定最佳。先用伊文氏蓝染组织切片，再进行特异性抗体染色能抑制抗原抗体结合，不宜使用。
2．染色步骤
（1）组织加工、固定及切片与抗体产生细胞研究（不需PBS浸洗）相同。先做HE染色，选纵向连续切片，脱蜡后在4℃PBS中浸洗3～5min，过一次蒸馏水后风干待染。
（2）用伊文氏蓝PBS稀释FITC标记的SC和IgA抗体，加在连续组织切片上，放入湿盒，37℃温箱放置45min。
（3）取出切片，用BPS浸洗3次，每次5～10min。
（4）过一次蒸馏水后风干，50%甘油封片，荧光显微镜观察。
3．结果判断和分析荧光镜下组织切片底色为红色荧光，SC和IgA呈绿色荧光。IgA和SC主要分布在分泌性腺体腔面、上皮细胞侧膜及基底部，IgA还分布在间质及固有层IgA产生细胞浆内。可根据荧光强度进行SC和IgA半定量分析，也可以用荧光光度计或数字减影技术进行准确定量。
三、临床意义
1．胃十二指肠疾病我们用免疫荧光技术对胃和十二指肠疾病研究结果与Isaonacs相似，发现正常胃粘膜中胃体腺没有IgA和SC分泌，仅上皮层有少量IgA和SC荧光。胃窦腺体细胞的腔面及侧膜均有SC和IgA，间质有IgA荧光，但没有SC荧光，上皮层SC和IgA荧光较胃体强，证实SC为粘液分泌性腺体细胞所产生，在细胞侧膜与IgA结合。正常十二指肠上皮细胞层SC和lgA特别丰富。粘膜下层十二指肠体腔面也有SC和lgA分布，但较因有层腺体细胞的分泌能力低。杯状细胞缺乏分泌SC的能力。这可能与HLA-DR组织相关抗原有关。上皮层的SIgA可能是分泌后的功能定位。正常胃体能分泌盐酸和胃蛋白酶，细菌或病毒感染机会少。胃窦特别是十二指肠粘膜多偏碱性环境，细菌和病毒等停留机会较多，SIgA增多可代偿性增加粘膜免疫保护功能。
慢性浅表性胃炎时，腺体和上皮层SC及IgA荧光明显增强。HE染色发现部分胃体腺转化成粘液分泌性腺体（固有腺或幽门腺）即具备分泌SC和结合IgA的能力。间质出现较多IgA产生细胞。这些病人可能正常粘膜屏障功能被破坏以SIgA免疫屏障功能代偿。
在萎缩性胃炎中，正常腺体分泌SC功能增强，但肠上皮化生腺体及不典型增生腺体的SC荧光明显减弱。从免疫学角度支持肠上皮化生与胃癌的发生有较密切关系。
胃癌的发生和发展与SC和IgA的关系日益受到重视。在我们的研究中，发现部分癌细胞能分泌SC，与肿瘤的分化程度和组织分类无明显关系。临床上可以用SC鉴别其它部位转移肿瘤是否来自胃肠道，但也有人持不同的看法。肿瘤组织中IgA来源及s IgA在癌组织中的功能尚待进一步研究。
2．肠道疾病溃疡性结肠炎上皮细胞具有分泌SC的功能，但固有层IgA2产生细胞和J链的合成明显减少，IgA1产生细胞增加。IgA2能对抗IgA溶解酶的在破坏，有较强的免疫保护功能。故虽然SIgA的总量没有降低，但其免疫保护功能明显减弱，导致细菌或病毒感染，引起糜烂和溃疡。也有人发现炎症性反应性不典型增生的腺体分泌SC能力明显增强，具有癌变前期的不典型增生腺体明显减弱，而且随不典型增生程度加重，分泌SC和结合IgA能力减弱越明显，说明SC的免疫组织化学染色对鉴别良恶性不典型增生有一定价值。有人认为吸烟可能抑制SIgA合成，降低结肠粘膜免疫屏障功能，引起结肠癌。多数的报道认为结肠癌细胞分泌SC能力与肿瘤分化程度有关。分化程度越低，分泌SC的功能越差。双倍染色体癌细胞分泌SC的能力明显高于多倍体癌细胞。但SC与肿瘤之间的关系及其机理都在研究中。
3．其它疾病选择性免疫球蛋白A缺乏症患者虽然肠粘膜中IgA产生细胞显著增加（90%），因缺乏SIgA，不能中和和或制止过敏原的吸收，易发生哮喘和食物过敏；抗原抗体复合物进入体内易诱发红斑狼疮、类风湿性关节　炎和甲状腺炎等；易引起乳糜泻及梨形鞭毛虫感染；致癌病毒或致癌物质吸收增加。有人报道9例缺乏IgA患者5例发生消化道肿瘤。爱滋病患者是HIV感染所致。有人报道病人小肠末端IgA产生细胞减少和IgM产生细胞增加，明显IgA缺乏，但在直肠没有明显改变。最近曾报道SC缺乏的患者发生肠道白色念珠菌感染。这种患者血清IgA含量正常，粘膜固有层IgA产生细胞数量不减少，但肠分泌物中SIgA缺乏。可能这些IgA产生细胞不分泌IgA或上皮细胞的SC合成障碍。
SIgA是胃肠道粘膜第一道免疫屏障，影响因素较多。上皮细胞感染和维生素A缺乏可引起继发性SC合成减少和SIgA转化障碍。营养不良可选择性减少IgA产生细胞数量。吸烟、双苯丙酰脲等药物、精神郁抑和剧烈运动均可能影响IgA合成。因此s IgA与疾病的内在联系及其机理还需进一步深入研究。
一、T淋巴细胞分布及其特点
胃肠道T淋巴细胞分布在上皮层、固有层、粘膜集合和散在淋巴滤泡及肠系膜淋巴结内。随着免疫细胞化学技术广泛应用和各类T细胞亚群单克隆抗体的制备成功，为进一步研究不同部位T淋巴细胞的分类和功能起极其重要的作用。
1．上皮内T淋巴细胞上皮内淋巴细胞（intraepithelial lymphocyte, IEL）是指位于上皮层基底部的T淋巴细胞。近年来，对IEL对邻近上皮细胞有压迹，位于两个上皮细胞交界处，并未进入上皮细胞内。近年来，对IEL研究非常深入。已经证实75%以上成人小肠IEL是TCRγαβ阳性细胞，说明它们来源于胸腺，接受过抗原刺激。其中大部分为诱导、杀伤性T淋巴细胞（CD8或OKT8阳性），10%左右为CD7阳性和CD3阴性的IEL，类似NK细胞，有细胞毒作用，但无NK细胞标记，对NK的靶细胞无破坏作用。10%～20%左右为TCRδ阳性IEL，不受胸腺的影响，其中70%CD4和CD8均阴性，为T淋巴细胞前体。说明人的部分IEL通过胸腺外途径进行分化。内毒素等腔内抗原与肠上皮细胞微绒毛、肠腺隐窝细胞、巨噬细胞和树突状细胞膜上的组织相关性抗原分子（鼠为MHL-II，人为HLA-DR、HLA-DP和HAL-DR）相结合后，将抗原分子传递到CD3阳性T淋巴细胞受体（t lymphocyte receptor, TCR）中的α和β亚单位可变区进行结合，在CD8分子作用下导致IEL增殖和分泌大量γ-干扰素（γ-INF），α-肿瘤坏死因子（α-TNF），和少量的白介素-2（IL-2），发挥细胞毒性作用，调节　上皮细胞再生和增强对食物抗原的耐受。
2．固有层T淋巴细胞固有层T淋巴细胞（lamina propria lyphocyte, LPL）分散在固有层，约占固有层免疫细胞总数10%左右。其中CD4阳性细胞（CD4LPL）显著多于CD8阳性细胞（CD8LPL）。40%CD4LPL表达CD45RO抗原，能产生大量IL-2、IL-4和γ-INF，为记忆性T淋巴细胞，能辅助B细胞转化成抗体产生细胞并促其分泌抗体。60%CD4LPL表达CD45RA和CD8抗原，能直接抑制抗体产生细胞转化和分泌。这两种细胞的比例在调节　抗体分泌中起着重要作用。CD8LPL也可以分两种：一种表达CD28抗原的LPL，能通过ADCC或直接溶解靶细胞。另一种表达CD16抗原，具有自然杀伤功能。LPL能被IL-2激活，激活的LPL能释放大量IL-2、IL-4、γ-INF和IL-5、IL-2又能激活LPL，起着自身分泌作用。IL-5能促进抗体产生细胞分泌抗体。
3．胃肠道相关淋巴组织T淋巴细胞胃肠道相关淋巴样组织（gut – associated lymphoid tissue,GALT）主要包括肠系膜淋巴结和粘膜中集合和散在淋巴滤泡。GALTT淋巴细胞多们于生发中心的外周部位，约占40%。其中CD8和CD4阳细胞比例与周围血相似。动物研究证明，肠系膜淋巴结内的CD4阳民生细胞多于固有层。分子生物学研究发现GALTT淋巴细胞含有IL-4和IL-5基因，激活后产生大量IL-4和IL-5，能特异性增加B和T淋巴细胞增殖。抑制B淋巴细胞分化。其表面糖蛋白主要为CD45RA和leu8(CD8)，证明是幼稚T淋巴细胞。它们对抗原刺激的增殖反应低，对刀豆素A等有丝分裂促进剂的增殖反应高，产生IL-2和γ-INF低，辅助作用弱。GALTT淋巴细胞如何调节　B淋巴细胞转化成IgA产生细胞和其它免疫细胞的增殖及功能，并不十分清楚。有待进一步研究。
近年研究发现，除M细胞和巨噬细胞外，胃肠上皮细胞在接受和传递抗原中也起重要作用。免疫细胞化学发现正常小肠上皮细胞微绒毛和侧膜有斑片状MHc II类抗原，人小肠为HLA-DR糖蛋白，能识别、加工和传递抗原使粘膜内T淋巴细胞产生免疫反应。HLA-DR表达受γ-IFN诱导。因此免疫反应中组织相关性抗原与IEL和LPL淋巴细胞互相进行调节　。
二、研究方法
1．组织切片中T淋巴细胞80年代以前多用玫瑰花瓣试验和酸性酯酶方法进行组织切片中T淋巴细胞研究，特异性较差。近年来多用OKT，Leu或CD等系列T淋巴细胞单克隆抗体进行研究，特异性高，可以分类出各种亚群。免疫组化染色中应注意以下几个方面：
（1）抗体的选择：根据不同目的选择相应的抗体，如要对人胃肠道组织进行研究，可选用OKT系统单抗；对鼠类等进行研究可选用Leu 或Thy系列。如要研究辅助性T淋巴细胞可用OKT4或CD4；研究抑制性T淋巴细胞可用OKT8或CD8等单克隆抗体。
（2）组织加工方法选择：目前所研究的特异性T淋巴细胞抗原决定簇多位于细胞膜上，用陈旧或普通组织固定和加工方法可能使抗原破坏，应采用新鲜组织和低温处理。具体方法是：手术或活检获得的组织立即用液氮冷冻，或用OCT复合物包埋后再放入液氮中，便于切片，Cryostat冰冻切片后室温下风干，用4℃纯乙醇或丙酮固定10min，PBS冲洗后即可进行免疫细胞化学染色。
（3）染色方法的选择：因抗原较微量，而且位于细胞膜，应采取敏感性强、特异性高、非特异性着色少的方法。虽然有报道采用间接荧光或间接酶标技术也能显示特异性T淋巴细胞，我们推荐最好采用PAP或ABC染色技术。具体方法参阅第三，四章　。
2．粘膜分离液中T淋巴细胞一定重量粘膜组织中分离出来的T淋巴细胞也可以用免疫细胞化学进行定量和定性研究。下面介绍用间接免疫荧光技术研究IEL的大致过程：
（1）将手术取得的肠管纵形剪开，将上皮层与固有层分离。
（2）上皮层放在无镁离子、含100U青霉素和链霉素及0.2%叠氮纳的PB中清洗，无血液和其它杂质后用解剖剪将组织剪碎，用匀浆器磨碎或用超声粉碎或用胶原酶溶解上皮细胞。
（3）匀浆液通过脱脂棉、尼龙筛（只允许淋巴细胞滤过，除去粘液、碎屑和上皮细胞凝集块）或金属网（200目）获得淋巴细胞悬液。
（4）将硅化玻璃球高压消毒，冲洗和平衡后将悬浮液过柱，得到的细胞液直接计数。也可以用淋巴细胞分离液提取，用台盼蓝测定其活性，并加10%FCS-RPMI细胞培养液，淋巴细胞数应达5×106/ml。
（5）试管内加0.1ml细胞液后加OKT系列单抗0.1ml，同时用另一试管加0.1mlPBS作对照。混合液在4℃放置30～60min（也可以在冰箱过夜）后，PBS（含RPMI）冲洗3次，离心后细胞沉淀物再加PBS至0.1ml。
（6）加0.1mlFITC标记的抗鼠IgG（根据工作效价），4℃放置20～30min，PBS洗3次，离心后加在红细胞计数板上，荧光显微镜观察。
（7）阳性细胞为细胞膜上有绿色荧光，有的呈颗粒样，随细胞滚动。荧光镜下可计算200个淋巴细胞中阳性细胞所占的百分率，或根据血细胞计数板中阳性细胞算出细胞总数及百分率。
三、临床意义
1．IEL在胃肠道粘膜中起重要免疫屏障作用正常成人空肠100个上皮细胞有20个IEL，回肠有13个，结肠只有5个，这也可能是恶性肿瘤不发生在小肠的重要因素之一。我们发现胃粘膜也有IEL。在胃部炎症和溃疡时，上皮及腺体隐窝细胞间的IEL明显增加。IEL不但参与免疫反应，而且通过伪足与上皮细胞接触，加速上皮细胞再生。电镜下胃粘膜也发现这种现象。IEL与乳糜泻（coeliac disease, CD）关系最密切。近期研究表明，第12型腺病毒与麦胶蛋白有同源性。CD病人肠道感染这种病毒后，服用麦胶数小时粘膜中IEL显著增加。在上皮细胞HLAII抗原糖蛋白分子作用下与TCR结合，激活TCRαβlEL，发挥细胞毒作用，导致肠粘膜萎缩，引起脂肪吸收不良和腹泻等一系列临床症状。增加的TCRγδIEL调节　TCRαβ的杀伤作用。停服含麦胶食物后，TCRαβIEL明显减少，上皮细胞再生恢复，临床症状消失。CD病人出现疣状胃炎也是IEL参与的免疫反应结果。CD病人的肠道淋巴瘤也是来自IEL增殖。器官移植后的宿主排异反应、结肠炎、热带性腹泻、牛奶过敏和某些自身免疫性疾病均有IEL增加。也有人发现克隆氏病和溃疡性结肠炎患者结肠IEL细胞毒性作用明显减弱。当然，IEL增加是继发或是原发，是否IEL是这些疾病的病因，临床治疗和诊断价值如何，还不清楚。而且IEL受年龄、抗原、免疫调节　剂（考的松对IEL无影响，环磷酰胺显著降低IEL数量）等因素影响，因此需要深入进行研究。
2．粘膜固有层T淋巴细胞在局部体液免疫中起重要调节　作用在GALT中有开关性T淋巴细胞使生发中心的淋巴母细胞转化成IgA产生细胞。这些细胞减少或功能缺乏可导致免疫球蛋白A缺乏。有人分离出克隆氏病和溃疡性结肠炎病人固有层T淋巴细胞进行研究，发现辅助性T淋巴细胞减少，抑制性T淋巴细胞显著增加，可能导致局部免疫失调，引起细胞毒性或迟发性过敏反应等，致使炎症和溃疡发生。
3．胃肠道肿瘤细胞中T淋巴细胞研究倍受重视我们及国内外一些报道均证明胃癌组织中T淋巴细胞显著增加，且其细胞毒性大于非癌组织。胃癌病人周围血T淋巴细胞毒性低于粘膜T淋巴细胞。但有人发现胃癌组织中T淋巴细胞的ADCC作用较弱。提示粘膜T淋巴细胞可能直接通过细胞毒作用或通过释放淋巴因子对癌细胞有杀伤作用。近年来有人将癌组织中提取和分离出具有细胞毒作用T淋巴细胞，体外加入IL-2，促其增殖，再注入病人体内进行治疗，取得明显疗效。
4．上皮细胞的MHC表达也与临床疾病密切相关有人发现克隆病、溃疡性结肠炎、放射性和感染性结肠炎和结节　病性肠炎患者小肠和结肠HLA-DR明显增加，而且不成熟的腺体隐窝细胞也有表达。CD急性期和复发时HLA-DR表达明显增加，缓解期明显减少或恢复正常，说明MHC的固有性和变易性所导致的免疫反应的复杂性，在消化道疾病的发生和发展中起着重要调节　作用。
一、癌胚抗原的特点
癌胚抗原（carcinoembryonic antigen, CEA）是分子量约20万的糖蛋白，具有二级以上结构。不同肿瘤中提取的CEA虽然抗原性相似，但所含唾液酸及其它糖组分的含量不一定相同，故有多个抗原决定簇，能与非特异性反应抗原NCA、NCA-2和正常胎儿粪抗原等发生交叉反应。NCA存在于正常肺、胰腺、粒细胞、单核细胞及巨噬细胞内，也存在于正常肠粘膜、胃粘膜肠化生腺体细胞及胆汁内。临床血清学检查CEA对结肠癌、肺癌、胰腺癌、胃癌及其它腺上皮性恶性肿瘤等的诊断有较大价值。免疫细胞化学研究可以明确CEA的定位和分布，也可以通过组织切片和分泌物涂片进行临床诊断和鉴别诊断。
二、癌胚抗原的免疫细胞化学染色
1．组织加工有人提出用冰冻切片进行CEA免疫细胞化学染色。由于非特异性荧光和需要一定设备条件，有人改用福尔马林固定和胰酶消化的方法。从我们的体会看，福尔马林固定后的切片CEA的部分抗原决定簇被遮盖，阳性结果显着受到影响。但是用冷酒精固定后的组织切片，CEA的阳性率明显升高，而且结果仍很清晰。goldenbery等同时进行CEA酶标记组织，而福尔马林固定的组织切片中CEA检出范围为3.0～7.0ng/g组织，酒精固定的组织切片比福尔马林固定者敏感2～3倍。有趣的是我们用酒精固定26个月的切片进行染色，效果仍然很好。说明冷酒精固定法便于进行回顾性研究。虽然酒精固定后组织收缩比较明显，但不影响组织结构及形态，而且可以进行多种抗原的定位研究，操作简单，是值得推荐的一种组织固定方法。冷酒精固定方法和步骤同抗体产生细胞的研究。
2．染色方法的选择根据实验条件和抗体特点选择染色方法。PAP和ABC技术可以采用，但试剂价格较昂贵，步骤较复杂。我们认为间接荧光或间接酶技术即可获得满意结果。间接酶染色技术步骤如下：
（1）冷酒精固定的组织石蜡包埋，组织切片，常规脱蜡后在PBS中放置5min，过一次蒸馏水清除玻片上的沉淀物后风干，加含3%H2O2甲醇一滴在切片上，放置20min后再PBS冲洗3次，过蒸馏水后风干。
（2）加稀释好的兔抗CEA血清（稀释度根据染色工作效价）在37℃湿盒内放置45min。
（3）PBS清洗3次后风干，再加HRP标记物的羊抗兔IgG（稀释度也要根据染色工作效价），37℃湿盒内放置45min。
（4）PBS清洗3次后加新鲜配制的含3%H2O2pH7.6Tris缓冲液（10ml溶液中含二氨基联苯胺5mg）中暗处反应5～8min（边反应边在显微镜下观察），自来水冲洗，用1%甲基绿复染2～5min，再次自来水冲洗，常规脱水、透明和封片，在光镜下观察。
3．阳性结果判断及计数检查前应当对CEA的分布有一定理性认识，而且用正常结肠组织和阳性组织作对照观察。CEA以三种形式出现在胃肠道组织切片中：①腔面分布。沿腺腔面的胞浆有棕红色酶着色。这是胃粘膜中肠上皮化生腺体、高分化腺癌和正常结肠腺体的CEA分布形式。②胞浆分布。在低分化粘液细胞癌中，CEA多位于胞浆。③粘液分布。在高分化腺癌的腺腔和粘液细胞癌周围的粘液中有CEA着色。
4．腹水免疫细胞化学染色临床上鉴别良恶性腹水可采用免疫细胞化学技术。抽取200～300ml腹水，离心后取细胞沉淀进行直接涂片、干燥、酒精固定后采用间接荧光染色。具体的方法是：在腹水涂片上加兔抗CEA抗血清（1：25稀释，稀释液为BPS缓冲液），在37℃湿盒内放置45min后BPS冲洗，共10min，再加入FITC标记的羊抗兔IgG（1：20稀释，稀释液为0.1%伊文氏蓝缓冲液），在37℃湿盒内放置45min后，PBS冲洗3次，共10min，用50%甘油封片，荧光显微镜观察。有绿色荧光阳性细胞的片子再进行HE染色，做对照观察和判断。也可以将细胞沉淀物在试管内直接进行间接荧光染色（方法同T淋巴细胞染色）。我们发现，不论采用哪种方法，都可能出现非特异性着色。少数淋巴细胞也能出现荧光或酶着色。其机理尚不清楚，如果采用伊文氏蓝作对比荧光染色，可明显减少非特异性荧光，而且淋巴细胞较小，腺癌细胞较大，有利于进行鉴别诊断。
三、临床意义
免疫细胞化学技术可以确定CEA的组织发生部位，根据阳性特点可以判断癌细胞的位置。我们的研究发现正常结肠组织CEA为弱阳性，多非常清晰分布在腔面。但结肠癌组织中CEA着色带较宽，多为强阳性，而且不规整。对胃粘膜的研究发现正常胃腺体均为阴性，肠化生腺体细胞弱阳性。胃腺瘤细胞也含有CEA。70%以上胃癌细胞CEA强阳性，特别是粘液细胞癌，光镜下癌细胞分散浸润，无法确定其转移及浸润范围。用免疫荧光或免疫酶技术进行染色，根据阳性细胞分布可作出正确判断。在肝脏或其它部位转移癌有时因细胞分化不良，无法确定其组织来源。如果用免疫细胞化学染色，发现CEA阳性细胞说明来源于腺上皮的癌肿，可能来自胃肠道或卵巢等组织。用胸腹水进行免疫细胞化学染色对临床诊断有实用价值。Walts对26例肿瘤病人渗出液和抽吸液离心后做免疫酶染色，发现13例有CEA阳性细胞。11例常规细胞学检查阴性的肿瘤病人发现8例胸腹水中有CEA阳性细胞。如果胆高CEA抗体的特异性，改进组织加工方法，排除非特异性着色，可望提高诊断价值。已经有人在血清学监测CEA诊断胃肠道肿瘤的基础上，将CEA标记125I进行放射扫描定位诊断和用CEA标记131I或抗癌药物进行肿瘤治疗的报道。
一、溶菌酶在胃肠道的分布
消化道含有大量酶类，这些酶多由胃肠道粘膜中的相应细胞产生和分泌。用免疫细胞化学研究酶的分布及含量改变对某些消化道疾病的病因和诊断有较大价值。近年来，对溶菌酶的研究较多。以往的研究认为溶菌酶是粒性白细胞所分泌。现在发现巨噬细胞、单核细胞和血清中含有溶菌酶。用免疫细胞化学染色发现胃肠道某些腺体细胞也能分泌，且在不同病变中出现不同分泌特点。
二、溶菌酶的免疫细胞化学染色特点
1．组织固定和加工用冰冻组织切片可直接进行溶菌酶免疫细胞化学研究。用冷酒精固定，4%福尔马林缓冲液或1.5%戊二醛固定均能进行免疫细胞化学染色。但浸蜡时温度不能超过60℃，载玻片应涂薄层明胶以防组织切片脱落。载片后，组织切片应放在50～56℃的烤箱中干燥但不能放在底层，因烤箱底层温度不均匀。组织切片应避免接触含油类的手和容器。组织块应放在4℃密闭容器内干燥保存。脱蜡一定要完全。
2．染色方法的选择根据具备的抗体和标记抗体，免疫荧光和免疫酶技术均可采用。间接法、PAP法和ABC等方法均可以选择。大部分报道多采用冷冻切片和ABC染色方法。ABC方法特异性强，敏感性高，非特异性染色少。目前国内已有ABC试剂盒生产。普遍认为国外Vectastain 实验室生产的Vectastain Elite ABC kit试剂盒较好，其敏感性比Vectastain ABC peroxidase kit高5倍。如果加大第一个抗体的浓度，可进行快速染色，整个染色过程只需30min。如果要进行双标记染色，可在DAB显色液作用后组织切片再进行另一种抗体染色，最后在DAB显色液中加氯化镍，使阳性部位显示紫色。与DAB显示红棕色比较，反差明显。
3．ABC染色步骤叠氮钠能抑制过氧化酶活性，不宜用以稀释ABC试剂盒中的试剂。第一抗体应用0.1%结晶状的牛血清白蛋白溶液稀释。所用缓冲液最好新鲜配制，ABC试剂用玻璃瓶装的蒸馏水稀释，去离子水可能含过氧化酶抑制剂，能降低敏感性，不宜采用。具体步骤是：①新鲜组织冰冻切片后空气干燥或风干10min。②切片用丙酮或95%酒精固定10min后PBS冲洗3次，共10min。（也可先固定，后切片，再清洗）。③在0.3%H2O2甲醇中放置20min后PBS冲洗3次，每次5min。④用正常兔血清稀释孵育20min后，用滤纸吸取过多的血清，并擦干载片中组织周围的液体，但不能使组织干燥，并用彩色笔在组织周围圈画以防抗体液流失。⑤加鼠抗溶菌酶稀释抗血清，在室温下放置30min或在4℃过夜后BPS洗10min。⑥加生物素化的兔抗鼠血清稀释液，在室温下放置30min后PBS洗20min。⑦加稀释好的Vec-tastain Elite ABC试剂盒中的AB混合液（在使用前30min配好），再孵育30min，PBS洗10min。⑧组织切片在含0.1%DAB（1mg/ml）和0.02%H2O2的0.1mol/l pH7.6 Tris缓冲液中反应2～7min，自来水冲洗5min（在显微镜下观察结果，决定反应时间）后甲基绿或苏木精对比染色，脱水和封片，显微镜观察。
4．结果判断溶菌酶主要分布在腺体细胞胞浆内，其中以潘氏细胞和杯状细胞中最明显，也可以分布在腔面或粘液中。炎性组织中粒性白细胞、巨噬细胞等炎性细胞浸润较多，也有明显着色。但是这些细胞多位于固有层内，即使个别细胞位于上皮层，其形态与腺体细胞不同，容易鉴别。当然，这些阳性细胞需与内源酶引起的着色相鉴别。
三、溶菌酶的研究的临床意义
溶菌酶的主要功能是能溶解细菌表面的糖蛋白，具有抗感染的作用。也有人认为能增加吞噬细胞作用，能与各种阴离子分子形成复合物。高浓度溶菌酶能改善细胞膜的功能。溶菌酶的研究包括组织中的分布和血清中含量测定。有人对不同病态胃粘膜进行研究，发现除正常幽门腺细胞能合成溶菌酶外，其它胃腺体细胞均无此功能。表浅性胃炎时，胃体胃窦的颈粘液细胞开始具有分泌溶菌酶的功能。肠化生腺体中的潘氏细胞、杯状细胞、不典型增生的腺体细胞也能产生溶菌酶。作者推测可能慢性胃炎时细菌等感染机会增多，是机体局部产生的对感染的调节　反应。有趣的是在胃癌细胞中也发现溶菌酶而且分化程度越高，分泌溶菌酶功能越强。转移性胃癌细胞和胃腺瘤细胞增色能分泌溶菌酶。其机理还不清楚。
有人对肠道进行研究，发现正常小肠粘膜杯状细胞和潘氏细胞能分泌溶菌酶，但含量较低。间质内粒性白细胞和巨噬细胞也有溶菌酶。但是，正常结肠和直肠上皮细胞表面和粘液腺体隐窝细胞中没有溶菌酶，固有层有溶菌酶阳性粒性白细胞。在15例溃疡性结肠炎病人中7例在结肠的直肠上皮细胞胞浆出现溶菌酶，8例克隆氏病人中只有1例阳性。作者认为用免疫细胞化学方法进行溶菌酶的定位研究有助于克隆氏病和溃疡性结肠炎病人的鉴别诊断。也有人对结肠癌进行研究，认为溶菌酶的分布与胃癌相反，结肠癌分化越高，分泌功能越低、其机理尚不清楚。
血清溶菌酶浓度的测定也曾作为无并发症的溃疡性结肠炎和活动性克隆氏病的鉴别诊断指标之一。由于80%以上血清溶菌酶多来源于粒性白细胞，不论溃疡性结肠炎或克隆氏病都可能引起周围血管局部粒性白细胞、单核细胞和巨噬细胞增多，因此，血清溶菌酶含量受到影响的因素较多，特异性不高，诊断价值有待进一步研究。