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【原创】免疫组化成功的经验和失败的教训汇总&[精华]
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不用封闭，排除其它原因吧？
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请教楼主：你对大鼠下肢肌肉的VEGF的免疫组化了解多少，希望给予指导和帮助。
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1.请问为什么我做的免疫组化片子组织边缘显色很浓，而中间却很淡，组织块各部分显色也不均匀，而且连阴性对照片（用PBS代替一抗）组织的边缘也可见到少许显色。2.如果一抗浓度1：50和1：100都能正常显色，且不出现非特异染色，那选择哪种浓度更好，是不是浓度越高显色相对要浓些
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高手们要是能给出一些免疫组化成功或失败的案例进行分析就好了，最好是能提供各种原因引起的显色失败的图片，以及各种不同显色部位成功显色的图片，这样我们就更容易了解什么样的免疫组化图片才是自己想要的，才是最好的
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tzk580 高手们要是能给出一些免疫组化成功或失败的案例进行分析就好了，最好是能提供各种原因引起的显色失败的图片，以及各种不同显色部位成功显色的图片，这样我们就更容易了解什么样的免疫组化图片才是自己想要的，才是最好的请详见我的另外一个置顶贴——案例分析和学习
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回复wh2008：请问，你的组织固定之前是否冰冻过？一般来说，组织冰冻后再固定会出现这样的结果。
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tzk580 1.请问为什么我做的免疫组化片子组织边缘显色很浓，而中间却很淡，组织块各部分显色也不均匀，而且连阴性对照片（用PBS代替一抗）组织的边缘也可见到少许显色。2.如果一抗浓度1：50和1：100都能正常显色，且不出现非特异染色，那选择哪种浓度更好，是不是浓度越高显色相对要浓些回复1：如果擦切片的时候，边缘的水分擦得太干，容易出现非特异反应，就表现为你所说的这种情况。这不是阳性表达，是非特异。回复2：我认为用1：100好。抗体浓度过高，反倒是显色不好。拙见，仅供参考。
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谢谢前辈们的指点，我最近做了不少免疫组化的片子，本来课题设计是要用免疫组化对一些因子进行定量分析，以比较各实验组间表达的差异，但到最后还是认为用免疫组化进行定量分析还是不可靠，因为影响显色程度的因素太多，比如说抗体的浓度，孵育时间，以及DAB等显色剂的厂家不同引起的显色质量不一和显色时间不同等等都对显色有影响，所以还是有顾虑啊。大家认为用免疫组化进行定量分析可靠吗？
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1关于4%多聚甲醛保存时间的问题：我搜索了很多关于4%多聚甲醛如何保存的问题，有的人说要先用现配，有的人说可以4度长期保存，没有一个确切的说法，请问到底如何保存，最长能保存多长时间呢？？2关于冲洗时用pbs还是pbst的问题，什么时候用pbst呢？谢谢！！
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求助！！我做小鼠脑组织水通道蛋白的免疫组化片子染的很黄 缩短时间虽然减淡 但看不出组织结够、细胞形态。特别是苏木素复染后没效果，一个细胞核也看不到。而he染色的很清楚这怎么办啊 急！
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我想请教一下：做乳腺的免疫组化有什么特殊要求没有？因为我做哺乳期乳腺NIS免疫组化，一抗的浓度 为1：20了，可是还是没有阳性结果，但是同批的甲状腺就出来阳性结果了。大家能帮忙找一下原因吗？
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wh2008 针对以上问题，分析如下； 1. 首先，抗体浓度和孵育时间在免疫组化中至关重要。在抗原抗体反应并非抗体浓度越高，反应越强烈，这叫前带现象。所以选择最佳的一抗浓度和孵育条件也是十分重要的，其实抗体浓度过高或过低均会引起阴性。 2. 我到认为你这片子的影响可能更大。尽管在-20度保存，但是时间一般超过3个月就不能保证其中抗原的丢失，建议可以重新爬片，以排除方法和抗原的原因。 3. 你说抗体放在4度保存是指未稀释还是稀释后抗体，存放多长时间？一般稀释后抗体不能保存很长时间的。请问为什么抗体浓度高时也会出现阴性呢？
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这是免疫反应中的前带现象，指免疫反应时抗原抗体比例不合适造成反应沉淀量减少或全部抑制所致假阳性结果。当然也存在后带现象，因此要摸索出最佳抗体合适浓度才能做出真实可靠的免疫组化结果。
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版主，我要求救。我的组织块里边要检测的蛋白是核中和胞质中都有，但是我做到现在只能做出胞质中有，怎么才能使核中有表达的显出来啊，我已经做了好久了。55555~~~~~~~~~~~~
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本人最近已做石蜡切片的免疫组化多次，多是成功的，但也遇到许多预想不到的结果和现象，现汇总问题如下，望高手们参与讨论，给出正确的、完整的、权威答案。同时也希望大家补充问题，共同交流经验、体会、感悟。1. 石蜡切片在染色过程中出现脱片现象？2. DAB显色后发现切片着色不均匀：如一片着色，一片不着色或染色浅？3. 免疫组化结果老是出现阴性结果？4. 切片染色后背景太深，不易区分特异性与非特异性着色？5. 一抗从4度拿出后，为什么有人说要37度复温，目的是什么？6. 免疫组化中抗原修复的最佳条件是什么？尤其是微波修复。7. 有人在一抗孵育前用tritonX100来通透细胞，对石蜡切片需要否？8. 苏木素复染的时间应该是多少？复染过度咋办？9. 抗原修复应在灭活POD之前还是之后？ 针对问题2着色不均匀：1. 脱蜡不充分。可以60度烤20min，立即放入新鲜的xylene1－2；2. 水化不全。应经常配制新鲜的梯度乙醇；3. 抗体没混匀。用移液器充分混匀一抗/二抗等试剂；4. 抗体孵育时，切片放倾斜；5. 抗体孵育后PBS冲洗不充分。6. 制片厚薄不均匀等问题。
针对问题5：一抗从4度拿出后，为什么有人说要37度复温，目的是什么？1. 一方面，防止切片从4度直接放入PBS易脱片；2. 另一方面，使抗原抗体结合更稳定。一般不需要,但对表达较弱的抗原可能有用,4度和37度时分子运动方式不同,前者分子碰撞机率和运动速度小于后者,后者结合更快,但敏感性也提高了并易造成非特异染色。3. 其实，我更赞同后一种说法，因为我尝试把肝脏或睾丸片子从4度过夜拿出后，直接用PBS洗没发生过脱片现象。事实胜于雄辩！
针对问题2： DAB显色后发现切片着色不均匀：如一片着色，一片不着色或染色浅？组织一半着色一半无着色，形成交界清晰或不甚清晰的两种染色结果。其成因是试剂仅覆盖了部分组织而不是全部。如加试剂后未让试剂流散开而集中在部分组织上。通常应该在加完试剂后，仔细看一遍，是否有的组织未被试剂完全覆盖，如有这种情况，建议用牙签而不是用吸头或试剂瓶口将试剂引流开使之将组织全部覆盖。另外，染片盒不平，切片倾斜，虽然开始试剂已全部覆盖了组织，但后来试剂流向一边，部分组织未被试剂覆盖。对于这种问题，只要留心或想到了很容易发现，也很容易解决。有时，用DAKO（或PAP）笔在组织周围画圈时，划线太靠近或画到了组织上，由于笔油的力学原理，试剂不能达到靠近划线附近的组织。还有气泡也可引起阴阳分明的着色，只是不着色区域是圆形，由于气泡中含气，试剂被推到周围，因此，气泡中心的组织不着色。解决办法是滴加试剂时手法要轻，有气泡时用牙签捅破。 针对问题4：切片染色后背景太深，不易区分特异性与非特异性着色？全片着色全片着色是指整个切片全都染上了颜色，着色的强度可深可浅，总之，分不清那些组织是阳性那些组织是阴性。出现这种现象的原因有：（1）、抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是，每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，既使是即用型的抗体也应如此，不能只简单的按说明书进行染色。（2）、抗体孵育时间过长或温度较高：解决办法是，严格执行操作规程，最好随身佩带报时表或报时钟，及时提醒，避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的1小时，而是30分钟，因此，要根据染色结果进行调整。（3）、DAB变质和显色时间太长：DAB最好现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的DAB不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。DAB的显色最好在显微镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应。不过当染色片太多时或用染色机时，这样做似乎不现实，但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控，避免显色时间过长。（4）、组织变干：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细，采用DAKO笔或PAP Pen在组织周围画圈，可以有效的避免液体流失，也能提高操作速度。（5）、切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长（大于24小时）：原因上不清楚，但现象存在。有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组化染色，如果将装有切片和修复液的容器放在4?C冰箱过夜，对结果无明显影响，如果放在室温，特别是炎热的夏天，会出现背景着色，因此，不可存放时间太长。（6）、一抗变质、质量差的多克隆抗体：注意抗体的有效期，过期的抗体要麽不显色要麽背景着色。用新买的抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。 针对问题1脱片：这个事情我真的是深有体会，我当时做了104片，最后有大约四十片脱的基本不剩。总结如下：1、多聚赖氨酸玻片质量的问题。我原先是买的，迈新按说也是不错的，可是都脱成什么样子了。后面补做第二批时用的病理科老师自己做的片子，要好一点。2、组织切的不好，切片机的问题例如比较老的旧的机器切的厚或者不均匀，或者切片者手法不好等。3、组织的问题，我用的组织癌症的很多，越是癌症组织有坏死之类越容易脱。4、没烤好，时间短温度不够之类。5、操作的时候甩的太猛了，有脱片嫌疑的片子最好不甩或轻轻甩，用卫生纸从边缘上慢慢吸水。6、修复的问题：抗原修复的时候高压时间过长了，或者放进100度的修复液时手法不好，咚的一声就丢进去了，这样超容易脱片。此外，用EDTA修复比柠檬酸容易脱片，但是你要用到EDTA的时候也没办法，只有从另外的问题上着手。此外，一旦见到有组织漂起来操作就更加要谨慎，用PBS的时候尽量用泡的，不要冲。基本上把这些方面都注意到了，能改善的尽量改善，脱片可以减少很多。 针对问题1脱片：这个事情我真的是深有体会，我当时做了104片，最后有大约四十片脱的基本不剩。总结如下：1、多聚赖氨酸玻片质量的问题。我原先是买的，迈新按说也是不错的，可是都脱成什么样子了。后面补做第二批时用的病理科老师自己做的片子，要好一点。2、组织切的不好，切片机的问题例如比较老的旧的机器切的厚或者不均匀，或者切片者手法不好等。3、组织的问题，我用的组织癌症的很多，越是癌症组织有坏死之类越容易脱。4、没烤好，时间短温度不够之类。5、操作的时候甩的太猛了，有脱片嫌疑的片子最好不甩或轻轻甩，用卫生纸从边缘上慢慢吸水。6、修复的问题：抗原修复的时候高压时间过长了，或者放进100度的修复液时手法不好，咚的一声就丢进去了，这样超容易脱片。此外，用EDTA修复比柠檬酸容易脱片，但是你要用到EDTA的时候也没办法，只有从另外的问题上着手。此外，一旦见到有组织漂起来操作就更加要谨慎，用PBS的时候尽量用泡的，不要冲。基本上把这些方面都注意到了，能改善的尽量改善，脱片可以减少很多。 1. 石蜡切片在染色过程中出现脱片现象？一般来说，如果用多聚赖氨酸包被过的片子做正常免疫组织化学染色的话是不会掉片子的。但如果要做抗原修复的话，如果片子处理不好的话是有可能掉片子的。你可以试试一下的方法：a.我们一般用APES：丙酮=1:50的处理液来处理片子，处理5min左右，然后水洗，烘干既可用于贴片。如果把水滴再处理好的片子上，水比较聚的话说明片子处理的好。b.贴片子的时候，展片的时间要把握好，不要太长，否则不利于贴牢。c.烤片子也很重要，切好的片子最好先不要马上收起来，而是水平至于烘片台上37度两个小时以上，一是水分彻底烘干。然后做染色前最好再在60度烘箱烘1个小时。d.再补充一点 ，石蜡包埋时，酒精梯度脱水以及浸蜡等一点要充分，这对贴片也有影响。2. DAB显色后发现切片着色不均匀：如一片着色，一片不着色或染色浅？着色不均匀可能与你的实验手法有很大关系，可能原因有：a.切出的片子厚度本身可能就不一样，切出一片厚，一片薄，这样可能造成着色深浅不一。b.有可能是你 显色液底物加到片子上后没有摇匀，造成局部底物浓度不一致，所以加完显色液后最好将片子来回左右晃动几下，使片子上所有区域的底物浓度一致。c.如果你的片子是中间的染色深，靠近边上的浅，那有可能是你蜡圈画的太小，显色液覆盖的面积不过大而产生了边缘效应。最外侧的组织片最好离显色液外缘0.5cm。3. 免疫组化结果老是出现阴性结果？免疫组化出现阴性结果有可能组织本身就没有信号，也有可能是抗体出了问题。你可以找一些阳性组织做一下，以确定是抗体的问题还是组织本身就没有所检测的抗原表达。还有，你可以提高抗体的浓度，或者试一试抗原修复等方法，也许会得到意想不到的结果。4. 切片染色后背景太深，不易区分特异性与非特异性着色？a.也许是抗体本身有问题，因为有很多公司的抗体质量并不好，很容易上背景，可以换一种抗体 试试。b.如果经费不允许换抗体的话，你可降低抗体的浓度，并随时注意观察显色，在能看到信号的情况下尽量降低背景。c.可以换一种封闭液，不同的封闭液对某种来源的抗体来说，会有不同的封闭效果。d.可以在一抗和二抗中加入一定比例的你所检测动物组织的正常血清，这样可以去除一部分非特异性染色。5. 一抗从4度拿出后，为什么有人说要37度复温，目的是什么？关于这个问题，我没有试过，我个人认为是没有必要的。但既然有人提出来，你可以试一试，看看复不复温有没有区别。6. 免疫组化中抗原修复的最佳条件是什么？尤其是微波修复。关于抗原修复，我个人的观点和panther75有点不同。我试过的修复条件有EDTA热修复，柠檬酸钠为缓冲液的微波修复以及高压锅修复。从我的实验结果来看，微波修复其实很不容易掉片子的，而EDTA热修复和高压锅修复是很容易掉片子的。因为掉片子主要是因为加热过程中产生的气泡所引起，而微波修复水加热到沸腾，沾在片子上的气泡就会少，不会因为小气泡上串引起脱片。做EDTA修复时，你可以将片子靠的尽量近些，或是在载玻片四周垫些棉花什么的，然后盖上盖玻片，这样修复的话就能够尽量减少载玻片上小气泡的形成。我们用的微波修复条件为：2.94g柠檬酸三钠溶于1000ml的水，调ph值至6.0，微波修复10分钟。你可以试试，时间可以根据需要自己调整。7. 有人在一抗孵育前用tritonX100来通透细胞，对石蜡切片需要否？用石蜡切片做免疫组化是不需要透膜处理的，一是因为石蜡切片比较薄，另外一个原因我认为是在包埋过程中细胞膜已经被破坏，所以这一步可以省略。8. 苏木素复染的时间应该是多少？复染过度咋办？复染时间不需要太长，当然这也要根据苏木精的质量来确定，但基本上不要超多一分钟。染色过深的话可以用酸性的水溶液（在水里滴加少量浓盐酸）分色，分色的另外一个目的是洗掉苏木精在细胞质中的非特异性结合，这样可以使细胞质中的特异信号更明显。所以不管复染是不是过度，分色这一步最好不要省掉。分色后记得再用氨水返蓝一下。9. 抗原修复应在灭活POD之前还是之后？我想热修复后不需要灭活POD 文章援引： 希望对 大家有帮助！
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求救：我的组化是在核和胞质中表达，胞质中显色很好，但是核中一直没有显出来。我看论坛中都很少有讨论这个的，前辈有谁做过核中表达的吗？有什么经验。我们这个实验室核没有几个能做出来的。
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hywei1900 求救：我的组化是在核和胞质中表达，胞质中显色很好，但是核中一直没有显出来。我看论坛中都很少有讨论这个的，前辈有谁做过核中表达的吗？有什么经验。我们这个实验室核没有几个能做出来的。尝试加大Triton X100细胞通透看看，因为核膜影响抗体、反应试剂等进入核内进行反应。
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lyl06_10 本人最近已做石蜡切片的免疫组化多次，多是成功的，但也遇到许多预想不到的结果和现象，现汇总问题如下，望高手们参与讨论，给出正确的、完整的、权威答案。同时也希望大家补充问题，共同交流经验、体会、感悟。1. 石蜡切片在染色过程中出现脱片现象？2. DAB显色后发现切片着色不均匀：如一片着色，一片不着色或染色浅？3. 免疫组化结果老是出现阴性结果？4. 切片染色后背景太深，不易区分特异性与非特异性着色？5. 一抗从4度拿出后，为什么有人说要37度复温，目的是什么？6. 免疫组化中抗原修复的最佳条件是什么？尤其是微波修复。7. 有人在一抗孵育前用tritonX100来通透细胞，对石蜡切片需要否？8. 苏木素复染的时间应该是多少？复染过度咋办？9. 抗原修复应在灭活POD之前还是之后？
文章援引： 希望对 大家有帮助！版主：这个帖子内容大部分原创内容均是我的原创，怎么又传到我的原创帖子内？唉，网络抄袭太猖狂了，而且还没注明我的原创，很气愤呀。
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wh2008 尝试加大Triton X100细胞通透看看，因为核膜影响抗体、反应试剂等进入核内进行反应。谢谢版主的回复，我做的是石蜡切片，也可以用吗？triton是不是在一抗前加都可以，不一定要在固定后吧。
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我看到版主以前的留言说石蜡切片可以不需要triton通透，那除这个我还可以做别的吗？
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借人气问个问题，我的做得细胞爬片的免疫组化，蛋白表达在胞质内，可是核上有非特异性染色，怎么处理呀？非常感谢，我是新手，帮帮忙呀
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谢谢了，现在正在做免疫组织化学
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我做了好多细胞爬片的免疫组化，核上的着色也总去不掉。
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我做免疫组化做了好长时间，也有些经验教训和大家一起分享一下。去年做免疫组化时查了一篇文章，我做的指标在胃癌上有很好表达，所以我一开始选择胃癌标本做阳性对照，按照这篇文章报道的步骤做了很长时间（断断续续大概两三个月），一点也做不出来。又怀疑是抗体出了问题，结果换了还是做不出来。最后没办法，浓度调到最高，改为冰冻切片，阳性结果出来了，但胃癌的还是没有表达。总结出几点：1，很多文章是胡编乱造的，不可轻信，特别是国内的。有时候按照他们的报道重复不出来时不要再盲目重复，浪费精力和时间。2，不出结果时马上换条件（如固定方法，孵育时间），换试剂（一抗，二抗，DAB）。预实验要充分了解所做指标的最好条件，需要消化么？容易失活么？和固定剂有反应么？等等。需不需要封闭是看组织所含内源生物素多少，比如乳腺，肾脏等比较多。建议大家用非生物素化方法如Envision,Elivision等，传统的SP法,sabc法，abc法目前确实有些过时了。3，有条件的话直接Western，先把有没有这种蛋白或多肽跑出来，然后再免疫组化定位，虽然western也不好出结果，但比较有意义。4，选新指标很不容易，那些做滥的指标（比如MMP）要做出点新东西来也不容易，在看这些指标的文章时，关于用免疫组化分析那些几个指标表达强弱之间的关系，以及和临床之间的联系时一定要当心，不小心你就会被误导，因为这类实验用免疫组化的方法来标记，需要把条件控制的特别好，我试过，用自动染色机器也不一定做的很好。5，一定有对照，阴性对照是非处理组，如果一种指标对照组和实验组表达方式相同，你就要非常小心控制条件再实验，或是说明，这个指标不是一个理想的指标。空白对照是一抗，二抗或是DAB被PBS或血清替代，主要排除试剂问题，当然，做上几次这些也可以省略。这些希望对大家有帮助，如果版主觉得可以，那就给俺加一分。
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dlln2001 edited on
[color=red]开始做免疫组化，做了20张片子，几乎没有脱片，微波修复两次，按一抗1：100稀释，4度过夜，其他均严格按说明书操作。结果DAB染了十几分钟，做出来组织整体均匀淡棕色染色，组织边缘略深，没有看到特异着色。& & 我做的是血红素加氧酶在脑组织中的表达，按理论来说我的模型应该出阳性结果，国内其他人在缺血再灌注的多种组织中都检测到，包括脑组织。& & 我现在最担心的是该酶会不会在固定，包埋，存放等一系列过程中降解了呢？除此以外，请问这种情况还可能是哪些原因造成的呢？如需调整，应该特别注意哪些方面呢？谢谢！你做的是不是单纯的酶组织化学染色啊，并不是免疫酶组织化学，不能用石蜡切片的，需要做冰冻保存组织原有酶的活性，而免疫酶组织化学是外源的酶标抗体，孵育后就酶促反应，再进行捕捉反应显色了。
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问个很弱的问题，PBS洗片子具体怎么操作呢？放到染缸里用震荡机震荡是否ok？
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问个很弱的问题，PBS洗片子具体怎么操作呢？放到染缸里用震荡机震荡是否ok？OK，只是转速不要太大！
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sunshine_gxl 苏木素嗜碱性，染细胞核。苏木素不是嗜碱性，而是碱性，细胞核呈酸性，所以可以染核，不要误导别人。
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“用新买的抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。 ”请教各位，大家都说要设立阳性对照，在具体操作时，应该怎样做阳性对照啊？有的会说，用含有目标抗原的标本做阳性对照，问题是我们怎么知道它一定含有目标抗原呢？希望做过的同事及版主给予回答！
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请教各位IHC高手：我做的指标本应在固有层浸润的淋巴细胞的胞浆着色，但做出来后，不仅部分淋巴细胞有表达，而且在几乎所有上皮层上皮细胞的胞核里也有着色，整张片子的颜色感觉也是黄黄的。但阴性对照片上没有着色。我做的是石蜡标本，用的是R&D的羊抗人多克隆抗体，检测系统用的是北京中衫的HRP非生物素系统，修复方法是高温高压修复。起初觉得可能是抗体浓度过高的问题，已经稀释到了1：100；后又怀疑是HRP没用血清封闭造成，今天又加了血清封闭；可是不管怎么调整，结果始终还是一样。真是把人愁死了……不知道是不是非特性染色？恳请各位高手帮助解答，谢谢！
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我想用SP法做大鼠脑组织冰冻切片PFAP、NCAM、GABA测定，需要用triton通透和内源性生物素封闭剂吗？谢谢，急盼帮助，动物都要暴露完了，实验流程还没定，非常着急！！
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请教一个问题，做灌注取材（取大脑），如果做大鼠的心脏灌注时用的混合固定液的浓度是错的（应该用4%的甲醛混合固定液，但用的2%的），但是放在容器里泡大脑的固定液是对的，这样对HE染色切片和免疫组化的结果的影响会不会很大啊，那些灌错了的标本还能不能用啊。哪位高人能指点一下啊，谢谢了
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请教一个问题，做灌注取材（取大脑），如果做大鼠的心脏灌注时用的混合固定液的浓度是错的（应该用4%的甲醛混合固定液，但用的2%的），但是放在容器里泡大脑的固定液是对的，这样对HE染色切片和免疫组化的结果的影响会不会很大啊，那些灌错了的标本还能不能用啊。哪位高人能指点一下啊，谢谢了
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请教个问题！~ 急我在病理科做了07年乳腺癌的蜡块，切片，VEGF免疫组化，为什么48张片子全部阳性表达（正常比例应该50%左右）。并且只有两张表达稍弱，其余好像均为强阳性。这是什么原因呢？是试剂浓度太高？但，我用的是极化液呀。方法是那种不用过夜的（具体我也不清楚）。
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