(交流)免疫组化的pbs缓冲液的配制问题(缓冲液,配制,免疫组化,酸度计) - 免疫实验 - 生物秀
标题: (交流)免疫组化的pbs缓冲液的配制问题(缓冲液,配制,免疫组化,酸度计)
摘要: [(交流)免疫组化的pbs缓冲液的配制问题(缓冲液,配制,免疫组化,酸度计)] PBS缓冲液（pH7 2～7 4）：NaCl 137mmol L，KCl 2 7mmol L，Na2HPO4 4 3mmol L， KH2PO4 1 4mmol L。这样的配方合理吗?配制后需要用酸度计测量pH值吗?在免疫组化过程中对PBS的要求高不高? 关键词:[缓冲液 配制 免疫组化 酸度计]……
PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。这样的配方合理吗?配制后需要用测量pH值吗?在免疫组化过程中对PBS的要求高不高?
回复也用过几种配方的PBS，个人体会，免疫组化对PBS要求并不是很高，配方并不固定，效果没有明显差别，只要是常用的即可。但PH值是一定要调节的。回复我们实验室得经典配方，pH值一般都在7.2～7.4之间，我们一般都不调ph值，浓度是0.02M配方NaCl 9g，Na2HPO4 .12H2O 7g， NaH2PO4 .2H2O 0.5g溶于1000ml水中回复免疫组化溶液关键在于渗透压和PH 值。渗透压过高或过低都会影响组织细胞形态，对结果不利。0.01M PBS和0.1M PB基本上是等渗的。PH值一般选在7.2-7.4，但一些特殊的显色条件有不同要求。回复我想PBS的作用就是为组织切片上抗原反应提供缓冲体系，要求无非就是两条：渗透压和酸碱度。组织已经过固定等处理，渗透压对其结构不应该有太大影响，但是离子强度对抗原的结合是有影响的。PBS构成中NaCl含量其实跟生理盐水是一样的，0.9%，约0.13mol/L。而缓冲体系由磷酸盐担当，磷酸根的含量是0.01或0.02mol/L，其pH值是由磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的配比决定的。所以，所谓的0.15M PBS是指钠盐离子强度0.13mol/L加0.02mol/L，而一般组化所用的0.01mol/L的PBS指的是磷酸盐含量，其实也是等渗的。
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电话：021-冰冻切片免疫组化步骤 【范文十篇】
冰冻切片免疫组化步骤
范文一：冰冻切片免疫组化步骤
1. 需要准备的材料
APES包被的载玻片
PBS（pH7.4）
4%多聚甲醛
PBST（含Tween-20）
PBST-G（含0.3mol/L甘氨酸）
2. 冰冻切片
取出组织块放于软塑料盖或特制的小盒内，之后将其缓慢平放于盛有液氮的小杯内，让盒底部接触液氮（小盒及组织块切勿浸入液氮内），大约10-20秒组织即迅速冰冻成块。取出组织冰块立即置于-80℃冰箱储存备用，或置于恒温切片机冰冻切片。
切片厚度4-8 um (5 um)，对于免疫组化的需要用APES包被的载玻片，以增加组织片的粘附性。
切片后如不立即染色，必须吹干，储存于低温冰箱内保存。
3. 免疫组化染色步骤
固定：取出切片，室温放置5mins。用4%的多聚甲醛PBS溶液室温固定15mins，PBS冲洗三次（冲洗可以采用侧斜淋洗，也可至于平皿中摇晃）。
打孔：如果是需要染细胞内的蛋白，用曲拉通（TritonX-100）打孔：组织样品浸于含0.25% TritonX-100的PBS中10mins，之后用PBS洗3次，每次5mins。如果是染膜蛋白的，不需要曲拉通打孔。
封闭：将组织置于含1%BSA的PBST溶液中30mins，封闭非特异性粘合的抗体。对于多聚甲醛固定并进行免疫荧光的样本，在封闭缓冲液中加入0.3mol/L的甘氨酸。
孵化：组织样本浸于一抗（用含1%BSA的PBST稀释），放于湿盒中，室温1h或4℃过夜。用PBS洗3次，每次5mins。 浸入二抗（1%BSA的PBST溶液），室温1h。PBS洗3次，每次5mins。 染色：浸入0.1-1ug/mL的DAPI或Hoechst中，染色1min，PBS淋洗三次。 封片：用盖玻片封片，指甲油固定，保存与4或-20℃。
范文二：1. 新鲜组织立即在恒冷冰冻切片机内切片( 也可- 80℃保存)，厚度为 5～6m。
2. 载玻片可不打底，裱片后，立即用电吹风吹干。 3. 如不马上染色，可密封后- 20℃保存。 4. 染色前用冷丙酮在 4℃固定 10-20 分钟。 5. PBS 洗 2 次，每次 5 分钟，( 必要时应用 0.1%柠檬酸钠+0.1%triton打孔)
1. 新鲜组织立即在恒冷冰冻切片机内切片( 也可- 80℃保存)，厚度为 5～6μm。
2. 载玻片可不打底，裱片后，立即用电吹风吹干。
3. 如不马上染色，可密封后- 20℃保存。
4. 染色前用冷丙酮在 4℃固定 10-20 分钟。
5. PPS洗 2 次，每次 5 分钟，( 必要时应用 0.1%柠檬酸钠+0.1%triton打孔)
6. 3% H2O2灭活内源性过氧化物酶，20 分钟，避光;
7. 用 PBS 洗 2 次，每次 5 分钟;
8. 正常血清封闭：从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片正面组织周围的水分 (保持组织呈湿润状态,)滴加正常山羊或兔血清 (与第二抗 体 同源动物血清)处理，37℃，15 分钟。
附：正常血清配制 ( 或按试剂盒规定的浓度配制)：按 1:20比例，用 PBS 配制，每张切片需要量按 50μ+5μl (10%抛洒量) 计算。
9.滴加第一抗体：用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加第一抗体，37℃ 2 小时(也可置于 4℃冰箱过夜) 。
10.PBS：5 分钟，2 次(置于摇床) 。
11.滴加生物素化的二抗，37℃，40 分钟。
12.PBS：5 分钟，2 次(置于摇床) 。
13.滴加三抗 (SAB 复合物) ，37℃，40 分钟。
14.PBS：5 分钟，2 次(置于摇床) 。
15.DAB 显色，镜下观察，适时终止(自来水冲终止) 。
附：DAB 的配制① 储备液(DAB 25mg/ml)的配制：DAB 250mg + PBS 10ml，待完全溶解后分装成 1ml，100μl，50μl ，20μl 等，-20℃，冻存。② 工作液：DAB 储备液 20μl + PBS 1000μl + 3% H2O2 5μl
16.自来水(细水)充分冲洗。
17.苏木素复染，室温，30 秒，自来水冲洗。
18.自来水冲洗返蓝，15 分钟。
19.梯度酒精脱水：80%，2 分钟 95%，2 分钟 100%，2 次，5 分钟。
20.二甲苯透明：I ，II (二甲苯)各 5 分钟
21.封片：加拿大树胶(或中性树胶)封片。
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范文三：冰冻切片免疫荧光 1. 将组织置于 4%多聚甲醛 6~8h,转至 20%蔗糖至组织沉底,包埋冰冻组织块 2. 冰冻切片机切片 8~10um,室温放置 30min 以上防脱片,-20℃保存 3. 从冰箱拿出的冰冻切片于室温放置 30min 以上,再进行免疫荧光 4. 1XPBS 洗 3 次,每次 3~5min 5. 免疫组化笔画圈,2%BSA 室温或 37℃封闭 1h 6. 一抗 4℃孵育过夜 7. 1XPBS 洗 3 次,每次 3~5min 8. 二抗室温或 37℃,避光孵育 1h 9. 1XPBS 洗 3 次,每次 3~5min 10. DAPI 染色, 11. 1XPBS 洗 3 次,每次 3~5min 12. 滴加防淬灭剂,封片.
范文四：1 冰冻切片4~8um，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟（另：丙酮先在-20C预冷,然后在4C固定片子15分钟,固定后在室温下干燥后再做免疫组化），PBS洗，5分钟×3。
2 用3％（另 0.3%）过氧化氢孵育5~10分钟（另：最好是用3%H2O2/甲醇溶液，室温20分钟。此配方不易产生脱片。配制方法是在9ml甲醇中加30%H2O2 1ml，混匀后使用，每次新鲜配制），消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2。
35~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，
4 滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
5 回收一抗，PBS冲洗，5分钟×3次。
6 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。
7 PBS冲洗，5分钟×3次。
8 显色剂显色（DAB或AEC）。
10 自来水充分冲洗，复染，封片。
如果你的组织曾放在多聚甲醛中固定的话，建议还是抗原修复效果比较好，如果没在甲醛中浸泡，无需抗原修复。
如果你的片子切完后在冰箱中保存的话，做之前，从冰箱取出后先室温半小时，然后入37℃烤箱一小时，再进行免疫组化实验，掉片现象会少一点。我们以前片子从-20℃取出后，接着就做免疫组化，片子掉得很多。
范文五：冰冻切片免疫组化步骤
1. 从-20°取出片子平衡到室温
2. PBS洗 2min 3遍
3. 0.3%H2O2 10min（避光）--用PBS将30% H2O2稀释100倍
4. PBS洗 2min 3遍
5. 10%FBS封闭30-60min（室温）；可以配置10%FBS约10ml，用PBS稀释
6. 一抗（10%FBS配置），60min，室温孵育（注意封闭后不用洗！）
7. PBS洗 2min 3遍
8. 1‰链霉素（带HRP）30min 室温孵育，同样链霉素用10%FBS稀释；若为二抗则也是
用10%FBS稀释，接着孵育半小时。
9. PBS洗 2min 3遍
10. 将玻片擦拭干净，带组织部分保持湿润，DAB显色（bufferA 1ml + bufferB 1滴），用1ml
枪加在载玻片后，进行镜下观察，待特异性蛋白显色适当时，用PBS洗去DAB。
11. 苏木素 2min （待染色效果改变颜色）
12. 1‰盐酸乙醇分化（迅速刷三次）
13. PBS水中洗净有机溶剂
14. 75%、80%、95%、100%酒精脱水
15. 二甲苯2min
16. 二甲苯2min
17. 中性树脂封片
Ps:盖玻片先用盐酸乙醇刷一下，然后用水洗干净，最后泡在二甲苯里，在封片前用无尘纸头擦干净，再封片。
说明一抗配置，如果一抗为100ug（RD）则可以加入100ul的pbs，使浓度在1ug/ul，同时分装抗体。
范文六：冰冻切片的免疫组化染色
1. 新鲜组织立即在恒冷冰冻切片机内切片(也可-80℃保存),厚度为5～6?m。
2. 载玻片可不打底，裱片后，立即用电吹风吹干。
3. 如不马上染色，可密封后-20℃保存。
4. 染色前用冷丙酮在4℃固定10-20分钟。
5. PBS 洗2次,每次5分钟,(必要时应用0.1%柠檬酸钠+0.1%triton 打孔既抗原修复)。
6. 3% H2O2 灭活内源性过氧化物酶,20分钟,避光。
7. 用PBS 洗2次,每次5分钟。
8．正常血清封闭：从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片正面组织周围的水分（保持组织呈湿润状态）,滴加正常山羊或兔血清（与第二抗体同源动物血清）处理，37℃，15 分钟。
9．滴加第一抗体：用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加第一抗体，37℃ 2 小时（也可置于4℃冰箱过夜）。
10．PBS：5 分钟，2 次（置于摇床）。
11．滴加二抗（辣根过氧化物酶标记）， 37℃，40 分钟。
12．PBS：5 分钟，2 次（置于摇床）。
15．DAB显色，镜下观察，适时终止（自来水冲终止）。
16．自来水（细水）充分冲洗。
17．苏木素复染，室温，1-5min，自来水冲洗。（时间可调节，最好
在镜下观察，核染上就好不要过染）。
18．自来水冲洗返蓝，15 分钟。(可调节)
19．梯度酒精脱水：
80%，2 分钟? 95%，2 分钟? 100%，2 次，5 分钟。
20．二甲苯透明：
I，II（二甲苯）各5 分钟
21．封片：
加拿大树胶（或中性树胶）封片。
备注：若用DAB呈色，可经酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片。
若用AEC，则不能用酒精脱水，用吸水纸去周围组织多余的水份，直接将水溶性封片剂（例如明胶甘油）封片。
范文七：免疫荧光操作步骤（漂片，冰冻切片）
免疫组化步骤：
1.将脑片放到，6孔板（或12孔板），按照二抗说明书，加3%双氧水封闭10min（如果是从切片保护液取出，则要用PBS洗一遍）；（二抗不同，操作步骤有差别），本实验室使用的二抗试剂盒为中杉金桥超敏二步法试剂盒；
2.吸去双氧水，PBS洗两遍，将脑片周围的水用吸水纸或卫生纸擦净，注意不要碰到脑片；
3.然后按照一抗说明书，将一抗按比例稀释，加入稀释后的一抗，一般，大鼠脑片一张需50微升一抗稀释液，小鼠脑片为30微升；注意不要让液体流到边上；如果流到边上，要重新加或者加大量，使脑片完全浸入液体；
4.然后，4℃，过夜（18h或者24h），不建议使用37℃；
5.然后，PBS洗净两遍；剩下步骤见二抗试剂盒说明书。
6.DAB配方为：10mg DAB固体加到20ml 0.01MPBS，临用时加100-200微升30%双氧水，注意避光。
7.显色10min，看片子染色深浅情况适当调整显色时间。一般3分钟显色就比较明显，如果20分钟仍未显色，则看下面的参考。
8.然后PBS洗两遍，转移到载玻片，自然晾干。干燥天气2-3h，潮湿天气3-4h。
9.脱水：70%酒精3min，95%酒精3min，100%酒精3min，100%酒精2min，二甲苯2min，二甲苯3-5min。如果片子上盐分较多，在70%酒精前在双蒸水1min。
免疫荧光步骤及注意事项：
1， 将脑片放到6空板的山羊血清封闭液中，封闭20-40min；（如果是从切片保
护液取出，则要用PBS洗一遍）
2， 吸去山羊血清，PBS洗两遍，将脑片周围的水用吸水纸或卫生纸擦净，注意
不要碰到脑片；
3， 然后按照一抗说明书，将一抗按比例稀释，加入PBS稀释后的一抗，一般，
大鼠脑片一张需50微升一抗稀释液，小鼠脑片为30微升；注意不要让液体流到边上；如果流到边上，要重新加或者加大量，使脑片完全浸入液体； 4， 4℃，过夜（18h或者24h），不建议使用37℃，如果荧光亮度不强，可以延
长孵育时间到48或72小时；
5， 然后，PBS洗净两——三遍，按照二抗说明书稀释的荧光二抗，室温孵育2
小时。注意避光操作。
6， 0.01M PBS洗两遍，转移到载玻片上，避光自然晾干；
7， 滴加防淬灭剂后，盖上盖玻片镜下观察。
常见问题：
1， 荧光太暗：可能蛋白表达少；可能一抗孵育时间短；二抗孵育时间短；清洗
次数过多；溶液pH不合适；荧光萃灭；一抗浓度过低或过高；二抗浓度过低或过高；激发波长不在抗体适用波段。
2， 背景荧光太深：一抗浓度过高，清洗不彻底；二抗浓度过高，清洗不彻底；
封闭时间过短，非特异性过强；一抗非特异性过强；二抗非特异性过强；显微镜荧光强度过强。
总之实验是喜欢强阳性，不喜欢假阴性，呵呵。任何实验都需要花时间摸索才
能找到其最佳的工作条件。
熟能生巧，边学习边练习边思考方能学好。有不足之处，敬请各位老师同学批评指正，以使该实验更加臻美。若有不解之处，请询冯展波，或者免疫学技术交流群：。QQ:谢谢。
祝实验顺利！
另附免疫组化常见问题解析。原理是相同的，只是最后的显色方法不一样，有些问题有启发作用。
免疫组织化学
1. 边缘效应?
1）组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱漂浮在液体中，每次清洗不易将组织下面试
剂洗尽所致. 解决办法：制备优质的胶片（APES或多聚赖氨酸），切出尽量薄的组织切片，不厚于4微米，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死较多的组织。
2）切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心组织高而致染色深。解决办法：试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘2mm。用组化笔画圈时，为了避免油剂的影响，画圈应距组织边缘3-4mm。
2. 产生组织切片非特异性染色的原因有哪些？如何解决？
1. 抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。
解决办法: 这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条。
2. 一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。
3. 内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长
灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；
4. 非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度
来加强封闭效果；
5. DAB孵育时间过长或浓度过高；
6. PBS冲洗不充分，残留抗体结果增强着色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤为重要；
7. 标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。
3. 免疫组化染色呈阴性结果的原因有哪些？
1、抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误。不知抗体是进口的还是国产的工作液，怎么这么高
稀释度也没能做出阳性结果？另外，不是抗体浓度越高就越易出现阳性结果，抗原抗体反应有前
带和后带效应，必须摸索最佳浓度。
2、抗原修复不全，对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，以利于与
抗体结合;建议微波修复用高火4次*6min试试。有人做过实验，这是最佳的时间和次数。
若不行，还可高压修复。
3、组织切片本身这种抗原含量低；
4、血清封闭时间过长。
5、DAB孵育时间过短。
6、细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应。
7、开始做免疫组化，我建议你一定要首先做个阳性对照片，排除抗体等外的方法问题。
4. 背景强的原因?
1, 考虑一抗浓度高；
2,然后调整DAB孵育时间；
3,也要考虑血清封闭时间是否过短
4,适当增加抗体孵育后的浸洗次数和延长浸洗时间等。
5. DAB显色真的需要3-10分钟吗？我之前做的显色40秒就够了，再多本底就太深，现在做另一个显色3分钟也不出，真的有必要延长显色时间吗？
1. DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗；
2. DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；
3. 此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；
4. DAB显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗4度过夜）；另一方面就是封闭时间过长。
6 . 石蜡切片在染色过程中出现脱片现象？，
1烤片时间不够，或温度不够，可以延长烤片时间和提高烤片温度
二，用含有多聚赖氨酸的玻片，可以购买到或这自己做
三，有些组织本身就容易掉片，如骨组织等，操作时冲PBS不要直接冲到组织上，冲到组织上方，
让它流下冲洗组织，四，用高温修复时，温度骤冷也可能引起。
7. 年前爬的细胞片在-20度放了半年（保鲜膜密封），现在取出来再作，做了两次，步骤均是按以前的作
的，但今天做时，原来显色很强的片子现在显色很弱了，问什么呢？ 是不是片子放的时间太长了？抗体在
4度放的时间也不长而且这次浓度比以前做的还高?
1. 首先，抗体浓度和孵育时间在免疫组化中至关重要。在抗原抗体反应并非抗体浓度越高，反
应越强烈，这叫前带现象。所以选择最佳的一抗浓度和孵育条件也是十分重要的，其实抗体浓度过高或过低均会引起阴性。 2. 我到认为你这片子的影响可能更大。尽管在-20度保存，但是时间一般超过3个月就不能保证其中抗原的丢失，建议可以重新爬片，以排除方法和抗原的原因。
3. 你说抗体放在4度保存是指未稀释还是稀释后抗体，存放多长时间？一般稀释后抗体不能保存很长时间的。
8. 为什么切片倾斜，抗体分布不均匀，就会造成一半阳性，一半阴性？我认为，即使切片倾斜，抗体覆盖少的那部分组织和其他部分抗体的浓度是一样的，只是抗体体积的大小差异！如果说抗体倾斜没覆盖好的地方是阴性，那为什么不是干片所导致的非特异性高背景的染色呢？
当切片倾斜到有一半甚至都没液体时，就会出现阴阳脸样的着色。你认为呢？
9. 高温抗原修复后就没必要灭火内源性过氧化物酶?
经过高温POD 已经灭活了，不错POD 是被被灭活了，但它仍有还原能力，仍能跟DAB
发生氧化还原反应，使DAB 显色，我们用双氧水是耗竭POD 的还原能力，使之不能在跟DAB反应。所以无论修复与否都应该灭活POD，尽可能消除非特异性着色。 10. 冰冻切片有时会有小洞?
冰冻切片有时会发现切片上会有空洞，这是因为组织在冰冻过程中形成冰晶，形成冰晶的原因一是组织冰冻时间太慢，或者冰冻的温度不够低，慢慢形成冰晶，二是有些组织在冰冻之前需要做适当的固定，如脑组织，然后放入30%的蔗糖4度冰箱过夜以减少冰晶形成，并且能最大程度保持组织细胞形态。另外在切片是组织块复温要在37度速融，否则易造成组织块的破坏。
11. 常用免疫组化结果分析方法?
1. 阳性着色细胞计数法。在40*光镜下，随机选择不重叠的10个视野，人工或机器计数阳性着色细胞，每组3~6张不同动物组织切片，然后进行组间比较即可。
2. 灰密度分析法。通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用image j进行灰密度分析，然后进行统计分析即可。
3. 评分法。通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度（0~3分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色）、阳性范围进行评分（1~4分为0~25%、26~50%、51~75%、76~100%），最终可以分数相加，再进行比较。
对于以上这几种方法，各有利弊，请细心选择。要想得到正确结果的前提是你要做出着色均匀、背景很浅的高质量切片。
12. DAB呈色后到底什么样染色是特异性染色？
阳性标记可以从色度特征，阳性标记细胞学特征来进行基本的判断。
色度特征：一般而言，抗原含量越多，分布密度越高，标记方法越敏感，阳性结果显色则越强。根据阳性标记的显色程度分为：淡黄色，提示为弱抗原；棕黄色，提示为中等度抗原；棕黑色，示为强抗原。在结果判断中，后两者较有意义 ，可作为判断依据。 细胞学特征：
阳性表达必须在细胞特定的抗原部位，若不在抗原所在部位的阳性表达即使阳性也不应作为判断依据。一般分为胞膜型，胞核型，胞质型，微绒毛型,复合型几种。这是需要结合背景知识的。
同样，非特异性染色也有一定的特点：它首先是指抗原无明确定位，各种细胞累及一片，色度无深浅之分，这种标记组织片不能作为免疫组织标记结果判断的依据，造成非选民性染色的原因常为组织标本固定不佳，抗体质量问题或稀释度不合理及操作方法不规范等。因此，免疫组化特异性染色定位非常重要，一般情况下，阳性细胞与阴性细胞相互交杂，阳性染色强度深浅不一。如果缺乏细胞音的不均一性染色，即或呈阳性染色，常提示为非特异性染色。另外，组织片边缘反应和出血坏死灶周围阳笥反应不能作为诊断依据。
13. 1. 石蜡切片在染色过程中出现脱片现象？我用组织芯片和普通切片在多种条件下进行
了抗原修复实验，发现在热修复后，组织脱片最主要原因是组织脱水不良，肿瘤组织黏附性差在小块组织时也容易撕脱（减小热修复加热器功率，PBS冲洗时不要直对组织冲洗、可以有效防范）。
2. DAB显色后发现切片着色不均匀：如一片着色，一片不着色或染色浅？这就是免疫组化染色的阴阳脸，免疫组化实验是环环相扣的实验，任何一步试剂孵育不全（没有均匀的在组织上孵育）都可能导致这样的结果。
3. 免疫组化结果老是出现阴性结果？那就要考虑真阴性还是假阴性！假阴性是你操作不当或者试剂质量的问题了。
4. 切片染色后背景太深，不易区分特异性与非特异性着色？你的抗体是否特异，孵育时间温度浓度是否过长！
5. 一抗从4度拿出后，为什么有人说要37度复温，目的是什么？我没遇到这样的说法，是否是想加速复温？还有我不知道国内的院校为什么对37℃孵育如此感兴趣，在你们买国外抗体时，他们的说明书上除了酶修复要37℃外，其他步骤中均没有说要在37℃中孵育。
6. 免疫组化中抗原修复的最佳条件是什么？尤其是微波修复。抗原修复没有什么最佳条件，只有可能管用的修复条件。
7. 有人在一抗孵育前用tritonX100来通透细胞，对石蜡切片需要否？tritonX100是脂质溶解剂，做免疫细胞化学时细胞膜是完整的半透膜，孵育的抗体要自由的通过细胞膜就要用tritonX100来破膜。石蜡切片细胞多数是切开状态了。但是脂质有时会吸附抗体，含脂质高的组织也可以用triton。
8. 苏木素复染的时间应该是多少？复染过度咋办？要看你是用什么苏木素，免疫组化复染，不比我们平常的HE，它只要一般的轻微染色就够了，染过了就凑合着看，或者试试1％盐酸酒精。
9. 抗原修复应在灭活POD之前还是之后？看过国外文献说是要在抗原修复之前修复内源性过氧化物酶，还用CD3来说事，当初刚到病理科也傻乎乎的进行验证了，没有发现老外所说的情况，写信质问，可能是他看不懂我的英文，没回复。
10. DAB显色时间到底多少为最佳？一定要是3~10分钟吗？最佳显色时间应该镜下观察，但是平时片子太多没法一一看过，就大致订个时间。
11. DAB呈色后到底什么样染色是特异性染色？这是到如何阅片的内容，不是三言两语可以说清的。
熟能生巧，边学习边练习边思考方能学好。有不足之处，敬请各位老师同学批评指正，以使该实验更加臻美。若有不解之处，请询冯展波，或者免疫学技术交流群：。QQ:谢谢。
范文八：石蜡切片免疫组化
60度温箱加热.30-60min,二甲苯5min→二甲苯5min→二甲苯10min→无水乙醇5min→无水乙醇5min→95%乙醇5min
2.水冲洗3min,PBS漂洗5min×3遍
3.抗原修复：
柠檬酸浸泡水浴煮沸持续12min,自然降温（很重要）
4.水冲洗3min,PBS漂洗5min×3遍
5.H2O2漂洗： 3%H2O2漂洗15min
6.水冲洗3min,PBS漂洗5min×3遍
7.一抗封闭 ，4℃过夜
8.水冲洗3min,PBS漂洗5min×3遍
9.二抗：37℃温箱敷育30min
10.水冲洗1min,PBS漂洗5min×3遍
11.DAB显色
12.水冲洗3min,无须PBS漂洗
13.苏木素 复染（约3-5min）
14.水冲洗3min,无须PBS漂洗
15.盐酸酒精分化（2s）
16. 水冲洗3min,无须PBS漂洗
17.如果分化过度，重新苏木素复染
18.脱水：95%乙醇5min→95%乙醇5min→无水乙醇5min→无水乙醇5min
19.自然晾干，封片
范文九：石蜡切片免疫组化步骤
1. 石蜡切片放置在60℃恒温箱中烘烤120分钟。
2. 脱蜡和水化：二甲苯(20min)→二甲苯(20min)→无水乙醇(5min×2次)→95%乙醇(5min×2)→90%(5min)→80%乙醇(5min)
3. PBS洗2次各5min，蒸馏水冲洗1次5min，
4. 抗原修复：压力锅开始喷气时，盖上气阀约1.5~2.5min，冷却，取下气阀，冷却至室温
5. 蒸馏水洗1次5min，PBS洗2次各5min
6. 加3%H2O2孵育30min(室温)
7. PBS洗3次各5min
8. 加兰色试剂，室温孵育30min，倾去，勿洗
9. 滴加一抗，37℃孵育2~3h，或4℃过夜
10. PBS冲洗3次各5min
11. 滴加黄色试剂(B)，37℃孵育30min
12. PBS洗3次各5min
13. 滴加试剂C(橙色)，37℃孵育30min
14. PBS洗3次各5min
15. DAB显色5~20min，自来水充分冲洗
16. 苏木素复染2~3min，自来水充分冲洗
17. 盐酸酒精分化2s，自来水充分冲洗
18. 脱水、透明80%(5min)→95%(5min)→95%(5min)→100%(5min)→100%(5min)→二甲苯(10min)→二甲苯(10min)
19. 封片：中性树脂，加盖玻片(组织部位切勿残留小气泡)，自然晾干
范文十：实验与实习　
卫生职业教育　
Ｖ １ ８ ２ １　Ｎ ． Ｄ２　 ０ ０ ｏ 　 ． ２
关键词 ： 免疫组化 Ａ Ｃ法； Ｂ 脑组织； 冰冻切片　 中图分类号 ： ４ ４ １ Ｇ ２． 　 ３ 文献标识 码：　 Ｂ 文章编号 ：６ １ １４ （０ ０ ０— １８ ０ 　 １７ — ２ ６ ２ １ ）２ ０　 — ２ １ Ａ Ｃ法即抗生物素一 Ｂ 生物素一 过氧化酶法 。Ａ Ｃ法是 Ｈ ｕ Ｂ ｓ　 等人于 １ ８ 年在 Ｂ Ａ ９１ Ｒ Ｂ法和 Ｌ Ｂ法 的基础上改 良的ｆ Ａ ｌ １ 。其特　 点是利用抗生物素分别连接生 物素标 记的第 １抗体和生物素　 Ｉ
每次 ５ｒ ｎ 至切片中无气泡为止。５ 加 ０３ ．ｚ 滴， 　 ｉ， ａ （） ． ， 　 ％Ｈ Ｏ １ 于室温　 下放置 １　 ｉ ０ｒ ｎ以去除脑组织切 片中的过氧化物酶 ， １２ ａ Ｈ０ 的浓　
度不能过高 ， 放置 的时间不能太长 ， 否则容易脱 片和烂片。（ ） ６　
用 ０ １ 　Ｂ 将其漂洗 ３ ， ．　 ＰＳ ０Ｍ 次 每次 ５ｒｎ至切片无 气泡为止。 　 ｉ， ａ 　 （） ７ 加正常 山羊血清工作液将脑 片封闭 ２ 　 ｉ， ０ｍ ｎ 目的是使脑 片　
的非特异反应物和羊血清相结合 ，以降低脑片的染色背景 ， 增　
强对比度 ， 甩去多余液体。（ ） ８滴加第 １ 抗体 ５ Ｌ 放置于 ４℃　 ０‘ ， ｉ 冰箱 内过夜。（ ）用 ０ １ 　 Ｂ ９ ． 　 Ｐ Ｓ将其漂洗 ３次，每次 ５ｒ ｎ　 ０ Ｍ 　 ｉ。 ａ
标记 的酶。其第 １ 抗体不为标记物所标记 ，生物素标记 的第 １ Ｉ 　
抗体与 Ａ Ｃ复合物相连接 。Ａ Ｃ复合物是将过氧化酶连接在　 Ｂ Ｂ
（ ０滴加试剂 Ｂ５ 　ｌ １） 　Ｏ ， 置于 ３ ７℃环境中 ２ ａｎ （１用０ ｌＭ ０ｒ 。 １ ） ． 　 　 ｉ Ｏ
ＰＳ Ｂ 将其漂洗 ３次 ， 每次 ５ｒｎ １ ） 　 ｉ。（２ 滴加试剂 Ｃ 于 ３ ａ 。 ７℃水浴　
生物素上 ，再将生物素一 过氧化酶连接物与过量的抗生物素蛋　 白反应而制备的。用 Ａ Ｃ法做其他组织 的冰冻切片容易得 出　 Ｂ 结果 ， 但做大 鼠脑组织 的冰冻切 片则 比较困难 ， 因为完整 的大　 鼠脑组织切片 面积较大 ， 容易破碎 ， 加上神经系统 中由于抗原　
的表达量较少 ， 因此要做 出优质的脑组织冰冻切片就更难 了【　 ２ 】 。 笔者在 用 Ａ Ｃ法做 大 鼠脑组 织冰 冻切片 的免疫组 化 的过 程　 Ｂ
２　ｉ。 １ ） ０ １ 　Ｂ 将其漂洗 ３ 每次 ５ ｉ。 １） Ｏ ｎ （３用 ． 　 Ｐ Ｓ ｍ ０Ｍ 次， 　 ｎ （ 用　 ｍ ４
Ｄ Ｂ显色 １～ ５ｍｎ 一般不超过 ３ 　 ｉ， Ａ ０ １　 ｉ， ０ｍｎ 因为阳性物质在超过　
定时间后是不可能随时间延长而继续增加的。可在显微镜下　
控整个显色过程 。（５ 用苏木复染 ２ｒｎ左右 ， １） 　ｉ ａ 使酸碱分化 。 　 （ ６梯度酒精脱水 ， ２） 二甲苯透明 ， 中性树胶封片。 　
３ 做脑 组 织 免疫 组 化 的体 会　
３１ 做 脑 组织 免痰 组化 时最 常见 的 问题　 ．
中， 过改变一些实验环节 ， 出的大 鼠脑组织 冰冻 片的质　 通 使做
量大有提高。现介绍如下。 　
ｌ 脑 组 织的 取材 与切 片　
（ ） 片现象严重。多聚赖氨酸 、 Ｐ Ｓ为 目前免疫组化染　 １脱 ＡＥ 色工作 中常用 的一种防脱片剂 ， 但价格 昂贵 ， 因而应用受到限　
制 。本实验室在做脑组织免疫组化时用 明胶硫酸铬钾 ２次涂　 片， 发现其 防脱片效果较好 ， 脱片率＜ ． 　 ２５ ％。
将大 鼠用 ４ ％水合氯醛（ ０　 ｇ【） １０ｍ ， 腹腔 注射麻醉后 ， ｌ ｇ 开胸　 暴露心脏 ， １ Ｇ注射针头刺人其左心室尖部 ， 用 ２ 并用止血钳固　 定 ， 开右心耳 ， 剪 灌人 １ ％多聚甲醛 １０ｍ 直至肝脏变色 ， ５　 ｌ 在右　 心耳流出无色透明液体后 ，再缓慢灌人 ４ ％多聚甲醛 Ｏ１Ｍ， ． 磷　 　 酸缓冲液约 ４ Ｏｍ 直至其肝脏 、 ０　 ｌ 四肢 、 头颈和尾部变硬 ， 将头剪　 下 ， 咬骨钳咬开颅骨 ， 用 仔细剥离完整 的脑组织 ， ４ 于 ％多聚 甲 　 醛中后 固定 ， 完成后置于 ４℃冰箱内保存。经后 固定 的脑组织　 先置于 ２ ％ ０ 蔗糖中至沉底 ，再放入 ３ ％蔗糖溶液 中至沉底后 ， ０ 　 用冰冻切片机切取其 中背侧海马的 ８ 　ｍ厚冠状平面的脑片 ， 　 贴在用明胶硫酸铬钾处理过 的玻片上， ６ 于 Ｏ℃烤 ２ｈ　 　。
２ 脑组织的免疫组化实验步骤　
（） ２ 在本次脑组织免疫组化过程 中应该有 阳性结 果 ， 但脑　 片不显色 ， 这可能与第 １ 抗体浓度不合适或抗体效价降低、 羊血　 清封闭时间太长、 Ａ Ｄ Ｂ显色时间过短等因素有关。 　 （） ３ 虽做 出阳性结果 ， 但脑 片质量太差 ， 出现小血管染色　 如 现象 ， 可能原因为灌流不充分 ； 冰晶和烂片 。 有 可能由于蔗糖脱　
水不彻底或 Ｈ０ 的浓度 高、 ２２ 放置的时间长等因素影响所致。 　
（） ４脑组织切 片染色后非特异性反应太强 ， 染色背景过高 ， 　
出现假阳性及对 比度降低 ， 可能是血清封闭时间过短、 １ 第 抗体　
（） １取切片在 ５ ８℃～ ０℃的烤箱 中烤 １ ， ６ 　 以增加切片组织　 ｈ 的黏附性。 在该过程 中要严格控制温度， 温度过高 ， 抗原会被破　 坏； 温度过低 ， 易造成脱 片 。（ ） 则 ２ 抗原修 复 ： 片经 ０ １Ｍ　 切 ．　 ０
浓度过高、 清洗不充分及 Ｄ Ｂ使用不正确等因素所致 。
３２ 做 脑 组 织 免 疫组 化 时 的关麓 ｜ 节　 ． 不
在上述操作过程中， ４ 有 个重要环节是影响实验成败的关　
键 ：１ （ ）脑组织冰冻切片一定要在 ５ ８℃— ０℃的烤箱内烤 １ ， ６ 　　 ｈ
ｐ ６ 柠檬酸缓 冲液高温 、 Ｈ． ０ 高压修 复 ５ｍｎ ３在 ３ 用 １ 　 　 ｉ。（） ７℃ ％
Ｔ ｔｔ １０漂洗脑 片 ３　 ｉ，ｆｏＸ １０为一种非离子型 的　 ｉｒ ｆｏＸ一０ ０ｒｎ Ｔ ｔ 一 ０ ａ ｉｎ
去污剂 ， 可与核膜上 的脂质蛋 白交联 ， 具有较强 的去脂作用 ， 可　 增加抗体对细胞膜的穿透力 。４ 用 ０Ｏ　 　Ｂ （ ） ．１Ｍ Ｐ Ｓ将其 漂洗 ３ ， 次 　
以增加脑组织的黏附性。（） 的浓度和抗体 的质量是否合　 ２抗体
适。（ ） ３ 是否滴加了 Ｔ ｔｎ １０ 因为 Ｔ ｔｎ 一 ０ ｉ ｆｏＸ一０ ， ｎｏＸ １０具有穿透细　
胞膜的作用 ， 能让更 多的抗体穿透细胞膜与抗原起反应 。（ ） ４ 抗　
ｌ ８　 １一
实验 与 实 习　
卫 生职 业 教 育　
Ｖｏ Ｉ ８ ０ ０ Ｎｏ ２ ｌ 　２ １ 　 ２ ．　
医学生物学实验教学改革帕探索　
刘　 艳 ， 高碧珍 ， 林
晴， 严晓丹　
（ 福建中医学 院中西 医结合系 ， 福建 福州 ３ ０ ０ ） ５ １ ８　
要： 医学生物 学实验是 医学生物 学的重要组成部分之一。根据 学院 的办 学条件 ， 对实验教 学的改革主要 着眼于对 学生　
基本 实验操作技能的训练 ， 同时还要 注重对 实验教 学方法的改革 。另外 ， 在特定的实验板块 中增加设计创新性实验项 目。 　 关键词 ： 医学生物学； 实验教 学； 教学改革　
中 图分 类号 ： ４ ０ Ｇ ２　 文 献 标 识 码 ：　 Ａ 文章 编 号 ：６ １ １４ （０ ０ ０ — １９ ０　 １７ — ２ ６ ２ １ ）２ ０ １— ２
医学生物学 是一 门涵盖生 物学与医学知 识且综合 性很强　 的学科 。医学生物学实验是医学生物学的重要组成部 分之一 。 　
医 学 生 物 学 实 验 教 学 的 主 要 目的是 对 学 生 进 行 基 本 操 作 技 能　
在实验教学改革的具体实施过程 中， 应注重 以下几个方面　
的 问题 。 　
２１ 强调 理解 实验 原 理 ． 　
的训练 ， 培养学生勇 于探索 、 不怕挫折的精神 ， 实事求是的科学　
态度和一丝 不苟 的工作作 风 ， 高学生独立思考 、 析问题和　 提 分
解决 问题 的能 力 。 　 １ 医学 生 物 学 实 验教 学 的 现 状 及 教 学 改革 思 路　
注重对 实验原理 、 方法的介绍 ， 以思考题 的形式提 出一　 并 些与实验原理 、 方法 、 结果相关 的问题 ， 使学生了解 实验的理论　 依据和实际应用价值 ， 明确实验的 目的、 方法
， 通过对 实验结果　 的分析和做思考题进一步加深对实验原理及方法的理解 ， 高　 提
学 生 分 析 问题 和解 决 问题 的能 力 。 　
２２ 强调 实验 的规 范撼 作　 ．
过去 医学生物学 的实验教学 内容多偏重于验证理论 ， 且实　 验内容 比较 陈旧 ， 在实验教学方法上 ， 多地 注重 了教师 的主　 更
导作 用 ， 忽 视 了学 生 的 主 体 作 用 ， 注入 式 ” 教 学 方 法 使 学　 而 “ 的
对 学 生 进 行 规 范 的 基本 操 作 技 能 训 练 是 医学 生 物 学 实 验　
生处 于被 动地位 ， 对实验 过程仅是 机械地操作 、 模仿 ， 其结果 是　 学 生对知识 的印象不深 ， 积极性和 主动性受到约束 ， 导致 实验　 教学效果不佳 。高校教学改革 的不断深入和新 知识 、 新方 法及　 新技 术的不断 涌现 ，要求 当今 医学 生不仅要有基 本的操作技　 能， 还要有分析问题 、 解决问题和创新的能力 ， 以符合高级 医学　 人才培养 的要求 。如何在实验教学中激发学生 的学 习兴趣 ， 调　
动 学 生 的 积 极 性 、 动 性 和 创 造 性 ， 学 生 在 实 验 教 学 中变 被 　 主 使
教学的主要任务之一。如显微镜 的使用方法是学生必须掌握 的　
项基本操作技能 ， 传统的教学 方法是先 由教师简要介绍显微　
镜的结构 和使用方法 ， 然后再 由学生进行 练习。然而 ， 种教学　 这
方 法 在后 续 课 程 中反 映 出的 问 题 相 当 多 ， 弄 坏 标 本 的 现 象 很　 如
普遍 ， 操作过程错误频繁 ， 明这种 教学方法 的效果并 不是很　 说 好 。因此 ， 我们在实验教学 中特别强调对学生进行基本 技能规　
范操作 的训练 ，首先让学生与教师同步完成每个操作步骤 ， 教　 师在此期 间及 时发现和纠正学生错误 的操作方法 ， 然后 再由学　
生反复练习。改变教学方法后 ， 上述问题大为减少 ， 明强调规　 说 范操作 对顺利完成 实验 ，提高实验质量是一 个非常重要 的环　
动为主动 ， 是实验教学 改革 中的一个重点 问题 。 　
２ 医学 生 物 学 实 验教 学 改革 的 内 容　
根据 医学生物学课程开设 的时间 、 学生 的特点 和学院 的办　 学条件 ，我们在对实验教 学的改革 中除 了增 加学生 的感 性认　 识， 使其巩 固、 深化理解所学的理论知识外 ， 主要着眼于对学生　
的 基 本 实 验 操 作技 能进 行 训 练 。通 过 实 验 ， 学生 能 够 掌 握 基　 使 本 的 实 验 方 法 、 段 和 技 能 ， 养 学 生 灵 活运 用 所 学 知 识 和 技　 手 培
２３ 注重基本操作 的重 复训侏辩 ． 　 在显 微镜 的使用过程 中会经常遇到一些技术问题 ， 在一次　
实验课的时
间 内，既要让学生熟悉显微镜的结构和使用方法 ， 　
又要让学生能解决在使用过程 中遇到 的技术问题 ， 这显然是不　
能发现 问题 、 分析 问题和解决问题 的能力。另外 ， 要在特定 的实　 验板块 中如群体遗传实验板块 ， 增加设计创新性实验项 目【　 ｌ １ 。
Ｉ ． … ｌＩ●　 ．｜ｌ●一 “．ｆ ?? ｜ｎ ．，’¨ Ｉ　 ＩＩ 　 Ｉ－ Ｉ●＿ Ｉ●● 　 Ｉ ＿ 。 Ｉ “．１ ● … ＩＩ ．ｌ● 　 　
可能的 ， 这也是传统教学方法中没有解决好 的问题 。为 了解决　
Ｉ? ’｜ ， Ｉ ‘ …? 　…ｌ 一 ． ? …Ｊ －’ Ｉ ? Ｉ ， 　 ＿ ＿ ? ｌ 　｜ …? 　 ｌ ‘ｌ 　 ｌ ｔ ‘ －　 ” 　 　 ｌ 　
原修复。众所周知 ， 聚甲醛对抗原有封闭作用 ， 多 并且在神经系　 统 中由于抗原表达量较少 ， 造成 在免疫组化染色中需要配制 较　
参考文献： 　
【 巴迎 春 ， １ ］ 王廷华 ， 明． 李 用免疫组化 Ａ Ｃ法 做好脑片 的体会 ［． Ｂ Ｊ 四川　 】 解剖学杂志 ，０ ６ １ （ ）５～ ９ ２ ０ ，４ １ ：８５ 。 　
高浓度的抗体工作液 ， 造成抗体消耗量较大 ， 染色效果不佳圈　 。 综上所述 ， 我们认为 ， 脑组织 的免疫组化操作虽然简单 ， 但　 影响其质 量的因素众多。因此我们就要按照上述规范的操作程　 序， 在操 作过程 中加强工作责 任心和娴熟 的操作技 巧 ， 以获得　
赏心 悦 目的脑 片 。 　
【詹合琴 ， ２ 】 李生营 ， 尹志奎 ， 脑 组织切 片免 疫组化技术 中漂片法与　 等．
贴片法效果 比较【． Ｊ 新乡医学院学报 ，０ ６，３ １ ：— １ 】 ２０ ２ （ ）９ １． 　
【】 ３ 李俊祥 ， 于建 云 ， 李娟娟 ， ． 等 抗原修 复对多 聚甲醛固定脑组织 冰冻　
切 片免疫组化 反应 的影响阴． 中华医学实践杂志 ，０ ５４ ９）９ ４ ９５　 ２ ０ 。（ ：０ — ０ ．
１ ９　 １—