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求助怎样使细菌细胞裂解但胞内的蛋白（例如酶）不失活？
如题：怎样使细菌细胞裂解但胞内的蛋白（例如酶）不失活？除了用超声波还有没有其他方法？
我尝试过超声破碎，放在冰浴中，5秒破碎，5秒间隔，破碎了10分钟，但是离心后取上清做实验发现没有活性。我决定尝试一下溶菌酶。谢谢你呀
具体怎么做呢？可不可以详细说一下？
超声波破碎后上清没有酶活可能是你超声波条件的问题
1：破碎细胞没破开，功率太低，时间太短都可能造成细胞没碎开，没碎开哪来酶活，你破碎后澄清一些没，相比破碎之前？
2：蛋白失活，不太清楚你是破的野生菌还是重组菌，可能的原因是功率太大超声波时间太长发热造成破碎后的蛋白变性了，这个你可以观察到超声波后有很多的片状沉淀，那就是变性的蛋白，重组菌的话还要考虑包涵体的问题.
PS：:hand:&&GL.
我破碎后是澄清了些的。。至于蛋白有没有变性，没仔细看。再试一把好了。我破的是野生型菌和突变体（敲除了一个基因的），应该不存在你说的包涵体的问题。
p.s.谢谢啦
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随时随地聊科研超声波破碎细胞的常见问题
发布时间： 9:36:38
超声波破碎细胞的常见问题 &&& 大肠杆菌表达外源蛋白，在超声破碎的时候，用含有1%triton-X-100的PBS悬浮，然后超声的效果较
好，1%triton-X-100的作用还是很明显的，对其他的一些细菌同样起作用，比如链霉菌。
&&& 细菌沉淀直接加样品1buffer，再加5ul的巯基乙醇，混匀，离心，煮沸10min，直接上样，染色脱色步
骤如下:将胶放入适量的染色液微波炉里加热1min(下次适当补点醋酸即可),将染色液换成大量的水(自来水即
可)在微波炉煮10min 就可以。
&&& 在表达重组蛋白后超声波破碎细胞，采用冰浴，400w，破2s停1s，但是不一会就产生大量泡沫，影响&了破碎功率，pbs和tris缓冲液都是这样，最后都是破碎不完全，而我的目的蛋白就在这些未破碎的细胞中。&1*会产生气泡是因为你的探头位置没放好。探头一定要接近底部，约1cm（我一般是距底部0.5mm）。功&率根据仪器不同会有所不同，但你可以观察液面，有波动但不要太剧烈就好。&2*破3S停10S，破个二三十次看看。
3*变幅杆位置摆放也要注意，听声音如果不对的话就要及时调整。另外可以从菌浓度方面考虑。 在破碎时&试着加大体积,强度最好不要超过60%. &4*尝试超8s停8s,对有些菌体蛋白来说，你的方法很难散热，导致蛋白变性产生气泡，最好停顿时间稍长一&些，这种情况多见于包涵体形式的蛋白。
链霉菌（放线菌）超声破碎的，用的方法条件是什么？&前处理一般就是配置成一定浓度的菌悬液。
使用超声破碎时采用的具体条件是：
(1)取细菌的24 h培养液于5 000 r／min 下离心5 min收集菌体．&(2)用pH 7．5的Na2HPO -NaH2PO 缓冲液洗涤3次，再用该缓冲液将菌体配成1：3的菌悬液．置于40 &mL大塑料试管内．&(3)将大塑料试管置于冰浴中，采用超声波破碎(功率200 W，1／2”探头，破碎30 s，间歇30 S)．&(4)破碎液于12 000 r／min下高速冷冻离心30 min，收集细胞碎片和上清夜．
&&& 超声破菌流程与 上述基本一致，就是洗涤菌体也可以用预冷的生理盐水或pH8的Tris－HCl，洗涤一次就&可以。另外，超声剂量随样品量、菌体改变比较大，功率可以到400－600w，超5s，停5s，冰浴，要加终&浓度1 mM的PMSF。为确定合适的超声强度和次数，有必要随时镜检观察菌体是否完全破碎。 &&&& 放线菌属于原核生物系统进化树上的（G＋C）摩尔百分含量（mol％）高的革兰氏阳性菌&（Eubacteria）分枝类群，它虽然具有原核生物特有的分子生物学特性，但在其不同类群中，细胞壁的化学&组分变化很大。
&&& 在做大肠杆菌超声时，采用的是400W，超5停5的方法，效果不错，但是用在链霉菌上，似乎没什么效&果。会不会就是由于细胞壁组成差异造成的呢，因为大肠杆菌式属于革兰氏阴性菌的。
&&& 再有镜检是检验破碎效果,但是细胞破碎程度和我需要的酶获得之间有正比关系吗？破碎时间长也会影响到&酶的活性。所以想问问anaisai战友，你提供的“功率200 W，1／2”探头，破碎30 s，间歇30 S”的条&件好像是用于破碎链霉菌孢子的，也可以用于发酵离心后的菌泥吗？如果可以，你破碎的全程时间大概是多&少呢？
&&& 如果你需要的是胞内酶，细胞破碎程度和需要的酶获得之间基本上有正比关系。破碎时间长的确会影响到&酶的活性。这就需要在最佳的破碎时间和酶活性之间做出判断，最直接的办法是先绘制相关曲线（酶活性和&时间的关系曲线）。
&&& 实验中，破碎的是棒状杆菌（也是很难破壁的G+菌），破碎时间控制在30min左右，酶活较好。
如果是基质菌丝的话,好可以考虑用溶菌酶处理一下.
一般来讲这几种方法读可以的:&一,液氮研磨&二,用french press破碎&三，超声波破碎
四，溶菌酶处理预处理
&&& 超声波是物质介质中的一种弹性机械波，它既是一种波动形式,又是一种能量形式。超声对细胞的作用主要&有热效应，空化效应和机械效应。热效应是当超声在介质中传播时，摩擦力阻碍了由超声引起的分子震动，&使部分能量转化为局部高热（42－43℃）。空化效应是在超声照射下，生物体内形成空泡，随着空泡震动和&其猛烈的聚爆而产生出机械剪切压力和动荡。另外，空化泡破裂时产生瞬时高温（约5000℃）、高压（可达&500×104Pa），可使水蒸气热解离产生.OH自由基和.H原子，由.OH自由基和.H原子引起的氧化还原反应&可导致多聚物降解、酶失活、脂质过氧化和细胞杀伤。机械效应是超声的原发效应，超声波在传播过程中介&质质点交替地压缩与伸张构成了压力变化，引起细胞结构损伤。损伤作用的强弱与超声的频率和强度密切相&关。
&&& 100g大肠杆菌溶于1L破碎液里（破碎掖：50mM Tris-Cl(PH8.5) 5mM EDTA 0.14M NaCl），搅&拌，发现菌液发粘，菌体不能够很好分散，用高压匀质机破碎，加压后，菌液不能进入匀质机，速度很慢，&请问是何原因？能有好的办法解决，很好用匀质机快速破碎菌体？ &将破碎液的量加大，不能很好分散可能是量太大 。超声处理5－10分钟，菌液粘度即可大大降低，也可促进&菌体分散。&&& 不同型号的设备功率不一样，功率的大小决定了使用变幅杆的大小范围（直径2mm至几十毫米），你使
用多大的变幅杆就在设备的上调至该刻度（很简单的）！变幅杆的大小决定了处理量5ml一下选3mm，5～
50ml可选6～8mm，50ml以上选10mm的变幅杆，依此类推！占空比不用关心的，主要是指超声时间和停
顿时间的比值。
酵母破碎的问题
&&& 一般的PROTOCOL都是用glass beads& 破碎酵母细胞sigma G-8772 酵母破碎效果好的我所做过的方&法中还是玻璃珠，效率很高，而且对目的蛋白活性不会有什么影响。一般应该用这个方法。
&&&& 化学裂解的方法，10g酵母 加1ml的乙酸乙酯，充分搅拌至液体状。此法的裂解效果不错的&加尿素裂解液（尿素8mol/L, NaCl 0.5mol/L,Tris 20mmol/L, EDTA 20mmol/L, 2%SDS, PH值&8.0），据说效果可以。 &毕氏酵母细胞破碎法&&&& 在破碎遇到的问题是菌体浓度太低，OD620nm在4-6之间。细胞破碎仪的最低破碎体积为4ml左右，这&样再稀释一倍，OD就到2-3啦，我们怀疑破碎完溶出蛋白和酶活测定时会测不准。所以请教大家细胞破碎时&最低的菌浓多少为下限？我们的菌是一种棒杆菌。 破碎后，你可将液体放入透析袋中浓缩。&&&& 我们所做的方法是按照1：20的比例将离心后的菌体（e.coli）溶解于超声缓冲液（50mM 磷酸 pH &8.0 ）300w 10s/10s 破碎20分钟。做了镜检！基本全被破碎了！我做蛋白纯化的，做的包涵体。实验中&我们的菌体浓度相对独立，与培养液中的菌体od无关，不收其限制，便于操作者调控。&一般按每g湿菌体加5-10ml裂菌缓冲液。&超声肯定会产热，所以一定要有降温装置，除非你需要得成分耐高温。
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正在加载中，请稍后...革兰氏阳性细菌细胞壁(cell wall)的破碎方法及相关原理(革兰氏阳性,细菌细胞壁,原理) - 微生物实验 - 生物秀
标题: 革兰氏阳性细菌细胞壁(cell wall)的破碎方法及相关原理(革兰氏阳性,细菌细胞壁,原理)
摘要: [革兰氏阳性细菌细胞壁(cell wall)的破碎方法及相关原理(革兰氏阳性,细菌细胞壁,原理)] 有那位知道革兰氏阳性细菌细胞壁(cell wall)的破碎方法及相关破碎原理？谢谢 关键词:[革兰氏阳性 细菌细胞壁 原理]……
有那位知道革兰氏阳性细菌细胞壁(cell wall)的破碎方法及相关破碎原理？谢谢
回复用超声波的效果好像很不错，常用的方法是用溶菌酶水解细胞壁(cell wall)的（适当延长消化时间）,溶菌酶可以专一性地作用于肽聚糖分子的N-乙酰胞壁酸(NAM)与乙酰葡萄糖氨(NAG)之间的β-1,4糖苷链使之断裂，使细菌细胞壁(cell wall)变得松驰。。。效果不好的话可以考虑加点表面活性剂。。。回复可以用溶菌酶消化细胞壁(cell wall)的方法破碎细胞壁(cell wall),原理如楼上所述。如果没有溶菌酶可以破碎细胞壁(cell wall)，也可以采用液氮研磨破碎细胞壁(cell wall)的方法.原理当然就是简单了回复我用溶菌酶啦，但是效果不太好，溶菌酶的使用对温度，酸碱度有要求吗？谢谢回复你既然做这个实验就应该有protocol吧, 37度pH7的TEbuffer里边.如果不容易破壁一般是培养时间过长,菌体老化.或者是你的菌细胞壁(cell wall)有特殊成分不容易破壁.回复用溶菌酶消化细胞壁(cell wall)的方法破碎细胞壁(cell wall),可以加上用玻珠研磨破壁.建议少用超声,应为超声同时也可以将DNA断裂成碎片,对以后的试验有一定的影响.回复溶菌酶+K37度过夜,100度煮沸10min,高速冷冻离心可.回复溶菌酶+K37度过夜,100度煮沸10min,高速冷冻离心可.回复100度煮沸10分钟蛋白就变性了，请问你煮沸后是要做电泳吗？回复我现在在做乳酸菌表达外源蛋白，诱导表达完了以后想要用-PAGE检测，如果不破菌 电泳结果基本没有条带呢希望各位大虾赐教！回复如果用超声破碎革兰氏阳性菌，那有哪位可以提供超声时的功率和时间吗?回复我以前做超声破碎革兰氏阳性菌时的条件是，功率800ｗ，超声3s，间隔3s,超声45次。我用的这个条件，破壁效果还可以，建议楼主可以试一试。回复如果实在很难破壁的话可以试试先用溶菌酶处理1-2h，再超声破碎细胞提取蛋白。回复我做的是单增李斯特氏菌,我也很想知道溶菌酶的用量以及方法.它是革兰氏阳性菌。回复用液氮-37℃这样反复冻融两三次怎么样。刚听说这种方法。
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电话：021-用超声波裂解细菌还需要加细菌裂解液吗?我要提的是细菌荚膜多糖.求高手指教.急
MaSoaphhPI
一般情况下用的是高频超声波的话细菌裂解不用加效果也不错 但是如果像快点或者效果好点可以放一点裂解液
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