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胰岛素使用过程问题多 千万要注意
胰岛素应用十问
胰岛素使用过程中要注意这些问题。起始胰岛素日用量如何计算？答：健康人胰岛素需求量一般每天不超过每公斤体重1单位，大多数病友为每日40～50单位胰岛素。1初诊1型病病友每日胰岛素剂量可考虑从0.5～0.8单位/体重（公斤）起始。以体重60公斤为例，每天胰岛素治疗剂量约为30～48单位。2初诊2型糖尿病胰岛素替代治疗可考虑从0.3～0.8单位/体重（公斤）起始。以体重60公斤为例，每天胰岛素治疗剂量约为18～48单位。不同病友应根据具体情况适当调整，老年人、者或血糖轻度增高者，可从低剂量开始；年轻人、者或血糖明显升高者可从较大剂量开始。3口服降糖药血糖控制不达标者联合胰岛素（尤其是基础胰岛素），可考虑从0.1～0.2单位/体重（公斤）开始，以体重60公斤为例，每天胰岛素治疗剂量约为6～12单位。一般可根据病友起始胰岛素治疗时的血糖水平确定。糖化血红蛋白&80=""0=""1=""&8.0%者从0.2单位/体重（公斤）起始；也可根据空腹血糖水平确定，如空腹血糖为10.0mmol/L者，起始基础胰岛素为10单位。胰岛素的日用量如何分配？答：2型糖尿病每日4次胰岛素强化治疗：1如果三餐时用的是短效或速效胰岛素，睡前用的是中效胰岛素，早、中、晚、睡前的分配比例应为3：2：2.5：2.5。即一天中午餐时用量最少，晚餐时与睡前用量稍多且相当，早餐时用量最多。2如果三餐时用的是短效或速效胰岛素，睡前用的是甘精胰岛素或地特胰岛素，三餐总用量和睡前用量分配比例应为6：4。三餐的分配量则在三等分的基础上分别加减2单位，如将早、中、晚总量除3取得平均用量，早餐用量在平均用量基础上加2单位，午餐时则减2单位，晚餐时就按平均用量注射。通过以上两种方式治疗使血糖达标后，再改用预混胰岛素，每天早餐前和晚餐前注射。如为1型糖尿病病友，血糖控制稳定后建议继续维持4次胰岛素强化治疗。每天注射两次胰岛素：早餐前注射总量的2/3，晚餐前注射总量的1/3左右；每天注射一次基础胰岛素：三餐前口服降糖药，睡前按每公斤体重0.1～0.2单位计算注射用量。胰岛素泵治疗，一般情况下基础或餐时胰岛素各占一半左右，肥胖或超重者餐时胰岛素剂量适当增加。胰岛素用量如何按血糖高低进行调节？答：应在原来胰岛素用量的基础上进行调节。①按空腹血糖调节：当血糖不能达标或出现时，胰岛素用量应根据空腹血糖水平调节：空腹血糖在5.0～7.0mmol/L时不增不减；空腹血糖在3.0～5.0mmol/L时，晚餐前或睡前胰岛素应减少2～4单位；空腹血糖&7.0mmol/L，晚餐前或睡前按空腹血糖每增高2.0mmol/L加胰岛素1单位进行计算注射。②按餐后血糖调节：餐后2小时血糖高于10.0mmol/L后，每增高2.0mmol/L加胰岛素1单位，但一次加量不要超过6单位。也可联合口服降糖药物如α-糖苷酶抑制剂或二甲双胍等，并注意餐后适当运动和少吃多餐。如何按尿糖高低调节胰岛素用量？答：肾糖阈正常时，餐前尿糖每增加一个“+”号，胰岛素加2单位。每次加量不应超过6单位。老年人和肾功能损害者肾糖阈升高，孕妇肾糖阈降低不适合进行尿糖监测。目前自我指测血糖已基本替代尿糖监测，可更准确地调整胰岛素剂量。应激状态（或月经期）的胰岛素用量如何调节？答：不论何种原因发烧，体温超过38℃者，应在原胰岛素用量基础上增加20%。妇女每次行经前或妊娠末期3个月，胰岛素用量需在医生的指导下适量增加。
（责任编辑：jbwq）
主任医师 副教授
擅长:胸外科
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擅长:各种心血管
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擅长:胸腔镜
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Ins胰岛素检查结果
状态：就诊前
结果提示：1.空腹胰岛素抵抗（高于16.5即提示抵抗，指降低血糖至正常需大量胰岛素分泌），2.胰岛素分泌高峰后移。建议控制理想体重、合理饮食、适当运动。
状态：就诊前
有点不明白啊医生，那我到底有没有问题啊~能再讲一下么，谢谢~
结果有问题，胰岛素抵抗会使胰岛大量分泌胰岛素才能降低血糖，而高胰岛素血症是、高血压、高血脂、、 肥胖疾病的等共同的发病基础。胰岛素分泌有高峰后移，提示第一时相分泌缺失，长期会造成餐后血糖升高。建议控制理想体重、合理饮食、适当运动。
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疾病名称：胰岛素高&&
希望得到的帮助：药物能快点怀孕
病情描述：胰岛素释放那个结果跟我怀不上关系大不，目前下步应该怎么办？我还有内分泌八项跟六项等例假来了第二天在做。希望先治胰岛素血糖那个问题。
疾病名称：垂体瘤&&
希望得到的帮助：请医生给我一些治疗上的建议
病情描述：混合型生长激素瘤，肢端肥大症，继发性糖尿病，继发性闭经，
投诉类型：
投诉说明：（200个汉字以内）
张彦春大夫的信息
张彦春，男，主治医师，擅长糖尿病。邯郸市中心医院南院 糖尿病科主任 欢迎共同探讨糖尿病。
内分泌科可通话专家
山西省人民医院
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【整理总结】INS-1 cell 的细胞培养
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wanliheng 1，一般对照的高糖和低糖，而低糖一般文献说的是1-3，最多到5mMol吧。我指INS-1细胞，其他的我没看。2. 做了这个实验（低糖孵育是1mM，高糖是20)，但是观察的是其他指标。 真是太感谢了。。。
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我有很多肿瘤细胞，现急需要INS-1细胞，谁有需要可以交换，谢谢大家了！
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楼主您好！我也是做糖尿病相关课题的。我最近遇到的问题是用ELISA测定细胞上清中胰岛素分泌量测不出值？试剂盒中的标准品是可以测出值的，难道是细胞不分泌胰岛素了？还是什么其他原因？细胞有INS-1和RIN-m5f，这两种细胞上清均不能测出。还有个问题是ELISA试剂盒中板子用完后，试剂还会剩下好多，想买一种胰岛素单抗，包被酶标板，然后用试剂盒中剩余的试剂测定胰岛素分泌。您觉得这种方法可行么？
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crystal1243 楼主您好！我也是做糖尿病相关课题的。我最近遇到的问题是用ELISA测定细胞上清中胰岛素分泌量测不出值？试剂盒中的标准品是可以测出值的，难道是细胞不分泌胰岛素了？还是什么其他原因？细胞有INS-1和RIN-m5f，这两种细胞上清均不能测出。还有个问题是ELISA试剂盒中板子用完后，试剂还会剩下好多，想买一种胰岛素单抗，包被酶标板，然后用试剂盒中剩余的试剂测定胰岛素分泌。您觉得这种方法可行么？关于用INS-1细胞进行胰岛素的分泌测定。我没有做过这个实验。首先要保证方法的正确。其次貌似听说ELISA结果不稳定，可以多测几次。包被酶标板，如果有能力也有时间可以尝试，但是如果不能保证包被质量还是买现成的吧。附件是测定INS-1胰岛素的相关文献endnote格式的，都有全文，发现多数用的是RIA，少数用的是ELISA。供你参考。
(21849.02k)
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谢谢楼主回复！以后如果有什么问题还可以请教您。
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进行INS-1 cell的胰岛素分泌检测的同学注意了，如果ELISA试剂盒不出结果，可能还有另外一个原因是使用的试剂盒的种属不对。造成种属不对的原因是对于自己所养的INS-1cell的特点。前面说过：目前INS-1 cell有3种：第1种是最原始的INS-1 cell，是直接从大鼠胰岛素瘤细胞克隆出来的；第2种是INS-1 832/13 cell，这一种细胞内，除了有rat的insulin基因外，还overexpress Human insulin driven by ubiqiitous cytomegalovirus promoter。第3种是INS-1E cell，是第1种INS-1 cell优化后的细胞，更加适合胰岛素分泌胞吐等试验。在进行胰岛素分泌检测之前，一定要清楚自己的细胞是哪一种，尤其是要注意是不是的第2种，因为我觉得第2种细胞的检测是应该以rat种属为主，还是以human种属为主呢，至少有一篇文献（详见附件）是这样描述的：We assessed insulin release using the Coat-a-Count Kit (DPC), which recognizes human insulin and cross-reacts 20% with rat insulin.（Smith, R., et al., Mutant huntingtin interacts with {beta}-tubulin and disrupts vesicular transport and insulin secretion. Hum Mol Genet, ): p. 3942-54.）因此，当INS-1cell检测胰岛素分泌没有结果的时候，除了技术上和试剂质量的原因之外，INS-1的种类雅瑶考虑进去，或许会柳暗花明！！加油，希望大家继续讨论！小淘boy wrote:请问楼主，现在我需要用INS-1细胞转染后进行胰岛素分泌实验··请问效果会不会很差？多谢指导tanhuanbo wrote:楼主，我现在也做INS-1细胞啊，我想做葡萄糖刺激产生胰岛素，但是用不同浓度葡萄糖刺激INS-1细胞，不产生胰岛素啊，检测不到啊！我是先用不含葡萄糖的KRB buffer孵育2个小时，然后再换成2.8mM和16.7mM的葡萄糖的KRB buffer 2个小时后，取上清用ELISA检测胰岛素，但是基本上检测不到啊。 请问楼主做过吗？有遇到过这种问题的吗？求救！crystal1243 wrote:楼主您好！我也是做糖尿病相关课题的。我最近遇到的问题是用ELISA测定细胞上清中胰岛素分泌量测不出值？试剂盒中的标准品是可以测出值的，难道是细胞不分泌胰岛素了？还是什么其他原因？细胞有INS-1和RIN-m5f，这两种细胞上清均不能测出。还有个问题是ELISA试剂盒中板子用完后，试剂还会剩下好多，想买一种胰岛素单抗，包被酶标板，然后用试剂盒中剩余的试剂测定胰岛素分泌。您觉得这种方法可行么？
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我也在用INS-1细胞做胰岛素释放试验，做了差不多5次，基本在上清中测不出胰岛素的水平，不管是用测人的试剂盒还是用大鼠的进口试剂盒，不管是用RIA还是ELISA的方法。另外，请问楼主知道有哪些人的胰岛细胞系么？为什么大部分paper都用的是鼠的呢？
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lemontree 我也在用INS-1细胞做胰岛素释放试验，做了差不多5次，基本在上清中测不出胰岛素的水平，不管是用测人的试剂盒还是用大鼠的进口试剂盒，不管是用RIA还是ELISA的方法。另外，请问楼主知道有哪些人的胰岛细胞系么？为什么大部分paper都用的是鼠的呢？其实我也没有查过到底究竟有多少种类的β细胞系。我进入实验室的时候实验室一直在用这个细胞系，我也就随大流应用了。对于其他的细胞系并没有很深入的了解，也简单查过一些文献，其实是在dxy的帖子里看到的，我总结了一下而已。第一帖有这么一篇综述（Hohmeier HE, Newgard CB (2004) Cell lines derived from pancreatic islets. Mol Cell Endocrinol 228 (1-2):121-128. doi:10.1016/j.mce.），你可以看看，如果能给大家简单总结一下就太好了。
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wanliheng 近期准备培养INS-1细胞，就来dxy查了一下相关资料，感觉收获颇丰，顺便整理一下，供大家参考：时间，全站搜索，关键词是INS-1，整理了前10个页面，感觉基本也就这么多了，从第5-6也开始后面多数是1-4页的回复帖。具体如下：你好，我研究生养的就是ins-1细胞，感觉没有那么不好养。我用的是gibco袋装粉末1640培养基，自己陪得时候加了碳酸氢钠和hepes（拼写是不是这样忘记了。）hyclone胎牛血清，用量为10％，然后就是正常培养了，细胞长势不错的。gibco的培养基-093，gibco的胎牛血清 ，gibco的胰酶1×的状态一直都不好，用了15%的血清也不太长，尤其是传代之后就更不行了，非常着急Gibco的RPMI 1640 培养基是高糖的，25mM左右，2 mM glutamine 不必再加， 1 mM sodium pyruvate也含有了，而且为HEPES－balanced medium，HEPES为10mM. 我想血清就很重要了，国产的血清我们只养养HEK293这样好死不如赖活着的，呵呵，一切顺利！加2巯基乙醇可以使INS-1细胞的功能结构维持稳定不变，有文献报道的。INS-1细胞还是比较好长的，培养条件是RPMIg/L L-Glutamine +0.11g/L 丙酮酸钠+5.6 MMOL/L 葡萄糖+ 50umol/L 2 –mercaptoethanol + 10%FBS ，细胞本身就是成片生长的，细胞对胰酶比较敏感，如果消化不好，细胞状态会受到很大的影响，甚至会不贴壁死亡，我一般用0.05%胰酶-EDTA消化半分钟就好了1000mmol=1mol=质量/分子量，你计算好需要的总体积然后根据浓度换算出需要的质量，即克数！细胞培养阶段是用普通1640，也就是含糖11.1mmol/L的培养基，给不同糖浓度刺激时，换用无糖1640配置需要的糖浓度INS-1细胞的培养条件是：Cell culturing： INS-1 cells were cultured to near confluence in RPMI-1640 medium with 11 mmol/l D-glucose supplemented with 10% fetal calf serum (FCS), 100 U/ml penicillin, 100 ｕg/ml streptomycin, 10 mmol/l HEPES, 2 mmol/l L-glutamine, 1 mmol/l sodium pyruvate, and 50 ｕmol/l b-mercaptoethanol.
可见对葡萄糖浓度的要求是常规RPMI-1640的GLU浓度，值得一提的是该细胞对2-ME（b-mercaptoethanol）巯基乙醇确实依赖的，如果不添加，细胞难以生长。关于该细胞的建立，请参考：Establishment of 2-mercaptoethanol-dependent differentiated insulin-secreting cell lines. Endocrinology. ):167-78., PMID: 1370150请问INS-1细胞冻存用什么体系合适呢？我的细胞是找人要的，没有说明书，也没有找到可信的资料?应该都差不多，血清和DMSO 9:1细胞出现老化迹象，一共传了多少代？你加的培养液营养可能不够，国内销售的培养液及血清不如国外好，有可能导致细胞状态不好。改进方法是用国外进口血清或者是加血清到20%。INS-1还是比较好养的，但刚开始复苏时可能会出现不贴壁，易污染等情况，我们在复苏时离心去除DMSO后，加入5ml含有的较高浓度（12%~15%）胎牛血清的RPMI1640，在温箱中培养18~24小时后如果贴壁率仍较低，就在原培养基的基础上再培养瓶中续加约1-2ml新培养基，视贴壁情况在未来1~2天内换液，另外在此期间一定要严格无菌操作。10%FBS(进口），2mM L-glutamine, 1mM sodium pyruvate, 50uM 2-mercaptoethanol, 100u/ml penicillin, 100 ug/mi streptomycin我正在养INS-1，培养液是GIBCO 的1640纯培养液 5.5mM glu ，加1X 双抗 丙酮酸钠 b-巯基乙醇 GIBCO 胎牛血清。消化液用的是GIBCO 的 EDTA 胰酶，传代时间4天左右。个人觉得是比较好养的，没什么特殊注意事项，就是不要消化过头。INS-1细胞是不难培养的，只是培养基成份多了一些，各位在配培养基的时候要多加小心。一、细胞株说明1. 细胞名称：大鼠胰岛素瘤细胞2. 生长特性：贴壁生长3. 培养条件：RPMIg/L L-Glutamine +0.11g/L 丙酮酸钠+5.6 MMOL/L 葡萄糖+ 50umol/L 2 –mercaptoethanol + 10%FBS4. 传代比例：1:3-1:65. 培养环境：37℃，5%CO2,95%O2卖胰岛素细胞的网站ATCC通过ATCC现能买到的胰岛细胞株有6种，你上面所提的INS-1就有。我就介绍一下该株的一些特性：Asfari建立了INS-1、INS-2胰岛细胞系，其母系是RINm5f（来自于放射线诱导的胰岛素瘤）。RIN细胞与淋巴细胞共培养于含β-疏基乙醇的培养基，Asfari发现一些漂浮的细胞聚集成团，形态与RIN相异，分离及纯化这些细胞即得到INS，这些细胞的活力必须依赖于β-疏基乙醇的存在，其最大的特点是其激素分泌与体内的胰岛细胞相似，具有葡萄糖刺激的胰岛素分泌。一般而言，细胞株胰岛素分泌功能越强，转染效率越差，越容易受损、死亡；相反，若细胞株分化差，分泌胰岛素功能很差，转染效率可能越高，越不容易死亡。另外，若用脂质体转染时，浓度要低，否则可能死很多细胞；虽然效率可能低些，但是存活率高。Hans E. Hohmeier , Christopher B. Newgard et al. Cell lines derived from pancreatic islets.Molecular and Cellular Endocrinology .葡萄糖刺激的胰岛素分泌(glucose-stimulated insulin secretion,GSIS)功能另外，一位经验丰富的老师（diabetes等杂志发表过文章）提出忠告: 具有GSIS功能的胰岛细胞不容易稳定转染(非常困难) ，瞬时转染会容易些。我养过三种胰岛B细胞系分别是RIN5F,INS-1,MIN6,前两者是大鼠胰岛B细胞系,MIN6是小鼠的, 其中最好养的是RIN5F,该细胞系一般用来做信号传导方面的研究. INS-1要复杂一些,据我所知,INS-1的GSIS功能不好,一般不能用来做功能试验,但是在另有一个INS-1E细胞系,具有一定的GSIS功能,高糖时insulin分泌量/低糖约为3-5倍, MIN6是其中GSIS功能最好的,但也是最难养的,用它做实验是一种折磨,我是用原代的胰岛细胞来做GSIS功能试验的.另外,在进行质粒转染时,胰岛素分泌功能越好的细胞转染愈难.用脂质体法是不可能转染上原代胰岛细胞的.我知道华中科技大生物物理和化学研究所一是用元代细胞作转染；另外他们有ins-1胰岛β细胞株进行腺病毒转染，他们实验室的老板是徐涛教授；方法相对成熟。HIT-15是错误写法, 应是HIT-T15, 中间多一个T, 另外该细胞系的GSIS的最高倍数是２倍，这种细胞用于功能研究欠考虑．也不是公认的功能检测β细胞系目前大多用于机制及信号传导研究武汉典藏可以买的（ 这个地方现在没有卖的了，我昨天收到他们的回复邮件，没有了 by wanliheng ）文题：Cell lines derived from pancreatic islets杂志：Molecular and Cellular Endocrinology 228 (–128作者：HE. Hohmeier , CB. Newgard PMID: 原文：见附件胰岛细胞系（翻译） 胰岛在控制能量代谢中起着重要作用。世界范围内糖尿病发病率的快速增加，重新点燃了人们对胰岛细胞生物学的兴趣。然而，由于胰岛分离的困难和高昂的费用，从生物和分子水平获得对胰岛功能深刻认识是很困难的。以前，胰岛来源的细胞系由于分化不全或不稳定的表型特征，只是原代胰岛细胞的次选替代品。但是近年来，采用新的策略分离、鉴定了一些啮齿类胰岛细胞瘤细胞系，保持了很多正常胰岛的关键功能特性，而成为研究胰岛细胞生物学有价值的工具。1． 介绍以下内容分次翻译：1.1．
β细胞来源的细胞系胰岛分散于胰腺，只占总胰腺细胞总量的1%。胰岛中存在4种内分泌细胞。分泌胰岛素的β细胞占60~70%，其余的细胞是分泌胰高血糖素的α细胞（15~20%），分泌生长抑素的δ细胞（5~10%）以及分泌胰多肽的PP细胞（15~20%）。这四种细胞在控制能量代谢中起着总要作用。分泌胰岛素的β细胞尤其重要，是发生1型和2型糖尿病的关键。自身免疫性破坏胰岛细胞导致1型糖尿病，而胰岛素分泌的异常导致2型糖尿病。 世界范围内糖尿病发病率的迅速增加已经引起了对β细胞生物学的重新重视。但是影响该领域进展的一个主要障碍是胰岛分离困难和费用。与此问题相关的还有治疗意义，最近的临床试验应用一种免疫分离方案可以导致糖尿病患者胰岛移植成功率大大增加。然而，这种方法的适用性却受到严重的限制（美国每年获得的胰岛可供1000人移植，但是可能从胰岛移植中受益的1型糖尿病患者在美国有1百万 ）。鉴于上述原因，构建人和动物的β细胞系以供人们进行详细的科学研究和进行细胞供给无限制的临床移植是非常吸引人的。 研究β细胞生理的理想细胞系应该具有成熟分离β细胞的所有特征。除了高胰岛素含量，还应该可控制胰岛素对一系列不同的生理刺激，其中葡萄糖是最重要的促泌物。胰岛释放胰岛素与血糖水平呈直相关，葡萄糖刺激的胰岛素（GSIS）分泌需要葡萄糖代谢。高Km的葡萄糖转运蛋白GLUT-2，葡萄糖磷酸化酶、葡萄糖激酶在监测细胞外葡萄糖浓度中具有重要作用。增加葡萄糖代谢导致ATP：ADP比例的改变，抑制ATP-敏感性K+通道，激活电压门控的Ca2+通道。正确的表达这些刺激-分泌偶联部分对于达到胰岛素释放阈值（4~5mM）和1/2最大刺激值（half-maximal stimulation）（9mM）是必要的(要看原文！！！)。分离胰岛对葡萄糖刺激的反应强度是15倍。除了调节胰岛素分泌，β细胞生长和存活也是糖尿病研究中大家越来越感兴趣的话题。炎性介质在1型糖尿病的β细胞破坏中的作用已经很清楚。最近，越来越多的研究表明，炎症介质在2型糖尿病的发病中也起着重要作用。 尽管从可移植的胰岛素瘤开始（1962年）到目前为止，细胞系的研究已经取得了长足进展，然而已知的细胞系中没有一种能满足真正胰岛细胞模型所有的标准。本文将介绍已经建立的细胞系，并讨论他们作为模型的价值。1.2． RIN细胞系RIN细胞系源于可移植的胰岛细胞瘤。最早的肿瘤是通过大剂量放射线照射近交系NEDH（New England Deaconess Hospital）大鼠（Chick等1977年）。从这种肿瘤中构建细胞系的过程中，建立了两种细胞系。一个是RIN-r，源于NEDH大鼠维持的肿瘤，另一种RIN-m，来源于裸鼠维持的肿瘤（Gazdar等1980年）。这些早期的细胞系分泌可检测到的胰岛素、生长抑素和胰高血糖素。进一步的研究产生了很多亚克隆或源于RIN-m，或源于RIN-r。大部分亚克隆细胞系分泌生长抑素和胰岛素。基于RIN-m的RIN-m5f亚克隆较高的胰岛素分泌率常用于进一步研究，但是即使这种细胞系也同时分泌生长抑素和胰高血糖素。低继代（Low passage）RINm5f呈现适度的GSIS，葡萄糖浓度从0到1.4mM时，胰岛素释放增加50%。RIN-r细胞系的RINr1046-38亚克隆分泌胰岛素而不伴随生长抑素或胰高血糖素。Low passage RIN1046-38功能分析显示，在0.6mM葡萄糖浓度时GSIS达到最大反应，在0.1时为最大反应值的一半。起初RIN1046-38对葡萄糖刺激的反应强于RIN-m5F（9倍对1.5倍），但是前者随着培养时间的延长，其反应丧失。然而RIN1046-38对其他刺激物（如GLP-1、forskolin、可卡林、丙氨酸、格列本脲）的反应并不随培养时间而改变。应用最广泛细胞系是INS-1（Asfari等，1992年）。该系也是源于最初辐射诱导的肿瘤（1977年Chick等）。后来通过在2巯基乙醇（2-ME）培养液中生成肿瘤物质。在细胞培养液中加入2-ME，他们观察到游离的细胞和缓慢生长的细胞团块含有高水平的胰岛素。在此实验的基础上，研究小组通过加入2-ME确定了INS-1细胞系。INS细胞系来源于漂浮的细胞团，尽管2-ME并非细胞生长的必须条件，但缺乏它，则传代时经过胰蛋白酶消化后细胞难以存活。通过免疫荧光染色，大部分细胞胰岛素染色阳性，未测到胰高血糖素、生长抑素或胰腺多肽。胰岛素含量跟传代数并不是很相关，平均约为8-10ug/106细胞(RPM1 1640 containing 11 mM glucose)，超过80代仍保持稳定表达。(文献上是83代，more than 2 year)葡萄糖浓度在0~11.2mM之间时，INS-1细胞系胰岛素分泌稳步增加，而另一种来源相似的INS-2则葡萄糖剂量反应曲线左移，0~2.8mM葡萄糖其胰岛素分泌增加80%，葡萄糖从2.8~20mM，INS-1增加2.2倍，而且IBMX（3-异丁基-1-甲基黄嘌呤）可增强该反应。由于Ins-1细胞表达氧自由基清除酶少，因此对氧化应激损伤高度敏感。此特点使其成为研究氧自由基介导的功能异常和细胞毒性的模型(Hohmeier et al., 2003; Tran et al., 2003; Kutlu et al., 2003)。Ins-1细胞也被广泛用于研究β细胞生长及存活因子。1.3． HIT细胞系1.4． βTC细胞系1.5． MIN细胞系1.6． NIT-1细胞系1.7． βHC细胞系1.8． βTC-tet细胞系1.9． 功能改善1.10． 基因工程1.11． 克隆改善功能的β细胞系1.11.1 βTC来源的克隆1.11.2 INS-1来源的克隆1.11.3 人β细胞来源的细胞系1.11.4 α细胞来源的细胞系INS-1和PANC-1细胞系医科院基础所细胞中心好像都有，可以购买，但估计不能交换，电话是010-。含10% FBS的RPMI1640培养基,同时添加以下成分: 10 mmol/LHepes, 1 mmol/L丙酮酸钠, 50μmol/L 2-巯基乙醇, 100 U/ml青霉素100μg/ml的链霉素。养INS-1进行胰岛素释放试验，一直有问题，特向战友们请教，望大家不吝赐教，我的培养基是RPMI-1640 medium （含11.1mM 葡萄糖） supplemented with 10% fbs， 100 U/ml penicillin, 100 ｕg/ml streptomycin, 10 mmol/l HEPES, 1 mmol/l sodium pyruvate, and 50 ｕmol/l beta-mercaptoethanol。细胞长的很快，1：3传代，1-2天就又快长满了，但有以下问题：1.
贴壁不牢，而且传代后细胞总有一少部分是漂浮的，换液容易把一小部分细胞冲下来。用吸管析出，用pbs洗的时候不要用吸管吸取pbs冲洗，而是加入pbs后轻轻晃一晃，再吸出pbs，这样减少冲刷，应该不会把已经贴壁的细胞洗掉了，而只是把死细胞去掉。2.葡萄糖的刺激不敏感，16.7mM葡萄糖刺激细胞上清胰岛素含量很低，细胞培养基中的胰岛素含量也很低，按说1640中有11.1mM葡萄糖，应该胰岛素含量比较高吧，我新复苏的细胞应该不至于是老化问题。3.我看论坛里有的帖子说INS-1细胞成团生长，不宜吹散成单细胞，但这样不会导致生长不均匀么？有的地方过密，有的地方太稀。另外有的帖子中说PH影响很重要容易造成细胞贴壁不牢，不知我的细胞是不是这个原因，我的完全培养基随时间会越来越变紫色。传代时吹打细胞，我们的做法是轻柔的吹打200下，基本不会有细胞团了，加入培养瓶后再用吸管吹打均匀，细胞生长的还可以。传代的时候把细胞从壁上吹下，再在液面下轻轻吹打6、7次混匀，分到新的培养瓶中，盖盖，培养瓶平放在桌面上前后左右轻晃动几下，细胞悬液就能在瓶底分散均匀了。在排除污染的前提下, 有2种方法可加强细胞贴壁:1. 先coat培养皿(如用gelatin等), 再加入细胞.2. 6-well plate, 细胞种下去后, rpm, 10-15min (离心机需要6-well plate的adapter).3. 以上2种方法结合起来用.养INS-1细胞出现成团的问题？胰酶消化后吹打可以打散，但过1-2天细胞又会聚集到一起生长，但还是贴壁状态，不知如何解决这个问题？成团会不会影响细胞功能？谢谢大家。INS-1细胞是成团生长的，而且传代时，消化细胞不建议吹成单个细胞，这样会影响它的生长。个人感觉传代接种时细胞密度太低容易成团啊。密度高点就好了~细胞状态不好？我把血清的浓度提高到15%，细胞状态好一些后，细胞传代时0.125%的胰酶消化，显微镜下观察，让一些贴壁不好的、成团的细胞漂起后，剩余贴壁细胞传代，接种密度高一点，传2代后，感觉好一些了。冻存的话，没有冻存盒可以先放四度放几分钟，再放-20度放半小时，再放-80度放过夜，最后放进液氮！培养的话，正常培养就可以了，只要操作认真仔细规范，应该没什么问题！一定需要巯基乙醇（50μM 2-mercaptoethanol）的，是 2-mercaptoethanol依赖性的。RPMI164010% FBS10mM HEPES1mM Pyruvate50μM 2-mercaptoethanol100UI/ml Penicillin/Streptomycin 可见Establishment of 2-mercaptoethanol-dependent differentiated insulin-secreting cell lines第一个问题：无论是Gibco还是hyclone的培养，你在官方网站上都可以查到，他们的1640培养基都是含糖11.1mmol/L,不应该另外加糖，公司是错误的。第二个问题：我的胰酶最后的浓度是将原装的胰酶稀释两倍就可以了，其实和和胰酶的浓度没有太大的关系，有经验的人很容易掌握消化的火候，和其它细胞差不多！养INS-1细胞的关键（我的经验）：胰酶一定要用Gibco的胎牛血清啊！（舍不得钱就养不好啊，血的教训，国产的血清害人啊！）胰酶也买Gibco的吧，反正不贵！消化下来的细胞离心转数不要太高，我用900转（不就是要把细胞离心下来嘛，用那么高的转数干嘛！）INS-1细胞养难度很大，培养过程中，随养随冻（以防细胞挂了），印象要加胰岛素，出处和问题好像当时没查到。———————————————————————————————————————以上是摘抄帖子里的内容-------------------------------------------------------------------------------------------------以下仅是个人总结，计划按照这个计划进行下一步的培养，供大家参考，欢迎大家继续讨论：insulin secreting cell line (INS-l), which was derived by culturing rat insulinoma cells in the presence of 2-ME.1、培养基的配方：基本培养基+辅剂基本培养基：RPMI1640（含11.1Mm D-葡萄糖）（要注意1640的货号，比如11875里有葡萄糖，但11879就没有，这个时候就要在辅剂里添加了。）辅剂：（1）10%
FBS（进口胎牛血清，建议gibco）（2）10mM
HEPES（同样看培养基里有没有，有的就不需要加了）（3）1mM
Pyruvate（都要加，但是文献里说不一定有作用，但是作者还是加了In three independentexperiments, INS-1 cells were seeded in sodium pyruvate-free culture medium containing 50 PM 2-ME, and the cellular insulin content was measured at the time of subculture. Although there was no change in insulin content relative to control in one experiment, the two others showed a decrease of 63% and 56%, respectively. Therefore, we decided to maintain the sodium pyruvate in the medium.）（4）50μM
2-mercaptoethanol（必须要加的，否则胰酶消化后会死亡，见附件文献）（5）2Mm
L-Glutamine（谷氨酰胺，各有说法，建议每2周加一次吧,关于谷氨酰胺的问题请看这里：）（6）100UI/ml
Penicillin/Streptomycin（双抗，看情况吧，有信心就别加，吼吼）2、细胞贴壁不牢，培养时候小心一些，上面的整理中也有解决方法供参考。3、随时冻存，因为很有可能挂掉，因为总体感觉不是很好养，希望我养的时候顺利吧。4、其他，比如加不加双抗，传代用不用胰酶（有说贴壁不牢，一吹就掉了）等等 你好，你对于ins-1细胞培养做了那么多，想必对于胰岛的分离纯化也有研究吧，不知能否给我一份胰岛分离培养的protocol，视频更好，谢谢啦
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xiaoyuerlcui
你好，你对于ins-1细胞培养做了那么多，想必对于胰岛的分离纯化也有研究吧，不知能否给我一份胰岛分离培养的protocol，视频更好，谢谢啦不好意思，没有涉及这一方面。参考：【原创】胰岛分离、纯化和活率、功能检测方法讨论 [精华]以胰岛分离为关键词搜索论坛 要多用搜索！
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wanliheng 不好意思，没有涉及这一方面。参考：【原创】胰岛分离、纯化和活率、功能检测方法讨论 [精华]以胰岛分离为关键词搜索论坛 要多用搜索！ 谢谢，很好
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楼主，您好！我最近开始做有关ins-1细胞的实验，是关于药物对高糖刺激下ins-1细胞增殖的影响，想请教一下楼主，用高糖和药物刺激之前，需要把细胞同步化吗？即用无血清的1640预处理，培养6小时？请问楼主觉得有必要吗？谢谢！
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ayore 楼主，您好！我最近开始做有关ins-1细胞的实验，是关于药物对高糖刺激下ins-1细胞增殖的影响，想请教一下楼主，用高糖和药物刺激之前，需要把细胞同步化吗？即用无血清的1640预处理，培养6小时？请问楼主觉得有必要吗？谢谢！ 最好的办法是参考文献。总之一个原则要有理有据。为什么同步化，为什么不同步化，等等，都要有依据。祝好运
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最好的办法是参考文献。总之一个原则要有理有据。为什么同步化，为什么不同步化，等等，都要有依据。祝好运 好的，谢谢楼主！
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wanliheng 1升培养基加的量应该是1毫升。你从哪里看的3.5微升？ ??如果用的β-巯基乙醇是原液的话，那换算出来就是每1000ml的全培里面加入3.5微升的巯基乙醇。原液的浓度是14.3mol/L,sigma的而楼主的巯基乙醇浓度是50mM/L，那么每1000ml的全培里就要加入1ml的巯基乙醇。不知道算的有没有错，请楼主赐教~
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zpy_Perlie edited on
楼主好，想问培养INS-1细胞可以用含25mM HEPES的R1640的培养基吗，有什么影响
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zpy_Perlie 楼主好，想问培养INS-1细胞可以用含25mM HEPES的R1640的培养基吗，有什么影响 不知道啊。要求是10mM的啊。买错了？加错了？为了避免不必要的麻烦，还是重新来过吧。祝好运！
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有现成培养基里面就有10mM的HEPES吗？求货号
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zpy_Perlie 有现成培养基里面就有10mM的HEPES吗？求货号 看这个帖子的附件 这是Gibco各种型号的1640的配方。
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wanliheng edited on
不知道啊。要求是10mM的啊。买错了？加错了？为了避免不必要的麻烦，还是重新来过吧。祝好运！楼主，我发现不加HEPES，我的细胞也长得好好的~那是不是说明可以不加了？
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zpy_Perlie 楼主，我发现不加HEPES，我的细胞也长得好好的~那是不是说明可以不加了？怎么说呢，如果你以后要是有某个实验做不出来，排除各种因素均找不到原因，这时候你会不会怀疑是因为HEPES没有加导致的呢，虽然细胞长的很好。
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wanliheng 怎么说呢，如果你以后要是有某个实验做不出来，排除各种因素均找不到原因，这时候你会不会怀疑是因为HEPES没有加导致的呢，虽然细胞长的很好。哦哦，这样啊，那我现在换液的时候用回有HEPES的培养基可以吗，但今天早上用的就是没有HEPES的培养基·········这样对细胞的影响大吗？我用这个细胞是来做高糖刺激实验释放胰岛素实验的·······
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zpy_Perlie 哦哦，这样啊，那我现在换液的时候用回有HEPES的培养基可以吗，但今天早上用的就是没有HEPES的培养基·········这样对细胞的影响大吗？我用这个细胞是来做高糖刺激实验释放胰岛素实验的······· 应该是没有问题的。其实我很不理解你不加HEPES的理由, 如果用DMEM,你会发现也长的挺好的。但如果这样的话岂不是所有的培养基里的成分都可以随意更改比例配方了，因为你会发现他们都长的挺好的，至少肉眼你是分辨不出来的。 类似的问题还有yoga粉剂DMEM的时候，最后加碳酸氢钠的时候，总是有人问要加多少g，虽然已经回答了看说明书，对方也知道说明书上让加比如3.7g，但是还是问为什么以前加2.4g，甚至说前几次加2、4g也养的挺好的啊。每次这个时候我都很无语，我不理解大家为什么不按照说明书来。
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楼主，你好，我又有问题啦~求解答1、我是隔天换液的，那每次换液的时间点需要一样吗？能不能提早或延迟？2、我的细胞4天传代，按1:2传，到需要传代是培养皿上有些地方很密，汇合超过80%，有的地方很疏，只有30%，那是要正常传代呢，还是等整个皿都长到80%再传代？有什么方法解决分布不均匀的问题？3、就是我的细胞偶尔一两皿，到第四天了，长得还不是很密，只有60%的汇合度，那我是不是应该再让它长个一到两天再传代？4、还有就是我怕损失细胞，本来是隔天换液的，可是隔天观察细胞贴壁还不是很多，刚开始那两天，那我选择不换液，直接加满培养液再培养一天再换液，这个操作对细胞影响大吗？求楼主给个详细回答~~~谢谢
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zpy_Perlie 楼主，你好，我又有问题啦~求解答1、我是隔天换液的，那每次换液的时间点需要一样吗？能不能提早或延迟？2、我的细胞4天传代，按1:2传，到需要传代是培养皿上有些地方很密，汇合超过80%，有的地方很疏，只有30%，那是要正常传代呢，还是等整个皿都长到80%再传代？有什么方法解决分布不均匀的问题？3、就是我的细胞偶尔一两皿，到第四天了，长得还不是很密，只有60%的汇合度，那我是不是应该再让它长个一到两天再传代？4、还有就是我怕损失细胞，本来是隔天换液的，可是隔天观察细胞贴壁还不是很多，刚开始那两天，那我选择不换液，直接加满培养液再培养一天再换液，这个操作对细胞影响大吗？求楼主给个详细回答~~~谢谢个人意见，仅供参考：1.可以挺早或延迟，但是有条件最好一样，就像吃饭；2.这个要综合考虑了，要是大部分都密了，就传，要是大部分都是30%，就不传。对于解决分布不均的问题，比如可以在消化后多吹打几下，种的时候十字交叉混匀等等，都是经验，我现在的细胞也是很不匀，我也不找不到好的办法。3.再长长吧。4.加满培养液什么意思？一般过个夜，该贴的都贴壁了，贴不了的咋也贴不了。所以该换液体就换液。祝好运。供参考。
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谢谢楼主回答~加满培养液就是加多一倍的培养基，这个有问题吗？
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您好，请问您有邮箱吗，有INS-1细胞的实验想要请教一下，万分感谢。
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楼主，您好！请教一下，我正在做高糖刺激胰岛β细胞凋亡的实验，平时用GIBGO的1640培养细胞，里面葡萄糖浓度为11.1mM，在配制低糖培养基（葡萄糖浓度为5.6mM）的时候，请问楼主是怎么配制的呢？谢谢！
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楼主你好！最近我也要开始养INS-1细胞，用的是GIBCO的RPMI 的粉末，那我是不是还要加1mM的丙酮酸钠，10mMHEPES，50uM的巯基乙醇？（配方里有谷氨酰胺2.0mM，还要加吗？）配方：
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shirley54 楼主你好！最近我也要开始养INS-1细胞，用的是GIBCO的RPMI 的粉末，那我是不是还要加1mM的丙酮酸钠，10mMHEPES，50uM的巯基乙醇？（配方里有谷氨酰胺2.0mM，还要加吗？）配方：
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日在丁香通上的INS-1细胞信息
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楼主，能给点INS-1细胞吗？
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楼主，你加葡萄糖刺激INS-1细胞的时候，用的是什么溶剂啊？是KRBH，还是HBSS,还是培养液啊？你用了含糖KRBH刺激INS-1细胞，细胞会变圆吗？如果变圆，正不正常啊？求解答~
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