慢性电刺激对成肌分化的C2C12细胞肌型转换的影响--《第三军医大学》2012年硕士论文
慢性电刺激对成肌分化的C2C12细胞肌型转换的影响
【摘要】：【背景和目的】
阻塞型睡眠呼吸暂停综合征(obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome, OSAHS)是呼吸科的常见病、多发病，其特点为睡眠期间反复发生上气道阻塞并引起呼吸暂停。表现为口鼻腔气流停止而胸腹呼吸动作尚存在。是一种累及多系统并造成多器官损害的睡眠呼吸疾病。有人提出假说，认为OSAHS主要由于上呼吸道横纹肌适应性下降，在非清醒状态下(如睡眠)不能保持呼吸道的开放。目前认为舌根松弛、肥厚或者舌体肥厚导致睡眠期间舌后坠是OSAHS的常见病因之一。颏舌肌是最重要的上气道扩张肌，其正常收缩使舌体前移，阻止咽腔缩小并对抗气流阻力，维持气道通畅。据临床和基础研究证实，颏舌肌功能异常可导致上气道陷闭，并且是引发OSAHS的最主要原因之一，因此，改善颏舌肌功能是有效、合理治疗OSAHS的关键所在。
骨骼肌可塑性强，多种外界刺激可致其肌纤维构成及其功能发生转变已是不争的事实，而模仿通常用来支配慢收缩肌的神经冲动方式发展而来的慢性低频电刺激(Chronic low frequency electrical stimulation, CLFS)就是有效手段之一，我们前期的研究发现在慢性电刺激后，低压缺氧兔颏舌肌的肌球蛋白重链(myosin heavychain,MHC)“由快向慢”转变(MHC由II型向I型转变)，这种转变在低频复合生理频率的电刺激时变化趋势非常显著。我们进一步的研究表明，CESLPF诱导慢性低压缺氧兔颏舌肌肌球蛋白重链由MHC IIb型向MHC IIa和MHC I型转变，内质网(SR) Ca~(2+)的摄取-释放功能显著增强，这种变化在超低频复合生理频率刺激组的变化更加显著。目前变频电刺激引起的骨骼肌的肌纤维类型转变机制尚不明确。钙调神经磷酸酶(CaN)和Ca~(2+)/钙调蛋白依赖的蛋白激酶(CaMK)在骨骼肌肌纤维类型转变通路中起重要作用，但慢性变频电刺激所致MHC肌型转换是否与此有关尚未见详细报道。
因此，本研究以小鼠骨骼肌成肌细胞系C2C12细胞成肌分化为模型，研究CaN在MHC类型重构中的作用，探讨慢性变频电刺激应用于临床治疗OSAHS的可能机制。
【研究方法】
一、建立C2C12细胞成肌分化模型
1.成肌细胞C2C12细胞系在含10%胎牛血清的DMEM增殖培养液(growthmedium, GM)中扩增培养；
2.待C2C12细胞生长至70%～80%融合时，改用含2%马血清的DMEM分化培养液(differentiation medium, DM)诱导C2C12细胞分化。细胞培养于37℃，5%CO2，饱和湿度细胞培养箱中。
二、C2C12肌球蛋白重链MHC各亚型肌纤维比例的鉴定
C2C12肌细胞模型构建成功后，采用请PCR和Western-blot分别检测C2C12细胞MHC亚型的mRNA和蛋白的表达。
三、体外低频复合生理频率模型的建立
我们采用自制变频电刺激仪建立体外低频复合生理频率模型，将经马血清诱导分化的C2C12成肌细胞分为3组，分别为分化对照组、KN93(6μMol)组和CsA(8μMol)组，电刺激的频率采用(10+40Hz)进行刺激，每天刺激1.5h，共刺激2天。
四、低频及低频复合生理频率对C2C12MHC亚型表达的影响
1.采用半定量反转录聚合酶链反应(Reverse ranscription-polymerase chainreaction，RT-PCR)分析各组C2C12MHC各亚型mRNA表达的变化
2.采用Western印迹法分析各组兔颏舌肌MHC各亚型蛋白表达的变化
五、钙调神经磷酸酶活性的检测
对钙调神经磷酸酶活性的检测采用比色法进行。检测方法按照CaN活性比色法定量检测试剂盒说明书进行。
【研究结果】
1.成肌细胞C2C12经过诱导分化后出现肌管，细胞分化好，说明我们建立的成肌分化模型成功。
2.RT-PCR和Western-blot检测结果显示：分化对照组MHCⅠ型和MHCⅡ型均有表达，KN93及CSA组MHCⅠ型明显被抑制。
3. RT-PCR检测结果显示，低频及低频复合生理频率电刺激后,10Hz电刺激时，CsA组和KN93组细胞MHC I的mRNA表达均有显著降低(P0.05)，以CsA组MHCI的表达降低最为明显；当采用复合生理频率刺激时，CsA和KN93对MHC I表达的抑制作用被完全逆转，与正常对照组相比无显著差异(P0.05)
4.Western-blot检测结果显示：抑制剂KN93和CsA处理后，MHC I的表达显著降低，MHC IIb显著增加；CsA组经低频复合生理频率电刺激可以抑制MHC IIb的表达，但对MHC I的提升不明显，该结果与PCR检测结果一致。
5. CsA可以显著抑制CaN的酶活性。在C2C12细胞经复合生理频率刺激后，CaN的活性有所提高，但仍低于对照组(P0.05)。
【全文结论】
1.成肌细胞C2C12可以分化成肌管,是体外研究骨骼肌成肌细胞增殖、分化和功能理想的研究模型；
2.KN93及CsA两种抑制剂可以抑制MHCI型的表达,这种现象对以后研究成肌细胞的分化及转型是有帮助的；
3.低频复合生理频率电刺激可以逆转CsA及KN93对MHCI型的抑制作用。这种变化可能缘于慢性电刺激所致的肌纤维类型转变及其相应MHC亚型合成改变；
4.低频复合生理频率电刺激能够部分逆转CsA抑制CaN活性之后导致的C2C12骨骼肌细胞内肌球蛋白的类型改变，同时CESLPF还能增强C2C12肌细胞内CaN的活性；
5.低频复合生理频率慢性电刺激有望成为一种针对OSAHS的新的治疗手段，但在临床上的具体应用还有待进一步研究。
【关键词】：
【学位授予单位】：第三军医大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2012【分类号】：R56【目录】：
英文缩写词一览表5-6英文摘要6-10中文摘要10-13第一部分 细胞模型的制备13-22 材料与方法13-17 结果17-19 讨论19-20 小结20 参考文献20-22第二部分 CSA 及 KN93 对 C2C12 细胞 MHC 亚型 mRNA 的表达的影响22-36 材料与方法22-27 结果27-30 讨论30-32 参考文献32-36第三部分 C2C12 细胞 MHC 亚型蛋白的表达测定36-48 材料与方法36-40 结果40-42 讨论42-45 参考文献45-48第四部分 CaN 活性测定48-56 材料与方法48-50 结果50-51 讨论51-52 参考文献52-56全文结论56-57致谢57-58文献综述58-68 参考文献63-68攻读硕士期间发表的论文68
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综合康复治疗偏瘫患者临床研究
作者：陆绍勇，唐仕雄，唐位席
【关键词】& 偏瘫患者
　　【摘要】& 目的& 观察综合康复治疗偏瘫患者的疗效。方法& 60例急性脑卒中偏瘫患者随机分为治疗组和对照组各30例，治疗组采用多种康复技术对偏瘫患者进行治疗，对照组仅使用常规的内科治疗。结果& 治疗后，两组患者的运动功能、日常生活活动能力及肌肉功能均有改善，但治疗组患者的疗效优于对照组（P<0.01）。结论& 综合康复治疗脑卒中偏瘫患者可取得较好疗效。
　　【关键词】& 脑卒中；肢体功能障碍；综合康复
　　　Clinical research on comprehensive rehabilitive treatment of hemiplegic patients
　　LU Shao-yong,TANG Shi-xiong,TANG Wei-xi.Rehabilitation Center of Guilin Sanatorium, Railway Ministry, Guilin 541002,Guangxi Province,China.
　　【Abstract】& Objective& To observe the effect on comprehensive rehabilitive treatment of hemiplegic patients.Methods& 60 cases of stroke with hemiplegia were randomly divided into the treatment group and control group with 30 cases in each group.Patients of the treatment group were treated with multi-rehabilitation techniques,and cases of the control group were treated only with drug.Results& After treatment,the extremity motor function and ability of daily living activities and muscle function of patients of two groups were improved,but there was a significant difference between the treatment group and control group (P<0.01).Conclusion& Comprehensive rehabilitive treatment is more effective on stroke patients with hemiplegia.
　　【Key words】&extremity comprehensive rehabilitation
　　脑卒中（CVD）是严重危害人类生命与健康的常见病。随着人口的老化，生活方式的改变和高血压人群不断增多，CVD发病率有逐年上升的趋势，并向年轻化发展。我国社会每年新发完全性脑卒中病例120～150万人，每年死于脑卒中者80～100万人，累积下来的为数更多的存活者中约75%致残［1］。由于我国康复医学在基层医院开展尚未健全，大部分地区康复治疗项目尚未纳入医保范围，家庭经济又难以支付，很多患者未经过规范的康复治疗。严重的残疾后遗症造成社会和家庭的沉重负担。本研究旨在通过早期综合康复治疗，提高康复治疗效益和患者的生活质量，改善运动功能和日常生活活动能力（ADL），促进其早日回归社会。
　　1& 资料与方法
　　1.1& 一般资料& 2003年11月～2005年9月间本院收治CVA患者共60例，随机分为康复组与对照组，康复组30例，男19例，女11例；年龄36～71岁，平均（58.22±9.73）岁；脑梗死13例，脑出血17例。对照组30例，男21例，女9例；年龄32～71岁，平均（57.46±7.73）岁；脑梗死12例，脑出血18例。纳入标准：(1)符合贝政平［2］《内科疾病诊断标准》中脑血管病的诊断标准；(2)并经颅脑CT或MRI确诊的初发者；(3)发病15天内入院；(4)意识清晰；(5)存在肢体功能障碍。排除标准：有严重心肝肾肺等脏器疾病的。两组间的病程、体征、运动功能评价及日常生活活动能力指数经统计学处理差异无显著性（P>0.05），具有可比性。
　　1.2& 研究方法& 对照组单纯给予神经内科的常规药物治疗。康复组在药物治疗的同时给予康复治疗，即在发病后48h、生命体征平稳、神志清楚、神经系统体征不再进展时开始康复治疗。康复治疗包括：(1)功能训练，采用以易化技术为主运动疗法，综合运用Bobath、Brunnstrom、Rood等技术。①良肢位的摆放，卧位时肢体处于抗痉挛体位，仰卧时上肢取肩上抬前挺，上臂外旋稍外展，肘与腕均伸直掌心向上，手指伸直并分开，下肢采取骨盆和髋前挺，腿稍内旋，患腿外侧放置垫物，踝呈直上。②翻身、搭桥、躯干练习，学会健侧、患侧交替卧位。③维持关节活动度，进行患侧关节的被动运动、主动运动。④距小腿（踝）关节背伸牵张练习。⑤由坐到站的转移练习。⑥坐站位的平衡练习。⑦重心转移、患侧负重、步行及上下楼梯训练。⑧ADL的训练：指导患者更衣、进食、个人卫生等，45min/次，6次/周。(2)针刺治疗，头针选取风池、百会、印堂、运动区，如有失语点刺玉液、金津，吞咽障碍配翳风、上廉泉，上肢取尺泽、内关、合谷、手三里、曲池、外关等，下肢取环跳、风市、阳陵泉、足三里、昆仑、三阴交、血海、太溪、太冲等穴。每次取6～8穴，进针得气后接上电针治疗仪，强度以病人耐受为度。25min/次，6次/周。(3)超声波治疗，运用SVT超声扫描心脑血管病多功能治疗仪，将弹性帽戴在患者头部，四个超声头分别置于脑部患侧的颈内动脉颞窗、病灶头皮反射区、椎基底动脉四个部位。超声剂量为0.75～1W/cm２，20min/次，6次/周。(4)在此基础上再加入电刺激功能性康复。将四个电极均匀涂上导电膏后，放置于病人运动障碍的主动收缩肌上并用弹性绷带固定好。输出强度，使患者耐受即可，20min/次，6次/周。
　　1.3& 评估标准& 所有患者治疗前和治疗后30天均由同一医师采用Fugl-Meyer评定法(Fugl-Meyer assessment,FMA)评定运动功能，采用Barthel指数（Barthel index,BI）评定ADL［3］。
　　1.4& 统计学方法& 临床研究的数据资料采用SPSS10.0统计软件进行处理，采用t检验。
　　2& 结果&
　　治疗后，两组患者均有疗效，但康复组的疗效明显优于对照组（P<0.01），见表1、表2。表1& 两组患者治疗前后FMA评分比较& 表2& 两组患者治疗前后BI评分比较
　　　3& 讨论
　　　CVA主要引起肢体偏瘫，导致运动功能障碍，影响患者的生活自理能力。我国对急性早期CVD病人都注重于药物治疗，真正在早期开展康复治疗的不多，错过了康复最好时机。虽然保存了生命，但瘫痪几乎没有好转，严重的残疾，病人只能回归家庭，不能回归社会。治疗的主要目标之一就是最大限度恢复患者功能，早日回归社会。而本研究表明早期综合康复治疗后，患者的运动功能和日常生活活动能力的提高明显高于常规的药物治疗。
　　系统的康复训练，可以扩大大脑皮质作用区，加速中枢神经功能重组。同时系统的肢体功能训练可加速脑侧支循环的建立，促进病灶周围组织或健侧脑细胞的重组［4］。康复治疗中通过输入正常运动模式，影响输出，促进正常运动模式形成。而且康复训练可以通过协调肌肉、关节运动，向中枢提供大量本体运动和感觉输入，发挥易化作用。避免肢体痉挛和非麻痹性肌肉萎缩，使运动尽可能达到协调和随意，提高活动自由度，最终达到肢体功能的最大限度的恢复。针刺头穴、阴、阳经等穴可改善人体大脑皮层电活动及血液循环，增强脑组织供血量，有利于脑缺血半暗带区消除水肿，细胞修复改善脑缺血病灶，有利于脑组织功能的恢复，为促进新的中枢―肢体运动传导通路的形成提供了有效手段［5］。超声波治疗CVA的机制目前认为利用超声波的机械振荡、温热、理化三大效应进行针对性的治疗。超声波有提高局部血液温度，增强毛细血管网的开放，预防和解除小动脉的痉挛，使局部脑组织血管扩张，血流加速，从而改善脑组织的供血状态，提高脑组织的新陈代谢，改善脑细胞功能。超声波的机械作用还对脑细胞功能的恢复起促进作用［6］。同时加上电刺激功能康复，可防止肌肉萎缩，抑制痉挛，促进血液循环的作用。综合康复治疗具有协同作用，有利于充分发挥中枢神经系统的可塑性和功能重组，从而使瘫痪肢体的功能恢复，提高康复疗效，缩短疗程，使后遗症明显减少。
　　因此，早期综合康复治疗CVA患者的预后非常重要，不但能减轻患者的痛苦，而且能提高其参与意识，促进各项功能恢复，降低致残率，提高生存质量，改善ADL，使其早日回归社会。
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　　作者单位： 541002 广西桂林，铁道部桂林疗养院康复中心
　　& (编辑：李& 木)
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论文写作技巧外骨骼机器人信号辨识与控制--《上海交通大学》2013年硕士论文
外骨骼机器人信号辨识与控制
【摘要】：作为人类拓展自我能力的方向，外骨骼机械不仅对人相对柔弱的身体提供了坚实的保护，并且在增强了人的运动能力方面有着无限的发展可能。外骨骼机械在20世纪60年代被首次提出，由于它的技术领域涵盖广泛，要求高，所以直到最近十年，外骨骼机械才有了较引人注目的进步与成就。由于长时间的积累，美国与日本在该领域内处于世界领先的位置，国内的发展则处于初级阶段。但是面对其不论对于军事，还是日常生活上对人体增强的无限可能，我们没有理由不在该方面增加投入，进行更加广泛和深入的研究。
本文在研究探索国内外相关研究成果的基础上，设计和构建了外骨骼机械的样机，为了更好地实现外骨骼对人运动的识别，理解进而能够提升人体的运动能力的目的，表面肌电，作为人体肌肉运动收缩的外在生物电信号反应，被引入控制系统。通过对该信号的分析，可以提取人体的运动意图，包括运动类型和力量的大小，作为控制信号驱动外骨骼的运动。主要研究内容及所做的创新点如下：
1.采用一个电机对应一个关节自由度的方式，模拟人体关节的运动，各个电机均通过独立的驱动器控制。
2.表面肌电信号采用4通道，差分采集方式从上肢控制腕关节和肘关节的四块肌肉处采集，通过Butterworth滤波器获得10-500Hz的有效频谱信号，并滤除50Hz的工频干扰，为了尽可能的减小诸多干扰造成的对识别的影响，选择了最优对特征集。在识别运动类型方面，针对所采集的位置的特点，设计实现了两种识别架构。第一种分类方法基于每个关节均有收缩肌和伸展肌控制，故可以直接通过从两种肌肉中提取出的力的大小分析运动类型，该方法不需要长时间的训练和复杂的分类器设计，但局限于两种肌肉控制明显的关节。第二种基于传统的机器学习分类器，并且为每一个关节设计了独立的分类器，简化了每个分类器，提高了系统的整体鲁棒性。在本文中通过比较，最终选定Boosting作为最优分类器。然而基于本文的架构，可以换用其他的分类器。两种控制方法互为补充，较好的实现了对人的运动意图的把握。
3.本文在分析得到运动类型的同时，没有采用较常用的固定速度运动的传统方式，而是进一步从表面肌电信号中估计得到了力的信息，进而可以根据人的力的大小去控制外骨骼机械对环境的作用力的大小，通过设置比例系数，可以将人的力按比例放大，真正实现了运动增强。
【关键词】：
【学位授予单位】：上海交通大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2013【分类号】：TP242.3【目录】：
摘要3-5ABSTRACT5-9第一章 绪论9-16 1.1 引言9 1.2 课题研究背景及意义9-10 1.3 国内外研究现状10-14
1.3.1 外骨骼助力装置发展现状10-13
1.3.2 表面肌电在外骨骼装置中的应用13-14 1.4 本文主要工作14-16
1.4.1 本文主要研究内容及要解决的主要问题14-15
1.4.2 本文主要工作以及内容安排15-16第二章 外骨骼助力装置16-20 2.1 外骨骼机器人概况16-19 2.2 本章小结19-20第三章 表面肌电信号的产生与获取20-28 3.1 表面肌电信号的产生机理20-23 3.2 表面肌电的采集和滤波23-26 3.3 Butterworth 滤波器实施26 3.4 本章小结26-28第四章 表面肌电在外骨骼控制系统中的应用28-45 4.1 引言28 4.2 单纯力控制28-31 4.3 基于分类器的控制31-43
4.3.1 表面肌电信号的分割32-34
4.3.2 表面肌电信号特征描述34-38
4.3.3 AR 参数的估计38-39
4.3.4 分类器描述39-43 4.4 本章小结43-45第五章 实验研究45-70 5.1 引言45 5.2 分类器验证45-53
5.2.1 通道与特征的选择45-50
5.2.2 分类器的训练与识别验证50-53 5.3 表面肌电在控制中的应用53-69
5.3.1 信号采集53-58
5.3.2 实验数据与结论58-69 5.4 本章小结69-70第六章 总结与展望70-72 6.1 本文总结70 6.2 研究展望70-72参考文献72-76致谢76-77攻读硕士学位期间已发表或录用的论文77-79
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【参考文献】
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