老公的染色体核型分析报告单 诊断结果:46,XY[70]/47,XY,+[30] 我已流产两次了,和老公的染色体不关吗 我没有分可以给,真心的求你们帮帮我
你老公的染色体核型属于嵌合体,查了100个细胞,其中70个是正常核型（46,XY）,另30个是异常核型（47,XY）,多了一条染色体（看不出是哪条染色体多了,是不是你打漏了报告单信息?）.异常细胞占到了身体的30%,后代有一定概率也多一条染色体,在多数情况下,多一条染色体的胎儿是会流产的,即便生下来,也是发育不正常.但你老公是嵌合体,70%的细胞是正常的,所以你们也是有可能怀上正常宝宝的,建议详细咨询医生,考虑一下试管婴儿之类的.
对不起，遗漏了内容，诊断结果：46,XY[70]/47,XY,+mar[30]
备注：本检查为G显带320－400条带范围。医生也没说什么，他只是让我们碰运气，必竟有70%的成功机率，可是我已经34岁了，我怕多次流产再想要孩子就更困难了，请您帮我出出主意吧。从心底里感谢您
如果担心自然怀孕的风险，就尝试一下试管婴儿吧。
我不是医生，只能从遗传学角度给你一些建议。
具体怎么办，还请你咨询医生！
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分子诊断技术及其临床应用
分子诊断学是以分子生物学理论为基础，利用分子生物学的技术和方法来研究人体内源性或外源性生物大分子的结构或表达调控的变化，为疾病的预防、诊断、治疗提供信息和依据。分子诊断是预测诊断的主要方法，既可以进行个体遗传病的诊断，也可以进行产前诊断。分子诊断的材料包括DNA、RNA和蛋白质，其中DNA和蛋白质是分子诊断研究的主要方向。与传统诊断方法相比，分子诊断技术具有以下特点：1）提高了准确性、精确性、灵敏度和特异性。2）与传统方法相比诊断时间早，可以做到早期诊断。3）所需样本量少。4）产前诊断和个体化治疗。1. 分子诊断的主要技术分子诊断技术从监测对象来分主要分为DNA诊断技术、RNA诊断技术和蛋白质诊断技术。11.1 DNA分子诊断技术DNA分子诊断技术从发展的历程上来分主要分为：基于核酸分子杂交的分子诊断技术、基于PCR的分子诊断技术、基于基因测序的分子诊断技术以及其他技术。1.1.1基于核酸分子杂交的技术核酸分子杂交的基本原理是：互补的DNA单链能够在一定条件下结合成双链，即能够进行杂交。这种结合是特异的，即严格按照碱基互补的原则进行，它不仅能在DNA和DNA之间进行，也能在DNA和RNA之间进行。因此，当用一段已知基因的核酸序列作出探针，与变性后的单链基因组DNA接触时，如果两者的碱基完全配对，它们即互补地结合成双链，从而表明被测基因组DNA中含有已知的基因序列。由此可见，进行基因检测有两个必要条件，一是必需的特异的DNA探针；二是必需的基因组DNA。当两者都变性呈单链状态时，就能进行分子杂交。核酸分子杂交的技术主要有以下几种：（一）DNA印迹技术（Southern blot）DNA印迹技术通过限制性内切酶将DNA片段化，再以凝胶电泳将长度不等的DNA片段进行分离，通过虹吸或电压转印至醋酸纤维膜上，再使膜上的DNA变性与核素标记的寡核苷酸探针进行分子杂交，经洗脱后以放射自显影鉴别待测的DNA片段探针间的同源序列。这一方法由于同时具备DNA片段酶切与分子探针杂交，保证了检测的特异性。因此，一经推出后便成为探针杂交领域最为经典的分子检测方法，广为运用于各种基因突变，如缺失、插入、易位等，及与限制性酶切片段长度多态性的鉴定中。（二）ASO反向斑点杂交（Allelic specific oligonucleotide reversed dot blot，ASO-RDB)使用核酸印迹技术进行核酸序列的杂交检测具有极高的特异性，但存在操作极为繁琐，检测时间长的缺点。通过在质粒载体导入单碱基突变的方法，构建等位基因特异性寡核苷酸探针（ASO），可以对核酸序列点突变进行检测。1986年，Saiki首次将PCR的高灵敏度与ASO斑点杂交的高特异性结合起来，实现了利用ASO探针对特定基因多态性进行分型。其后为了完成对同一样本的多个分子标记进行高通量检测，Saiki又发明了ASO-RDB，通过将生物素标记的特异性PCR扩增产物与固定于膜上的探针杂交显色，进行基因分型、基因突变的检测。该法可将多种寡核苷酸探针固定于同一膜条上，只需通过1次杂交反应，即可筛查待检样本DNA的数十乃至数百种等位基因，具有操作简单、快速的特点，一度成为基因突变检测、基因分型与病原体筛选最为常用的技术。（三）荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）FISH是在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术，以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法，探针首先与某种介导分子结合，杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧光染料。FISH的基本原理是将DNA探针用特殊的核苷酸分子标记，然后将探针直接杂交到染色体或DNA纤维切片上，再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维切片上的定性、定位、相对定量分析。FISH具有安全、快速、灵敏度高、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点，不但能显示中期分裂相，还能显示于间期核。（四）多重连接探针扩增技术（Multiplex ligatiort-dependent probe amplification，MLPA）每个MLPA探针包括2个荧光标记的寡核苷酸片段，1个由化学合成，1个由M13噬菌体衍生法制备；每个探针都包括1段引物序列和1段特异性序列。在MLPA反应中，2个寡核苷酸片段都与靶序列进行杂交，再使用连接酶连接2部分探针。连接反应高度特异，只有当2个探针与靶序列完全杂交，连接酶才能将2段探针连接成1条完整的核酸单链；反之，如果靶序列与探针序列不完全互补，即使只有1个碱基的差别，就会导致杂交不完全，使连接反应无法进行。连接反应完成后，用1对荧光标记的通用引物扩增连接好的探针，每个探针扩增产物的长度都是唯一的。最后，通过毛细管电泳分离扩增产物，便可对把核酸序列进行检测。该技术具备探针连接反应的特异性与多重扩增探针杂交的高通量特性。MLPA技术已成为涵盖各种遗传性疾病诊断、药物基因学多遗传位点鉴定、肿瘤相关基因突变谱筛查、DNA甲基化程度定量等综合分子诊断体系，是目前临床最为常用的高通量对已知序列变异、基因拷贝数变异进行检测的方法。（五）DNA芯片DNA芯片技术就是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，即可获得样品的遗传信息。基因芯片可分为两种主要类型：1）合成点样的DNA芯片。即先合成DNA探针，再点样固定在聚合物基片（玻璃、尼龙膜、硝酸纤维膜等）表面上，通常用同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。这种方法的优点是所需检测设备与目前分子生物学所用的放射显影技术相一致，相对比较成熟。2）原位合成的DNA芯片。即在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列，与荧光标记的靶基因杂交进行检测。该方法把微电子光刻技术与DNA化学合成技术相结合，可以使基因芯片的探针密度大大提高，减少试剂的用量，实现标准化和批量化大规模生产，有着十分重要的发展潜力。1.1.2基于PCR的DNA诊断技术聚合酶链式反应（PCR）技术已经成为核酸扩增最常用的方法。该反应体系中包括热稳定性DNA聚合酶、待测基因组DNA模板、与模板DNA链互补的1对寡核苷酸引物，经过20～40次扩增循环后，将模板DNA的特异性区段扩增数十亿倍以上。每一个PCR扩增循环包括1个热变性阶段将双链DNA解链为单链DNA，随后是1个复性阶段将引物与单链目的序列连接在一起，最后是1个延伸阶段，借助于DNA聚合酶以合成1条与模板DNA互补的新链。目前常规PCR方法已经衍生出许多新的PCR检测技术。（一）多重PCR（Multiplex PCR）多重PCR检测方法由于在1个反应体系中包含多组PCR引物，可以同时完成多个靶基因的同时检测，因而可以很好地实现高通量检测这一目标。多重PCR检测技术的关键步骤是引物的设计，所有设计引物的退火温度必须非常相近，扩增产物大小的差别足够大，以能够在琼脂糖凝胶电泳中有效区分开来。此外，多重PCR引物也不能造成各扩增之间有干扰，这种干扰会使得多重PCR的扩增反应体系难以得到优化，特别是在引物对数量较多的反应体系中尤为关键。（二）巢式PCR（Nested PCR）检测灵敏度和特异性是评价一个检测方法的重要参数，为了优化这两个参数应运而生了巢式PCR。巢式PCR检测体系中需要按照顺序加入两对引物，第一对引物扩增出目的片段之后，作为第二对引物扩增的模板。第二对引物位于第一对引物扩增产物上，如果第一对引物是非特异性扩增，第二对引物就不会发生扩增反应，这样就增加了检测的特异性。目前根据该技术设计出的食源性致病菌检测和鉴定方法已经有不少报道。巢式PCR检测技术的一个显著缺点是在反应过程中，反应管需要中途被打开以加入第二对引物，这样就增加了反应体系被污染的可能性。（三）反转录PCR（Reverse-transcription PCR）反转录PCR是用RNA代替DNA作为反应模板的一种核酸扩增方法，与以基因组DNA为模板的PCR方法相比，反转录PCR以从致病菌RNA反转录来的cDNA为扩增模板，只有活性细胞才能够被检出，能防止假阳性结果的出现。反转录PCR检测方法是在反转录酶的作用下，RNA模板首先被反转录成互补的cDNA单链，以用来作为随后普通PCR扩增的模板。目前，反转录PCR方法不仅可以完成对靶基因的检测还可以对靶基因的表达量进行检测。反转录PCR检测方法的缺点是由于RNA极为不稳定，需要检测人员的操作极为熟练，才能保证检测结果的稳定性和重复性。（四）实时荧光定量PCR（Real-time PCR）实时荧光定量PCR技术基本原理是在PCR扩增时在加入引物的同时加入特异性的荧光探针，该探针一般情况下不会发出荧光，只有与模板链发生特异性结合时才会发出荧光，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，在核酸扩增过程中可以随时监测结果。与常规PCR方法相比，实时荧光定量PCR不需要后续的分析过程，缩短了检测的时间，也减少了检测环境对扩增反应所带来污染的可能性。此外，实时荧光PCR是一种定量检测方法。荧光探针是这一检测技术中的重要元件，实时荧光PCR所用的荧光探针主要有4种：TaqMan荧光探针、分子信标探针、FRET杂交探针和SYBRGreen染料探针，其中TaqMan荧光探针使用最为广泛。以下为几种探针的基本原理：A：TaqMan探针TaqMan探针基本原理是在PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时,探针结合在DNA任意一条单链上;PCR扩增时，Taq酶的5'端－3'端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。B：分子信标探针分子信标探针是可形成发夹结构的寡核苷酸探针，5′末端标记荧光素（EDANS)，3′末端标记淬灭剂(DABCYL)，探针噜扑环与目的DNA碱基互补，噜扑环两侧为与目的DNA无关的碱基互补的臂。当探针与靶序列相连，淬灭基团与报告基团逐渐远离，遂发出荧光。C：FRET杂交探针FRET杂交探针基本原理是：一套FRET探针包括2条探针：一条为锚定探针，通常为长探针，结合于模板的保守区域；另一条为感受探针，通常为短探针，包含了特异性序列。两个荧光基团，一个为供体基团，另一个是受体基团，其中一个标记于上有探针的3'端，另一个位于下游探针的5'端。当两条探针都能与模板结合时，则由于荧光能量共振转移的原理使得受体基团发光。D：SYBRGreen探针SYBRGreen探针是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBR Green发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。（五）PCR-ELISAPCR－ELISA是PCR与酶联免疫吸附（ELISA）技术相结合的检测方法。PCR－ELISA首先通过生物素-亲和素的交联作用，将3'端标记有生物素的捕获探针固定在链霉素亲和包被的微孔板上。然后通过生物素、地高辛、荧光素酶等标记的引物给PCR产物加上抗原标记。将扩增产物与捕获探针杂交，靶序列被捕获，再向微孔中加入酶标抗体，抗体与靶序列上的抗原结合，最后加入底物显色，测定相应波长的吸光度值。加入内标，作出标准曲线后，PCR－ELISA技术也可实现定量检测。PCR－ELISA法简便经济，只要具备PCR仪和酶标仪即可实施，特异性和灵敏度均较高，特别适宜大量样品的筛检。（六）数字式PCR（Digital PCR）数字PCR是最新的绝对定量技术，他基于单分子PCR方法来采用计数的方法对DNA进行定量，因此是一种绝对定量的工具。主要采用当前分析化学热门研究领域-微流控的方法，将大量的稀释后的DNA溶液分散至芯片的微反应器中，每个反应器的DNA模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个DNA模板的反应器就会亮，没有DNA模板的反应器就是暗的。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的DNA浓度。1.1.3基于基因测序的分子诊断技术测序反应是直接获得核酸序列信息的唯一技术手段，是分子诊断技术的一项重要分支。虽然分子杂交、分子构象变异或定量PCR技术在近几年已得到了长足的发展，但其对于核酸的鉴定都仅仅停留在间接推断的假设上，因此对基于特定基因序列检测的分子诊断，核酸测序仍是技术上的金标准。21世纪初人类基因组计划完成，6国科学家合作完成了人类基因组图谱，对基因测序分子诊断有着重要的指导意义。严格的说，目前人类基因组图谱主要是结构图谱（碱基构成），目前科学家正在解析各个序列的作用，相信将来人类基因组的功能图谱也会绘制成功。基因测序主要经过了3代技术上的改革：（一）第1代测序Sanger等提出的末端终止法利用不含羟基的双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）进行测序引物延伸反应，ddNTP在DNA合成反应中不能形成磷酸二酯键，DNA合成反应便会终止。如果分别在４个独立的DNA合成反应体系中加入经核素标记的特定ddNTP，则可在合成反应后对产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳及放射自显影，根据电泳条带确定待测分子的核苷酸序列。（二）第2代测序1．焦磷酸测序不同于Sanger测序法所使用的合成后测序理念。焦磷酸测序基本原理是利用引物链延伸时所释放的焦磷酸基团激发荧光，通过峰值高低判断与其相匹配的碱基数量。由于使用了实时荧光监测的概念，焦磷酸测序实现了对特定位点碱基负荷比例的定量，因此在SNP位点检测、等位基因（突变）频率测定、细菌和病毒分型检测方面应用广泛。2．高通量第2代测序通过DNA片段化构建DNA文库、文库与载体交联进行扩增、在载体面上进行边合成边测序反应，使得第1代测序中最高基于96孔板的平行通量扩大至载体上百万级的平行反应，完成对海量数据的高通量检测。该技术可以对基因组、转录组等进行真正的组学检测，在指导疾病分子靶向治疗、绘制药物基因组图谱指导个体化用药、感染性疾病的病原微生物宏基因组鉴定及通过母体中胎儿DNA信息进行产前诊断等方面已经取得了喜人的成绩。（三）第3代测序第3代测序技术的核心理念是以单分子为目标的边合成边测序。该技术进一步降低了成本，可对混杂的基因物质进行单分子检测，故对SNP、CNV的鉴定更具功效。但是目前其进入产品商业化，并最终投入临床应用仍有很长的距离。1.1.4其他技术（一）环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）环介导等温扩增技术是一种新型的核酸扩增技术，2000年由日本荣研化学株式会社开发。LAMP基本原理是针对靶基因上的六个区域设计四条引物，利用链置换型DNA聚合酶在恒温条件下进行扩增反应。与常规PCR相比，LAMP技术具有如下明显的优点：首先，LAMP能够在恒温（60～65℃）条件下进行，30～60min内将只有几个拷贝的靶核酸底物扩增到109水平；其次，多个引物识别靶点的不同区域，大大增强了检测的特异性；再次，该方法的一大特色是可以通过反应副产物-白色焦磷酸镁沉淀的产生与否判断靶基因的存在，肉眼就可以观察到检测的结果。因此，LAMP技术具有不需要昂贵的检测设备，以及特异性强、快速、易操作等特点。此外，由于反应混合物的浊度随着扩增产物DNA量的增加而相应升高，该方法也可以用于定量和实时检测。（二）支链DNA技术(bDNA)支链DNA是一种与PCR不同的核酸探针杂交标记信号放大技术。其基本原理为：合成3个探针和bDNA分子，3个探针分别称为捕获探针、靶探针1和靶探针2。将捕获探针固相化在微孔板上，靶探针1可分别与待测核酸及固相化的探针杂交，而靶探针2可分别与待测核酸及bDNA杂交，在杂交反应完成后，就形成了固相捕获探针一靶探针1一待测序列一靶探针2-bDNA复合物。因bDNA的分支序列又可与3个酶标探针杂交，借助酶的催化反应就能定量检测待测核酸的含量。bDNA技术的最大特点是不经过呈指数增长的扩增过程，放大倍数确定，不利因素少，因此稳定性、重复性高，结果准确。该方法相对PCR更易操作，得到广泛应用。bDNA技术的缺点是放大倍数少、敏感性低、检测范围窄，不适合低水平检测。目前国内仅有数家医院引进bDNA试剂盒和配套的荧光分析检测仪，用于研究和满足特殊患者的需要。由于成本过高，bDNA技术在现阶段尚难以在国内成为常规检测手段。（三）连接酶链式反应（Ligase chain reaction，LCR）LCR是Backman 1997年为检出靶基因序列中的点突变而设计发明，并申报了专利。其基本原理是：合成一对引物A、B，它们完成覆盖了靶序列。经退火与靶序列结合后，A、B间留下一个缺口，加入连接酶封闭缺口，两引物成靶序列完整的互补链。如果靶序列中有点突变，引物不能与靶序列精确结合，缺口附近核苷酸的空间结构发生变化，连接反应不能进行，变性后引物仍是两个。1.2 RNA 分子诊断技术分子诊断技术与DNA分子诊断技术的原理大致相同：主要方法有Northernblot、RT-PCR、RNA芯片等。其需要注意的有以下几点。（一）不论直接以mRNA作为探针还是以mRNA反转录成cDNA再进行后续的检测，检测结果都不会受到非编码区的影响。（二）RNA病毒（如HIV、SARS、禽流感等）其遗传物质是RNA，因此RNA分子诊断对于诊断病毒有很重要的作用。（三）MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20~25个核苷酸。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。最近的研究表明miRNA参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等等，因此可以以miRNA为标记进行分子诊断。2008年Lawrie等发现在弥漫性大B淋巴细胞瘤（DLBCL）病人血清中发现了miR-21，说明其可以作为诊断标记物；同时大量的研究表明miRNA对肺癌、食道癌、乳腺癌等肿瘤具有指示作用。最后，由于miRNA的高度保守性，可以作为真核病毒、细菌和真菌感染的阴性排除；其基本原理就是寻找属间或者种间特异性miRNA为标记物，用来做排除性诊断。（四）长链非编码RNA（lncRNA）是一类长度大于200个核苷酸、不具有蛋白质编码功能的转录本。许多研究已经证实，lncRNA在多种类型的肿瘤中存在异常表达，在肿瘤发生、发展中起着致癌或抑癌作用，是肿瘤发生的一类重要因素。分析lncRNA的方法有表达芯片技术、实时定量逆转录。聚合酶链反应技术、原位杂交技术和RNA深度测序技术等。目前已在组织、血液、尿液和唾液等检材中检测到肿瘤相关lncRNA。因此，lncRNA有望成为新型肿瘤标志物应用于肿瘤诊断和预后判定。（五）基于核酸序列的扩增技术（Nucleicacid sequence-based amplification，NASBA）与常规PCR方法相比，基于核酸序列的扩增技术不需要热循环装备，采用等温扩增的方法扩增目标RNA以达到检测病原微生物的目的。该过程包括3个步骤，首先，一侧引物与靶RNA序列结合并在反转录酶的作用下产生cDNA单链；其次，用RNA酶H消化模板RNA，用另一侧引物与生成的cDNA链结合并在反转录酶的作用下生成双链cDNA；最后，用T7RNA聚合酶经过扩增程序生成RNA转录产物。NASBA方法特别适合致病菌RNA的检测，因为RNA聚合酶可直接用于扩增RNA而不需要先转录为cDNA。NASBA方法现在已经用于多种食源性致病菌的检测，结果表明，NASBA是一种灵敏、特异、快速的致病微生物检测方法。1.3 蛋白质分子诊断技术（一）蛋白质印迹法（Western blot）与Southern Blot或Northern Blot杂交方法类似，但Western blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。（二）免疫组化（IHC）IHC是应用免疫学基本原理-抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术。抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。用于病理诊断的主要有免疫荧光法和免疫酶法。免疫荧光法是现代生物学和医学中广泛应用的方法之一，包括荧光抗体和荧光抗原技术，具有抗原抗体反应的特异性，染色技术的快速性，在细胞或组织上定位的准确性，以及荧光效应的灵敏性等优势。但是，由于免疫荧光法必须具有荧光显微镜，荧光强度随时间的延长而逐渐消退，结果不易长期保存等缺点，在普及应用上受到一定限制，而逐渐被免疫酶法所取代。（三）酶联免疫吸附（ELISA）ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型：A：双抗体夹心法双抗夹心法是检测抗原最常用的方法，其原理是将特异性抗体结合到固相载体上形成固相抗体，然后和待检抗原结合形成免疫复合物，洗涤后再加酶标记抗体，与免疫复合物中抗原结合形成酶标抗体-抗原-固相抗体复合物，加底物显色，判断抗原含量。操作步骤如下：1)将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。2)加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。3)加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。4)加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg，HBeAg，AFP，hCG等。此外双抗原夹心法也可用来检测抗体测抗体，反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。B：间接法间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体(抗人免疫球蛋白抗体)以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：1)将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。2)加待检测标本，保温反应。其中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。3)加酶标抗抗体。可用酶标抗人Ig以检测总抗体，但一般多用酶标抗人IgG检测IgG抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。4)加底物显色。本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。C：竞争法当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素，药物等ELISA测定多用此法。D：捕获包被法IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断中。间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定IgM抗体，因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体，后者将竞争结合固相抗原而使一部份IgM抗体不能结合到固相上。因此如用抗人IgM作为二抗，间接测定IgM抗体，必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理，以除去IgG的干扰。在临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获包被法。先用抗人IgM抗体包被固相，以捕获血清标本中的IgM(其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM)。然后加入抗原，此抗原仅与特异性IgM相结合。继而加酶标记针对抗原的特异性抗体。再与底物作用，呈色即与标本中的IgM成正相关。此法常用于病毒性感染的早期诊断。E：ABS-ELISA法ABS为亲和素(avidin)生物素(biotin)系统(system)的略语。亲和素是一种糖蛋白，分子量60000，每个分子由4个能和生物素结合的亚基组成。生物素为小分子化合物，分子量244。用化学方法制成的衍生物素-羟基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质和糖等多种类型的大小分子形成生物素标记产物，标记方法颇为简便。生物素与亲和素的结合具有很强的特异性，其亲和力较抗原抗体反应大得多，两者一经结合就极为稳定，1个亲和素可与4个生物素分子结合。其方法是以生物素标记的抗体(或抗原)代替原ELISA系统中的酶标抗体(抗原)。（四）蛋白质芯片蛋白质芯片是一种高通量的检测系统，方法类似于基因芯片。它的基本原理是将各种蛋白质有序地固定于载玻片等各种介质载体上成为检测的芯片，然后，用标记了有特定荧光物质的抗体与芯片作用，与芯片上的蛋白质相匹配的抗体将与其对应的蛋白质结合，抗体上的荧光将指示对应的蛋白质及其表达数量。在将未与芯片上的蛋白质互补结合的抗体洗去之后利用荧光扫描仪或激光共聚扫描技术，测定芯片上各点的荧光强度，通过荧光强度分析蛋白质与蛋白之间相互作用的关系，由此达到测定各种基因表达功能的目的。此外除了直接检测的蛋白芯片（荧光和同位素）外，还有间接检测的蛋白芯片，方法类似于ELISA，引入了带酶标的二抗。2. 分子诊断在临床上的应用2.1 在感染性疾病诊断中的应用由于病原物微生物导致的感染性疾病严重威胁人们的健康。以前对这些病原体主要依靠病原学和免疫学方法检测，但是这些方法受敏感度和特异性的限制，使感染性疾病的诊断受到限制。随着各种病原体基因结构的阐明，利用分子诊断技术能早期、快速、敏感、特异地检测感染性病原体的DNA或RNA。分子生物学技术不仅能对微生物感染作出诊断，还可以对感染性病原体进行分型和耐药性监测，因此，在感染性疾病的诊断、流行病学调查、微生物分类分型研究中均可显示其特别强大的功能。众所周知，乙肝病毒、丙肝病毒感染可以引起病毒性肝炎严重威胁人们的健康。运用酶联免疫法(ELISA)检测肝炎病毒作为传染性判断依据有一定局限性，但许多研究结果显示运用分子生物学技术检测肝炎病毒含量(如PCR定量技术、蛋白芯片技术等)，其敏感度远远高于酶联免疫法，更能反映肝炎病毒复制情况，对病毒性肝炎的早期诊断、分型、评价疗效及预后判断更具有临床意义。2.2在遗传性疾病诊断中的应用已发现的人类遗传性疾病达数千种，主要分为两大类：一是符合孟德尔遗传规律的单基因遗传病和不符合孟德尔遗传规律的多基因遗传病。传统的诊断依据是疾病的表现型病变，而表现型病变容易受外界因素影响，在某种程度上影响诊断的准确性和可靠性；而遗传性疾病的分子诊断则通过分析患者的DNA、RNA、染色体、蛋白质和某些代谢产物来揭示与该遗传病发生相关的基因、基因型、基因的突变、基因的单倍体和染色体核型等生物学标记，与传统疾病诊断方法相比具有更准确可靠和早期诊断的优势，有利于临床医学对遗传性疾病进行早期预防、早期诊断和早期治疗。如分子诊断能够检出家系中的致病基因携带者或高危个体，能在胎儿出生前判断其是否为患者，因此，分子诊断是降低单基因遗传病发病率的根本措施。2.3在肿瘤诊断中的应用肿瘤的发生是受到多因素影响的过程，而基因的异常是其中的原因之一。细胞癌基因是一类普遍存在于正常细胞内调控细胞增殖和分化的管家基因，当受到物理、化学或其他一些环境因素作用时可被激活。癌基因激活的机制十分复杂，包括碱基替换、插入、缺失或重排，导致点突变、移码突变、错译突变、终止密码突变及甲基化程度降低等。肿瘤标志在诊断肿瘤、检测肿瘤复发与转移、判断疗效和预后以及人群普查等方面颇有较大的使用价值。肿瘤标志分为基因型标志和基因表型标志。基因型标志是指基因本身突变和表达异常，能反映癌前启动阶段的变化；基因表型标志是指基因表达产物表达和调控异常，表现为其所编码的表达产物合成紊乱，产生胚胎性抗原、异位蛋白等，一般出现较晚。因此，寻找特异性肿瘤基因型标志进行肿瘤基因诊断，对于肿瘤的早期发现和诊断以及肿瘤的预防和治疗具有至关重要的意义。2.4个体化医疗个体化医疗是指针对可能影响患考治疗效果的个体因素(基因)和环境因素，做出适合不同患者的最佳处理和治疗方案。分子诊断学在个体化医疗中发挥着重要角作用。主要包括药物基因组学和药物蛋白质组学2个层面，即根据个体基因和蛋白质的特异性进行个体化、差别化治疗。个体化治疗以患者的基因组成或表达变化的差异来把握治疗效果或毒副作用的个性。对个体基因组成活表达变化差异的检测手段称之为分子诊断，一般是基于个体基因的和特定药物相关的靶点的监测。分子诊断不仅仅在治疗阶段对于病人治疗方案的选择有关键性意义，这种科学方法覆盖到从健康人的早期筛查开始，一直到治疗的预后预测，都有重要价值。（一）诊断与筛查传统医学检查手段，通过影像学方法，可以发现3毫米以上的实体瘤。而通过对相关基因的检测，可以在更早期发现肿瘤的存在，从而可以在更早的阶段进行治疗，因此可以获得更好的治疗效果，甚至治愈，迄今为止早期诊断仍是治愈肿瘤的最佳途径。分子诊断还可以通过遗传基因学的原理以家系为脉络在健康人中筛查出肿瘤易感人群。现在，肺癌、食道癌的早期诊断准确率已经达到80%以上。（二）精确分型分子诊断可以比传统病理学手段更加精确地对肿瘤进行分型和鉴别诊断。可以对肿瘤的类型进行进一步的细分，从而对治疗方向的选择起到指导作用。（三）药物选择抗肿瘤化疗药物大都会对人体正常细胞和免疫力带来较大的伤害，且治疗周期长，而大多肿瘤靶向治疗药物价格昂贵。如果没有能够选择正确的治疗方案，不仅造成对正常细胞和免疫力的无谓的伤害，还会错过最佳治疗时机，也会造成经济上不必要的损失。用分子诊断的手段通过对患者相关基因组成或者表达变化的差异，直接排除对特定病人治疗效率低下，或者副作用大的药物，就具有关键作用。初次进行化疗或者采用靶向药物进行治疗的病人，用分子诊断的手段进行药物选择，对于把握正确的治疗方案，抓住最佳治疗时机，更加具有非同一般的意义。（四）治疗阶段的个体化选择不同的病人即使对同样的药物都有一定的疗效，但是还是会出现治疗效果进展的不同，毒副作用的差异。例如：不同的基因组成或者表达变化的差异，同样的用药量，有的病人会表现出正常的毒副作用，而有的病人则会出现非常严重的毒副作用。治疗阶段的个体化治疗涉及到个体化的用药剂量，用药时间，用药周期等要素，从而达到对特定个体最好的治疗效果。（五）疗效判定和预后预测通过分子诊断的方法，对预后相关基因的检测，可以对残留肿瘤的病变趋势进行预判，从而选择最佳治疗策略，进行有针对性的检测、预防和后续治疗，更进一步，可以对肿瘤引起的其他疾病进行检测。2.5其他方面的应用分子诊断还被运用到耐药性的分子诊断、疗效监控、卫生防疫等方面。如耐药性的分子诊断主要针对感染性病原体和肿瘤而言。疾病耐药性分子诊断包括通过耐药基因表达改变来分析其耐药性，或通过检测病原体的亚型或突变位点从而分析其耐药性。分子诊断还有一个重要的应用方向是对多基因疾病的易感性判断和诊断，如糖尿病、心血管疾病、自身免疫性疾病等一些由遗传因素和环境因素共同作用所致的疾病。