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创伤性癫痫动物模型研究进展
创伤性脑损伤（traumatic brain injury, TBI）非常常见。估计在美国每29s即出现1例TBI患者，每年有150万TBI患者，其中230，000人住院和存活，80，000人出院时有不同程度的TBI相关性残疾，50，000死亡, TBI为40岁以下致死和致残的主要原因, 有530万美国人有TBI相关性残疾〔1〕。因此TBI一直是神经外科领域研究的重要课题。TBI原因有多种，病理类型多变，临床结局多样。其中创伤性（posttraumatic epilepsy, PTE）是TBI的常见后遗症。尽管长期以来在TBI研究领域有关TBI动物模型研究相当多，研究范围涉及发病机制、病理、病理生理及康复等多方面，但较少涉及癫痫问题。同样在癫痫研究领域，缺乏利用TBI动物模型进行有关PTE的研究。仅近年来两个领域的研究者开始跨越各自领域，进行有关TBI致痫性(epileptogenesis)的研究。笔者就此进行综述。
&& 1.PTE的定义 &
在人，PTE指TBI 1周后出现的反复自发性癫痫发作。PTE有时亦称为迟发性癫痫发作（late seizures）, 以区别于TBI 1周内出现的早发性癫痫发作（early seizures），或TBI后24h内出现的即时性癫痫发作（immediate seizures）〔2〕。但在动物模型中尚缺乏此类定义。
&& 2.PTE的形成过程 &
PTE属症状性癫痫，其形成过程分三个阶段：先是TBI引起急性脑损害，后经历一个潜伏期，此期脑在组织学、细胞学及分子水平上逐渐变化，为致痫过程，然后出现反复癫痫发作。致痫期为PTE的孕育期，由于TBI的触发而引起一系列分子、细胞水平上的变化，包括细胞死亡、胶质增生、神经再生、轴突及树突可塑性变化、细胞外基质重组(reorganization)及血管增生等,但目前尚未发现致痫过程的特异性标志性变化,致痫过程长短也不一〔3〕。目前有关癫痫治疗的研究集中在对发作的预防或抑制方面。尚缺少有关如何阻止各种原因引起的致痫过程的研究。在人类，缺少直接对致痫过程进行基础研究的有效途径。
&& 3.TBI动物模型与癫痫概况&
癫痫指由于脑部异常放电引起的电生理临床综合征,其临床发作具有自发性和反复性等特点。所以PTE模型必须是TBI后反复自发性癫痫发作。基于此点，制作PTE模型要求在体，而非脑片或细胞培养。当然离体研究的价值也不能低估，如离体研究可以提供与PTE相关的某些在体情况下不可获得的信息。用于触发过度兴奋性的实验动物模型各有不同的效能和临床实用性。既往动物模型的制作多是在皮层上给金属如铝、钴或铁，形成一个兴奋性逐渐增高的病灶。近年来人们开始采用临床相关性更强的TBI动物模型触发PTE。这些TBI动物模型更好地模拟人TBI的病理特点如皮层挫伤、血脑屏障破坏、皮层下损害及轴突损伤等。
在有关创伤的文献中，TBI动物模型主要有六类：局灶性、弥漫性、局灶与弥漫混合性、TBI联合性损伤、昏迷模型和重复性震荡模型〔4〕。但在TBI动物模型研究中，只在侧方液震脑损伤模型（lateral fluid-percussion model of brain injury, FPI）中进行有关迟发性反复性自发癫痫发作的系统性研究〔5,6〕。
4. 氯化铁癫痫模型
TBI中存在血脑屏障破坏和出血，在神经纤维网(neuropil)中有含铁血黄素及铁沉积。顽固性PTE患者手术切除的皮层标本和皮层致痫灶特征理变化为含铁血黄素沉积。因此认为铁是引起PTE的重要介质。于是人们采用皮层注射氯化亚铁的方法制作PTE动物模型。方法为将5μl的100mmol/L 氯化亚铁或氯化铁水常人溶液注射至成年SD大鼠感觉运动皮层（硬膜下1.2 mm），注射速度为1μl/min。于注射后15～45min出现棘波，24h时多数鼠同侧出现弧立性棘慢波或尖慢波或局灶性棘慢波持续性爆发。2～5d间，96%大鼠出现复杂部分性发作，同时伴有同侧局灶性痫性电活动，这种痫性电活动向对侧传导。每次发作持续数十秒，94%可持续至12周以后，37%可达1年。6周后组织学变化为神经元缺失、出现激活的星形胶质细胞、含铁的吞噬细胞。铁沉积灶由成纤维细胞包绕。第5层内存活的的锥体神经元铁染色阳性。树突棘和分支减少。6个月后双侧海马及小脑半球内出现皱缩的嗜酸性神经元。
&& 抗癫痫药物包括苯巴比妥、苯妥英钠、卡马西平、丙戊酸钠、氯硝安定及乙琥胺等对氯化铁癫痫动物模型有抑制自发性癫痫发作作用〔7〕。
&& 一般认为皮层注射氯化亚铁对皮层的损害类似于颅内出血时从血红蛋白中释放的铁的作用。铁介导氧自由基反应，引起神经元膜脂质氧化，进而导致功能改变和局灶性癫痫发作。故采用氧自由基清除剂来阻止癫痫的产生。多数研究系注射铁之前给药，在急性期对癫痫性活动有抑制作用，但无长期效果〔7〕。
应用铁剂制作的癫痫模型具有自发性反复癫痫发作的特点,但与人PTE相比仍有差别：（1）几乎所有的动物应用铁剂后均出现癫痫发作，而在人，TBI时至多53%的出现癫痫发作；（2）在动物模型中，出现癫痫的潜伏期近2d，这么短的时间内不可能有明显的神经元环路重组，而在人类，潜伏期相对长得多，为数月至数年；（3）在大鼠，发作为局限性，而在人类，相当多的发作为继发性全部性发作(secondarily generalized seizures)；（4）在动物，癫痫发作多自动消退；（5）动物模型时，病理变化主要限于皮层，而人重型TBI后，丘脑及海马等皮层下神经元变性、轴突损伤及存活神经元轴突芽生均与致痫性有关；（6）在人PTE， 除铁可能是致痫物质外，还可能有其它机制。因此应用氯化铁癫痫动物模型难于模拟人PTE。
5.皮层底切癫痫模型
皮层底切（cortical undercut）模型〔8〕用于模拟穿通性皮层损伤所致的PTE。一般采用30d龄以内的大鼠，全身性麻醉，置于立体定向架中 ，底切部位为感觉运动皮层。根据皮层底切部位开颅，保留硬膜及血供完整，用28-30号针头，于末端2 mm处折成90°角，然后连于微操纵器。于前囟后2 mm、矢状缝旁2 mm处穿刺通过软膜，于皮层第6层下转针头180°，上抬，后退，制成通过皮层的旁矢状切口，横断下方的的皮质。为制成皮层岛，另一皮层切口于前囟后0.5 mm进行，不转针头。
1～2周后处死大鼠，所有动物中至少有1个脑切片产生诱发性癫痫样电位，近1/3动物出现自发性癫痫样电活动。目前尚没有结论性报告是否有自发性或诱发性癫痫发作，缺乏长程视频脑电图监测性研究。
组织学研究发现皮层第5层锥体细胞变性，其他锥体细胞轴突增长，存活细胞的轴突芽生，引起轴突总长度增加56%，轴突侧支数目增加64%，轴突肿胀数目加倍，芽生轴突的目标包括皮层5层内其他锥体细胞及抑制性中间神经元。锥体细胞树突的分支无明显变化。免疫组织化学研究显示,谷氨酸脱羧酶表达细胞增多，Parvalbum, calbindin免疫阳性神经元增多，这些为γ-氨基丁酸(GABA)能抑制性神经元。终止于第5层锥体细胞上的抑制性末稍在大小及数量上增加2倍。认为该模型过度兴奋性的解剖基础包括第皮层5、6层神经元传出及传入性轴突的离断、皮层内神经环路的破坏及神经元变性。
有学者应用此模型研究针对PTE的抗癫痫药物的治疗窗和机制。Tetrodoxin为钠通道阻滞剂，应用后可阻止过度兴奋的产生，但于11d后应用则无此作用。
针对此模型，与人类皮层刺伤进行有关神经元环路重组等特征的比较性研究难以进行，原因在于缺乏人类相关资料。在人TBI，可以有海马伞-穹窿及白质通路的撕伤，但白质切割伤少见。有关伴随吞噬细胞及小胶质细胞激活的炎性过程及如华氏变性等的长期神经元变性过程对长期结果的影响有待进一步研究。在此模型中，脑切片过度兴奋的快速发生是否与大多数动物自发性癫痫发作相关有待研究。
6. FPI后创伤后癫痫
在癫痫实验研究中，多采用诱发癫痫持续状态（status epilepticus, SE）的方法触发致痫过程。FPI是研究人类闭合性脑损伤的最常用动物模型。研究发现FPI后脑部病理改变与SE所触发的组织学变化相似〔9〕。但只是最近始有报告FPI后出现PTE。
6．1成年大鼠&
FPI对成年大鼠具有致痫性，引起自发性癫痫发作〔1，5〕。FPI动物模型的制作方法为：开颅中心位于前囱后4.4 mm, 前囱外侧3.6 mm, 冲击压力为2.9～3.3 个大气压，引起重型脑损伤。采用视频脑电图（video-EEG）进行监测长达11个月。研究结束时发现50%的大鼠出现癫痫发作，从损伤至出现癫痫发作的潜伏期为6周至11个月。根据初步研究结果估计FPI后将要出现癫痫发作的动物中50%于损伤后7～8个月出现自发性癫痫发作。按Racine量表评分〔10〕中位行为发作评分为4， 78%为继发性全部性发作。颅内记录示于损伤侧腹侧海马最先记录到电性发作，然后快速传到对侧皮层。中位发作频率为0.15次/d（ 0.04～0.4次/d），近每2周1次癫痫发作。中位发作持续时间为85s（29s～196s），50%的癫痫发作出现在上午七点至下午十九点间。
FPI后11个月处死动物对硫堇染色的脑冠状切片进行组织学分析，发现双侧海马均有相当的神经缺失，以同侧更重，门区（hilar area）、CA3及CA1有神经元损伤。免疫组织化学研究显示,门区抑制性神经元有变性，另外近60%支配抑制性神经元的兴奋性苔藓神经元丢失，这可能与FPI后齿状回兴奋性增高有关。但Reeves等〔11〕发现，FPI后2d及15d后粒层和内分子层GABA免疫活性增高，这与齿状回抑制性增高有关。
免疫组织化学研究显示中度FPI数周至1年内，大鼠脑损伤部位激活的星形细胶质细胞增多〔12〕。Grady 等〔13〕研究发现，FPI后14d，大鼠海马不同亚区及齿状回门区小胶质细胞仍继续增多。所以，如同其他致痫性脑损害一样，FPI可以引起大鼠皮层、齿状回及室周〔15〕。
FPI后出现PTE的大鼠有明显双侧苔藓纤维芽生，以损伤侧重〔5〕，苔藓纤维芽生机制可能涉及TrkB-ERK 1/2 –CREB/Elk-1信号通路，此通路于FPI后24h内激活〔15,16〕 。Golarai 等〔17〕在重物落体脑损伤模型于脑损伤后2～15周分析发现双侧苔藓纤维芽生。除轴突变化外， 近来研究显示在生后19～20d的大鼠FPI后第1个月内树突也有再塑型（remodeling）〔18〕。
脑损伤后可能与致痫性有关的其他病理变化还有突轴损伤、血管变化。在小鼠、大鼠及人， 脑损伤后数周至数月，在主要传导通路上有持续性轴突损伤〔19〕。脑损伤后所余下血管内皮细胞功能紊乱，挫伤区、挫伤周围区及包括对侧等远离挫伤灶的部位均有微血管结构损害，可长达1周。于伤后1～3 d继发性微血栓形成达高峰。
目前没有资料殊别研究抗癫痫药物或其他治疗对FPI致痫性效应的研究。有急性研究表明脱吡酯（Topiramate）, Remacemide, Talampanel等可减少侧方液震（lateral fluid percussion）引起的脑损伤，但是否可防止或减轻致痫性有待进一步研究。
6.2幼鼠（Juvenile Rat）〔6,20〕
对出生后30～32 d雄性SD幼大鼠进行研究，给侧方液震创伤，但位置更靠前，骨窗为3 mm, 中心在前囟后2 mm, 中线外3 mm处。83%的大鼠于1个月内出现自发性全部性7～9Hz 棘漫波，额顶部开始。4个月内92%的大鼠出现部分性癫痫样发作，发作持续时间不到10 s。随访期延至7个月时，发自海马的癫痫样发作频率增多，提示发作起源从额顶皮层移至海马。
尼氏染色和胶质纤维酸性蛋白染色研究显示，早期病理变化限于同侧皮层损伤周围，海马未受累，但在慢性期，出现皮层和海马萎缩，可能系长期癫痫发作及抗癫痫药物所致。
与成年大鼠相比，FPI后，幼鼠过度兴奋出现率高，癫痫样发作时间短，从损伤至出现自发性发作的潜伏期短。这可能与包括年龄、损伤设备、损伤程度、麻醉及部位等多种因素有关。
PTE是TBI的常见并发症及后遗症，对其发生机制尚不清楚，需借助动物模型在细胞和分子水平上进行研究。创伤性癫痫动物模型有多种，如氯化铁癫痫模型及皮层底切癫痫模型等，但这些创伤性癫痫模型只是从某些方面模拟人类创伤性癫痫，对研究致痫过程均有很大的局限性。近年来观察到FPI可引起动物慢性癫痫，与人类PTE具有更好类比性，可借以在细胞、分子水平上研究人类TBI后PTE发生、发展过程。
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