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楮头红多糖的分离纯化与生物活性检验*
作者：何海斌，朱庆银，陈强，林茹，李清禄&&&&作者单位：1 350002 福建福州,福建农林大学生命科学学院化学生物系（△通讯作者） 2 350002 福建福州，福建农林大学动物科技研究所
从药用植物楮头红中分离纯化多糖成分并验证其生物活性。方法
用热水提取，乙醇沉淀提取粗多糖，再经Sevag法去除蛋白，透析去除小分子物质，冷冻干燥得楮头红多糖粗品；采用DEAE-52纤维素柱层析和Sephadex G-200凝胶柱层析进行分离纯化；用TBA法考察多糖的抗脂质过氧化作用；采用CCl4急性肝损伤模型，测定其血清中AST变化。结论
获得一个楮头红多糖组分。TBA法表明该组分对小鼠自发性脂质过氧化具有显著的抑制作用；在保肝试验中，给药组能明显抑制AST的升高，对肝损伤有一定的保护作用。
【关键词】& 楮头红多糖；分离；纯化；生物活性
*基金项目：福建省自然科学基金（编号：B0510012）
&&& Isolation,purification of S. nepalensis Wall polysaccharide and its bioactive validation
&&& HE Hai-bin,ZHU Qing-yin,CHEN Qiang,et al.Department of Chemistry and Biology,Fujian Agriculture and Forestry,Fuzhou 350002,China
&&& 【Abstract】& Objective& To isolate,purify the polysaccharides from Sarcopyramis nepalensis Wall and validate its bioactivity.Methods& The crude product of S. nepalensis Wall polysaccharide was prepared with hot water extraction,ethanol precipitation,dialyzation,and lyophilization.The crude polysaccharide was separated by DEAE-cellulose chromatography and purified by Sephadex G-200 chromatography.The inhibit effect of the polysaccharide on lipid peroxidation of mice liver was conducted by TBA method.The model of liver-injury induced by carbon tetrachloride（CCl4)was used to validate the variety of the realated AST.Results& Onefold ingredient polysaccharide was obtained after isolated and purified.Conclusion& The ingredient can remarkably inhibit lipid peroxidation of rat liver and significantly reduce activity of AST.
&&& 【Key words】& S.nepalensis Wbioactivity
&&& 楮头红（S.nepalensis Wall），别名风柜斗草。《中药大辞典》记载：其性凉、味酸、无毒；功用：清肺热，去肝炎；《实用中草药》记载：其性平、味甘。功用：清热解毒、凉血利水。主治急性肝炎，肺热咳嗽。据有关临床使用报道：楮头红对急性肝炎（甲肝、乙肝急性期）疗效最佳，对慢性肝炎及乙肝病毒携带者有效［1，2］。楮头红已在福建省民间广为使用，是一种极有价值的天然中草药资源。前期研究表明，楮头红中含有游离苷类物质、黄酮类物质、酚类、鞣质类等物质，含量较高的多糖和较丰富的人体所必需的营养元素［3］。为了进一步研究楮头红的生理药理作用，在前期研究基础上，我们对楮头红多糖进行了分离纯化，对获得组分的生物活性进行了初步验证。
&&&& 1& 材料与方法
&&& 1.1& 仪器& 电子天平（梅特勒-托利），恒温水浴锅（上海贝凯），低速大容量离心机（上海安亭），1600分光光度计（北京瑞利），RE-52A旋转蒸发仪（上海亚荣），MC99-3自动液相色谱分离层析仪（上海沪西分析仪器厂有限公司），Agilent1100高效液相色谱仪（美国安捷伦）。
&&& 1.2& 材料与试剂& 楮头红（购自三明和漳州的天然药用植物，经福建中医研究院鉴定）；DEAE-52填料（whatman）、sephadexG-200填料（Pharmacia）、透析袋（3500）、联苯双酯滴丸（北京协和药厂）；石油醚（沸程60～90℃）、95%乙醇、无水乙醇、乙醚、丙酮、98%浓硫酸、氯仿、氯化钠、氢氧化钠、正丁醇等，均为分析纯。
&&& 1.3& 楮头红粗多糖的提取
&&& 1.3.1& 楮头红多糖的提取［4，5］& 楮头红全草用蒸馏水洗涤去土，40℃低温干燥、粉碎。称取草药250g,用石油醚80℃回流脱脂2次，之后用95%乙醇除小分子单糖，滤渣挥去酒精，晾干后于90℃回流提取3次，每次2h，合并滤液，离心去除不溶物。滤液加0.1%的活性炭60℃保温30min，不断搅拌脱色，过滤，取上清液放入-40℃冰箱过夜，第二天取出自然融化后离心（5000r/min）去除不溶物。上清液浓缩适当的体积后缓缓加入5倍量的95%乙醇沉淀，过滤，沉淀依次用95%的乙醇、无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，重复3次。
&&& 1.3.2& 除蛋白［9］& 用Sevag法脱蛋白，氯仿正丁醇4：1，多糖溶液和混合液的体积比为3：1，混合搅拌20～30min，充分静止分层除去白色沉淀，数次后直至界面无白色沉淀。
&&& 1.3.3& 透析干燥& 多糖复溶后透析，透析在磁力搅拌下进行，样品液与透析液（蒸馏水）体积比为1：20，4h换一次水。将透析液进行冷冻干燥后即得粗多糖。
&&& 1.4& 楮头红粗多糖的纯化分离［6～13］
&&& 1.4.1& DEAE-52柱层析& DEAE-52填料依次用0.5mol/L NaOH、0.5mol/L HCl、0.5mol/L NaOH处理（每次30min），再以蒸馏水洗至中性后装柱（柱尺寸为40cm&2.5cm）。装柱后用蒸馏水平衡48h。将粗多糖溶于少量重蒸水（5～8mg/ml），过柱，上样量为交换容量的10%～20%。用水、0.1mol/L NaCl、0.5mol/L NaCl梯度洗脱，用自动部分收集器每15min收集一管，每管5ml，硫酸苯酚法跟踪检测各主峰组分，将各主峰位分别收集合并，蒸馏水透析2天，冷冻干燥得楮头红多糖。
&&& 1.4.2& Sephadex G-200 柱层析& 将Sephadex G-200填料加适量蒸馏水浸泡12h，100℃煮沸4h，脱气后装柱，用0.05mol/L NaCl平衡48h。将1.4.1中收集的各主峰组分进一步纯化，用0.05mol/L NaCI洗脱，自动部分收集器每30min收集一管，每管5ml，硫酸苯酚法跟踪检测。收集各主峰组分，冷冻干燥。
&&& 1.4.3& HPLC 纯度验证& 将多糖溶解成合适浓度，过0.45&m的滤膜后进样，进样体积20&l，流速1.0ml/min，示差检测器检测（检测器温度35℃），柱温箱温度35℃。
&&& 1.5& 多糖的生物活性验证
&&& 1.5.1& 小鼠肝自发性脂质过氧化实验［14］& 小白鼠禁食18h，引颈法处死，迅速取出肝脏，用4℃下预冷的0.01mol/L PBS（pH为7.4）洗去表面残血，滤纸吸干。用玻璃匀浆器将肝脏制成10%的肝匀浆。取该匀浆1ml，加不同浓度的多糖溶液600ul，对照管不加样品，用PBS作空白，于37℃温育2h，加入20%三氯乙酸1ml终止反应，3500r/min离心10min，取上清液2ml加入0.67%硫代巴比妥酸（TBA）1ml，90℃水浴15min，取出后流水冷却。于532nm处测A值，以不加肝匀浆和样液为比色空白样（A0），以加肝匀浆不加样品为对照样（Ai），按下式计算脂质过氧化物（LPO）的清除率：LPO的清除率（%）=（A0-Ai）/A0&100
&&& 1.5.2& 多糖保肝活性试验［15］& 取50只健康小鼠（昆明种，体重18～22g，由福建医科大学实验动物中心提供），雌雄各半，随机分为5组，每组10只。1-2组为给药高低剂量组（给药按临床成人50g/50kg量折算为小鼠给药量，600mg/kg，800mg/kg体重），3组为联苯双酯阳性对照组（200mg/kg，每丸1.5mg），4组为CCl4模型组，5组为空白组。正式实验前，所有动物禁食不禁水12h。从第二天开始，每天1次，连续灌药15天，空白组和模型组灌0.6ml的生理盐水，给药组灌同等体积的多糖，在最后一次灌药后1h，除空白组外，其余四组皮下注射0.5%的四氯化碳-花生油溶液（0.1ml/10g），禁食12h后立即摘除眼球采血。3500r/min离心，取上清液。测定血清AST活力。
&&&&&2& 结果与分析
&&& 2.1& 粗多糖DE-52柱层析结果& 由图1可以看出，经DEAE-52柱层析，可以得到两个相对明显的组分，组分Ⅰ为水洗脱组分，组分Ⅱ为NaCl梯度洗脱的组分，且达到了较好分离效果。
&&& 图1& 多糖梯度洗脱曲线（DEAE-52柱）2.2& Sephadex G-200柱纯化结果& 由图2可以看出，组分Ⅱ经两次过柱后，得到进一步纯化，可以看出其为单一组分，但其纯度还需进一步验证。
&&& 图2& 组分Ⅱ在Sephadex G-200柱上的洗脱曲线
&&& 2.3& 组分Ⅱ过柱纯化后纯度验证& 从图3可以看出，经DEAE-52纤维素柱和sephadex G-200凝胶柱纯化后的多糖组分Ⅱ，在HPLC图谱上只有一个峰，与前面凝胶色谱结果吻合，说明此组分相对均一。
&&& 图3& 组分Ⅱ的HPLC图谱2.4& 楮头红多糖生物活性实验& 小鼠肝自发性脂质过氧化实验结果表明（见图4），随着多糖浓度的增加其抗脂质过氧化能力逐渐增强，且在一定浓度范围内呈现剂量效应关系，当多糖浓度达到1.4mg/ml时抑制率达到50%，显示了较强的抗氧化能力，这对于细胞免受过氧化损伤，维持细胞正常生理功能具有积极意义。
&&& 图4& 楮头红多糖的抗脂质过氧化作用楮头红多糖保肝实验结果表明（见表1），楮头红多糖能够显著降低CCl4诱导的肝损伤小鼠中升高的AST活性，其作用可能与抑制膜脂质的过氧化，维持肝细胞膜的完整性，从而产生保肝作用有关。表1& 楮头红粗多糖对CCl4肝损伤小鼠AST影响注：△与正常对照组比较；*与四氯化碳组比较。
&&& 3& 讨论
&&& 采用水提醇沉法从药用植物楮头红中提取到水溶性粗多糖，经脱色、除蛋白、透析后，再经柱层析纯化后，得到一个高纯度的多糖组分。该组分对小鼠肝自发性脂质过氧化和肝损伤具有一定的保护作用。其他方面的生物活性，如增强免疫活性、抗病毒等作用，尚需要进一步研究确认。本研究为今后的楮头红多糖结构和生物活性研究奠定了基础，为开发楮头红多糖类药物提供了理论依据。
【参考文献】
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第一章 申报单位及项目概况
　　1、透析液搅拌机项目申报单位概况
　　包括项目申报单位的主营业务、经营年限、资产负债、股东构成、主要投资项目、
现有生产能力等内容。
　　2、透析液搅拌机项目概况。
　　包括拟建项目的建设背景、建设地点、主要建设内容和规模、产品和工程技术方案、
主要设备选型和配套工程、投资规模和资金筹措方案等内容。
第二章 发展规划、产业政策和行业准入分析
1、发展规划分析
　　拟建透析液搅拌机项目是否符合有关的国民经济和社会发展总体规划、专项规划、区域规划等要
求，项目目标与规划内容是否衔接和协调。
2、产业政策分析
拟建透析液搅拌机项目是否符合有关产业政策的要求。
3、行业准入分析
项目建设单位和拟建项目是否符合相关行业准入标准的规定。
第三章 资源开发及综合利用分析
1、资源开发方案
　　资源开发类项目，包括对金属矿、煤矿、石油天然气矿、建材矿以及水（力）、森林等资源的开发，应分析拟开发资源的可开发量、自然品质、赋存条件、开发价值等，评价是否符合资源综合利用的要求。
2、资源利用方案
　　包括项目需要占用的重要资源品种、数量及来源情况；多金属、多用途化学元素共生矿、伴生矿以及油气混合矿等的资源综合利用方案；通过对单位生产能力主要资源消耗量指标的对比分析，评价资源利用效率的先进程度；分析评价项目建设是否会对地表（下）水等其它资源造成不利影响。
3、资源节约措施
　　阐述项目方案中作为原材料的各类金属矿、非金属矿及水资源节约的主要措施方案。对拟建项目的资源消耗指标进行分析，阐述在提高资源利用效率、降低资源消耗等方面的主要措施，论证是否符合资源节约和有效利用的相关要求。
第四章 节能方案分析
1、用能标准和节能规范
　　阐述拟建透析液搅拌机项目所遵循的国家和地方的合理用能标准及节能设计规范。
2、能耗状况和能耗指标分析
　　阐述透析液搅拌机项目所在地的能源供应状况，分析拟建项目的能源消耗种类和数量。根据项目特点选择计算各类能耗指标，与国际国内先进水平进行对比分析，阐述是否符合能耗准入标准的要求。
3、节能措施和节能效果分析
　　阐述拟建透析液搅拌机项目为了优化用能结构、满足相关技术政策和设计标准而采用的主要节能降耗措施，对节能效果进行分析论证。
第五章 建设用地、征地拆迁及移民安置分析
　　1、透析液搅拌机项目选址及用地方案
　　包括项目建设地点、占地面积、土地利用状况、占用耕地情况等内容。分析项目选址是否会造成相关不利影响，如是否压覆矿床和文物，是否有利于防洪和排涝，是否影响通航及军事设施等。
　　2、土地利用合理性分析
　　分析拟建项目是否符合土地利用规划要求，占地规模是否合理，是否符合集约和有效使用土地的要求，耕地占用补充方案是否可行等。
　　3、征地拆迁和移民安置规划方案
　　对拟建项目的征地拆迁影响进行调查分析，依法提出拆迁补偿的原则、范围和方式，制定移民安置规划方案，并对是否符合保障移民合法权益、满足移民生存及发展需要等要求进行分析论证。
第六章 环境和生态影响分析
l、环境和生态现状
　　包括项目场址的自然环境条件、现有污染物情况、生态环境条件和环境容量状况等。
2、生态环境影响分析
　　包括排放污染物类型、排放量情况分析，水土流失预测，对生态环境的影响因素和影响程度，对流域和区域环境及生态系统的综合影响。
3、生态环境保护措施
　　按照有关环境保护、水土保持的政策法规要求，对可能造成的生态环境损害提出治理措施，对治理方案的可行性、治理效果进行分析论证。
4、地质灾害影响分析
　　在地质灾害易发区建设的项目和易诱发地质灾害的项目，要阐述项目建设所在地的地质灾害情况，分析拟建项目诱发地质灾害的风险，提出防御的对策和措施。
5、特殊环境影响
　　分析拟建项目对历史文化遗产、自然遗产、风景名胜和自然景观等可能造成的不利影响，并提出保护措施。
第七章 经济影响分析
1、经济费用效益或费用效果分析
　　从社会资源优化配置的角度，通过经济费用效益或费用效果分析，评价拟建项目的经济合理性。
2、行业影响分析
　　阐述行业现状的基本情况以及企业在行业中所处地位，分析拟建项目对所在行业及关联产业发展的影响，并对是否可能导致垄断等进行论证。
3、区域经济影响分析
　　对于区域经济可能产生重大影响的项目，应从区域经济发展、产业空间布局、当地财政收支、社会收入分配、市场竞争结构等角度进行分析论证。
4、宏观经济影响分析
　　投资规模巨大、对国民经济有重大影响的项目，应进行宏观经济影响分析。涉及国家经济安全的项目，应分析拟建项目对经济安全的影响，提出维护经济安全的措施。
第八章 社会影响分析
1、社会影响效果分析
　　阐述拟建项目的建设及运营活动对项目所在地可能产生的社会影响和社会效益。
2、社会适应性分析
　　分析拟建项目能否为当地的社会环境、人文条件所接纳，评价该项目与当地社会环境的相互适应性。
3、社会风险及对策分析
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