鬼头有小白点点是不是菌落？

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2016-02-01 05:51 标签： 鬼头有小白点
蓝白筛选 - 实验交流 - 生物秀
标题: 菌落PCR
摘要: 菌落PCR
蓝白筛选目前在做cDNA连接至TOPO载体中去。cDNA是从RT-PCR逆转录得到的，电泳结果均为单一带，但是有2个基因带很淡。载体连接后转导至E COLI中,LB AMPICILLIN X-GAL平板蓝白筛选,蓝白均有,蓝斑个大饱满,白斑大多在蓝斑周围,个头明显小,但小白斑数量众多。请问,蓝斑白斑的大小能说明什么问题,另外，为什么很多白斑中央会有蓝色小点呢？到底算是白斑还是蓝斑？这样的白斑个头就比较大了 关键词:[菌落 白斑 质粒 电泳 载体]……
目前在做cDNA连接至TOPO载体中去。cDNA是从RT-PCR逆转录得到的，电泳结果均为单一带，但是有2个基因带很淡。载体连接后转导至E.COLI中,LB AMPICILLIN X-GAL平板蓝白筛选,蓝白均有,蓝斑个大饱满,白斑大多在蓝斑周围,个头明显小,但小白斑数量众多。
请问,蓝斑白斑的大小能说明什么问题,另外，为什么很多白斑中央会有蓝色小点呢？到底算是白斑还是蓝斑？这样的白斑个头就比较大了。为什么会出现这样的情况呢？
挑白斑作菌落PCR1个礼拜了,没有结果,总是出现片状带.之前有2个白斑提质粒,酶切,电泳是阳性克隆.用这2个插入了目的片断的质粒（经过PEG精制，测序结果OK）作为POSITIVE CONTROL，作菌落PCR,却没有得到目的带,但是出现了2000左右的带,也有片状涂抹背景.目的带500左右,相去甚远.原因不明.
想知道直接挑菌斑作菌落PCR原理是什么，为什么菌体,质粒对PCR没有影响呢？？（分子生物学入门者）
大家都说菌落PCR很容易得到阳性带，虽然有些是假阳性，但是为什么我做了这么多次，仍旧没有成功？？之前做过RT-PCR，4个基因都出带了，这样的PRIMERs和ANNEALING温度为什么对菌落pcr不适用么？
明日准备用质粒自带的M13 PRIMER再作菌落PCR。
菌落PCR原理同PCR原理没，只不过模板是菌落，DNA在PCR过程中释放出来而已。影响主要看引物特异性如何。菌落里边有很多成分会抑制PCR，所以有时候也不一定成功。那些小的白斑估计都是杂菌或者假阳性的，中间有蓝点的白斑一般也是假阳性的。为何不提取质粒后扩增？回复:
就我做TA克隆而言，蓝白筛选的假阳性实在是太高。。。。。。上次挑了24个白斑做快速鉴定，只有一个是重组了的。。。我倒是觉得，蓝斑很大，而周围长出了小的白斑，这很可能是卫星菌落，是抗生素(antibiotic)失效后的产物！请问楼主转化后培养时间多久呢？而那些中间蓝边缘白的菌斑，我觉得都是蓝斑，有可能是X-gal和IPTG涂布不均匀而导致的显色不良造成。ps：我也正在叫博亚合成M13引物，下次换菌落PCR的方法检测，有时觉得做快速鉴定也蛮痛苦的。555555回复:
做菌落PCR时，挑菌的量要尽量少，最好是新鲜的菌落。回复:
谢谢大家。最近真是郁闷，实验做到找阳性克隆卡住啦。问题多多，希望有经验的朋友帮忙。1。看了PROTOCOL上有关BLUE/WHITE SELECTION的问题，有人说用AMPICILLIN就是会出现卫星菌落，这些都不是我们要的，可是之前没看到这些材料，挑了好多这样的，因为实在没有大个白菌落可以挑了。下周如果重新作TA 克隆，计划同时用amp和KANA。。。平板培养。 2。我觉阳性菌落少最主要还是之前连接反应没有做好吧。所以计划重新作TA克隆。请问TA克隆要求用的pcr product要求是什么样的？我做TA克隆用的pcr product 是自己RT-PCR得到的。有2个基因出的带很不好，非常弱，背景比较大。如果电泳出带很弱，是不是对后面的TA克隆影响很大？？很难连接进载体么？目的插入片断一个500，一个1100。而且-20度放了有1个半月了，是不是3端A会慢慢丢掉啊？？想试过切带再作二次pcr，但是听说这样做二次pcr会出现序列出错，会么？二次PCR容易么？？看到pcr三个字母就头疼了。3。今天用M13 primers又作了菌落pcr，还是异常诡异的结果。今天改用菌落隔夜培养培养液作模版，唉，连昨天的片状带 看不见了。啥也没有。最诡异是原来测序ok 的POSITIVE CONTROL（精制后用来测序剩下的质粒，有插入目标片断的质粒）也只出了4000左右的带，而没有2个PRIMER之间的200左右的预期带。用前辈他们成功的菌落pcr条件，没有出差错，为什么PCR完全没有进行呢？Taq Gold和RT-pcr时候牌子一样，现在还是新启用的。连作了1个礼拜，连老师也找不出怎么回事，一个词，诡异。PCR我觉得就是诡异。是不是我加了太高浓度质粒模版？？有出现比较模糊拖成一片背景。实在找不出原因，我还是老老实实提质粒，酶切吧。就是效率太次，啥时候才能凑齐我要的一双SENSE，ANTI-SENSE啊，天啊，帮帮我吧。有经验朋友帮帮我吧。另外快速鉴定是什么样的？？比colony pcr效率更高么？？回复:
我做蓝白斑筛选的时候也用Amp抗性的，只要感受态制的严谨，培养时间不要过长，并没有那么容易出现卫星菌落的。一般而言，白斑的个头要比蓝斑大，但也不尽然。而且卫星菌落的白斑通常是出现很小且较密的一小圈的，挺容易辨认的。
就我个人经验觉得，用单菌落过夜培养的菌液做模板比用菌落好，要控制好量，配好反应液后，用牙签沾取菌液到反应液中即可。
做TA克隆的PCR产物最好是用纯化盒纯化一下去除多余的dNTPs和其它离子等。如果你纯化过了，放一个多月应该不至于丢失末端A，如果你担心的话，就取少量再扩一次，只要十几个循环就够了。然后纯化后再连。
有一种碱裂解法的快速鉴定是把菌落裂解了，直接跑电泳，根据迁移的速率来判断有没有插入子。操作起来也不是很方便的，而且也有很多误差。回复:
楼上的拜托下次把字写大点啊！眼睛都看酸了回复:
是卫星菌落吧回复:
卫星菌落！
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菌落概念的表述：细菌标本划线接种于固体培养基表面,由于划线的分散作用,使许多混杂的细菌在培养基表面散开,经一定时间培育后,繁殖成一堆堆肉眼可见的细菌集团,称为菌落.在一般情况下,一个菌落是由单独一个细菌不断分裂繁殖堆积而成；一个菌落中的细菌属于同一种细菌.种群概念的表述：种群是在一定空间中的同种个体的集群,作为一个种群不仅占有一定的空间,而且具有一定的结构,同一种群内的个体间具有交换基因的能力.种群虽然是有同种个体组成,但不等于个体数量的简单相加,从个体层次到种群层次是一个质的飞跃,因为种群具有个体所没有的一些“群体特征”,如种群密度、年龄组成、性别比例、出生率、死亡率、平均寿命等.观点一：一个菌落就是一个种群.因为其符合种群概念,只不过是属于“小种群”而已,某些“群体特征”不是很明显.所谓“小种群”,即个体较少的种群.当然也有学者认为只要一个种群中,只有有限的个体数目用于其后代,这一种群就可以称为小种群.观点二：一个菌落不是一个种群.

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