我表弟得鼻咽癌了，他经常鼻涕回出口腔并咽下去，这样会不会癌细胞到食道里，变成食道癌？_百度知道
问:我表弟得鼻咽癌了，他经常鼻涕回出口腔并咽下去，这样会不会癌细胞到食道里，变成食道癌？
来自湖南省衡阳市169中心医院
但实际上肿瘤转移一般不会通过这样的途径，那么不但食道可能一般不会发生这样的情况的，胃肠都会，如果会
你好!这种疾病是疑难疾病，任何治疗方法都不能保证百分之百成功。并且每个患者的个体的...
一般都是癌细胞坏死，癌细胞快速生长，中心区域得不到营养供应，故容易坏死。
食道癌的治疗包括外科治疗、放射和药物治疗以及手术加放射或药物综合治疗。提高食管癌...
纵膈里面有肿大淋巴结 怀疑转移可能，所以手术不能做了，只有采用同步放化疗的模式，
因为具体的扩散程度如何，及目前你的各器官的功能如何，但是从你所提供的资料来看，已...
* 百度知道专家平台解答内容由公立医院医生提供，不代表百度立场。* 由于网上问答无法全面了解具体情况，回答仅供参考，如有必要建议您及时当面咨询医生Gadd45a在口腔鳞状细胞癌预后及治疗中的作用研究--《山东大学》2011年博士论文
Gadd45a在口腔鳞状细胞癌预后及治疗中的作用研究
【摘要】：背景和目的
口腔鳞状细胞癌(Oral Squamous Cell Carcinoma, OSCC)是头颈部最常见的恶性肿瘤之一。目前,口腔鳞状细胞癌的临床治疗方法仍然是以手术治疗为主,并辅以放射治疗和化学药物治疗。近年来,随着手术方式的不断改进以及辅助手段的加强,口腔鳞状细胞癌的治疗效果也逐步得以改善,但其五年生存率仍不足50%。随着分子生物学研究的不断深入,肿瘤的基因治疗已经成为恶性肿瘤治疗研究的新热点。由于基因治疗具有特异性强、损伤小、对原发灶及转移灶均有效的优点,已经成为继手术、放疗和化疗之后的新的有希望的治疗手段。因此,寻找可用于口腔鳞状细胞癌治疗的靶基因对于口腔鳞状细胞癌的治疗具有十分重要的意义
生长抑制和DNA损伤基因(growth arrest- and DNA damage-inducible,Gadd)45基因家族由Gadd45α/Gadd45a, Gadd45β/Gadd45b/myd118及Gadd45γ/Gadd45g/cr6组成。其中,Gadd45a基因是DNA损伤后诱导表达的基因之一,也是抑癌基因p53和乳腺癌相关蛋白1(Breast Cancer Associated Protein 1,BRCA1)的下游靶基因。细胞DNA损伤后,Gadd45a基因可以通过p53依赖及非依赖两条途径被诱导表达升高,参与细胞周期监测点、细胞凋亡、DNA损伤修复及信号传导等重要细胞生命活动的调节,并由此介入了对肿瘤发生、发展的调控。已有研究发现,Gadd45a在乳腺癌、肺癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤中均存在表达异常。但是,国内外关于Gadd45a与口腔鳞状细胞癌关系的研究尚未见报道。
为了明确Gadd45a在人口腔鳞状细胞癌发生、发展中的作用,进一步以Gadd45a为靶点进行基因治疗提供实验依据,本论文从以下三个方面进行了研究：
1. Gadd45a在口腔鳞状细胞癌组织中的表达及其临床意义
2. Gadd45a基因沉默对舌鳞状细胞癌Tca8113细胞生物学性状的影响；
3. Gadd45a基因沉默对舌鳞状细胞癌Tca8113细胞放疗敏感性的影响。
1.探讨Gadd45a在口腔鳞状细胞癌中的表达及其临床意义
1.1.病例的收集：收集山东大学齐鲁医院年切除的原发性人口腔鳞状细胞癌手术标本106例,患者均行肿瘤局部扩大切除术及颈淋巴清扫术,术后病理明确诊断。患者的临床资料包括年龄、性别、肿瘤组织学分级、肿瘤临床分期及有无淋巴结转移等同时被收集整理。另外选取60例口腔鳞状细胞癌患者的癌旁组织作为对照。
1.2.采用免疫组化方法检测Gadd45a在口腔鳞状细胞癌及癌旁组织中的表达及定位,并分析Gadd45a蛋白表达及定位与患者临床资料之间的关系。
1.3. x2检验被用来分析Gadd45a在口腔鳞状细胞癌中的表达与患者年龄、性别、肿瘤组织学分级、临床分期及淋巴结转移之间的关系。
2.观察Gadd45a基因沉默对Tca8113细胞生物学性状的影响
2.1.采用免疫荧光技术观察Gadd45a蛋白在Tca8113细胞中的表达定位。
2.2.采用RNA干扰技术沉默Tca8113细胞中Gadd45a基因的表达：设计并合成Gadd45a的特异性干扰序列及无意义对照序列,转染Tca8113细胞,分别于转染后48h及72h收集细胞,通过real time quantitive RT-PCR及Western Blot方法检测Gadd45a-siRNA的特异性及有效性。
2.3.采用MTT法检测Gadd45a基因沉默对Tca8113细胞增殖能力的影响：将5×103个Tca8113细胞接种于96孔板,待细胞汇合度达40%时,将Gadd45a-siRNA及对照序列转染Tca8113细胞,并于转染后24h、48h及72h,用Biotek酶联免疫检测仪检测细胞在490nm的吸光度值。
2.4.特异性靶向人Gadd45a的siRNA序列及无意义对照序列分别转染Tca8113细胞,并于转染后24小时收集细胞,利用流式细胞技术检测Gadd45a基因沉默对Tca8113细胞周期的影响。
2.5.将转染Gadd45a-siRNA及无意义对照序列的Tca8113细胞以0.25%的胰酶消化、计数并接种于Transwell上层小室,置37℃培养箱培养16h,观察Gadd45a基因沉默对Tca8113细胞迁移能力的影响。
3. Gadd45a基因沉默对Tca8113细胞放疗敏感性的影响
3.1.单纯放射治疗对Tca8113细胞生物学性状的影响
1)对数生长期的Tca8113细胞接种于6孔板,待细胞达到70%融和时,分别给予0Gy、4Gy、10Gy的射线照射,照射后将培养板放入37℃培养箱继续培养24h,通过倒置显微镜及细胞HE染色观察不同剂量射线照射对Tca8113细胞形态学的影响。
2)对数生长期的Tca8113细胞接种于6孔板,待细胞达到70%融和时,分别给予0Gy、2Gy、4Gy、8Gy、10Gy的射线照射,照射后将培养板放入37℃培养箱继续培养24h,通过MTT实验观察不同剂量放射线对Tca8113细胞增殖的影响。
3)对数生长期的Tca8113细胞接种于6孔板,待细胞达到70%融和时,分别给予0Gy、2Gy、4Gy、8Gy、10Gy的射线照射,照射后将培养板放入37℃培养箱继续培养24h,收集细胞,采用流式细胞技术检测放射线对Tca8113细胞凋亡的影响。
4)对数生长期的Tca8113细胞接种于6孔板,待细胞达到70%融和时,分别给予0Gy、4Gy、10Gy的射线照射,照射后将培养板放入37℃培养箱继续培养24h,收集细胞,采用流式细胞技术分析放射线对Tca8113细胞周期的影响。
3.2.放射治疗对Tca8113细胞Gadd45a基因表达的影响：将对数生长期的Tca8113细胞接种6孔板,待细胞达到70%融和时,分别给予OGy、4Gy、10Gy的射线照射,照射后将培养板放入37℃培养箱继续培养24h,通过免疫细胞化学、real time quantitive RT-PCR和Western Blot方法检测放射线对Tca8113细胞Gadd45a表达的影响。
3.3.放射合并Gadd45a基因沉默对Tca8113细胞生物学性状的影响
1)对数生长期的Tca8113细胞接种6孔板,待细胞达到40%融和时,将Gadd45a-siRNA及对照序列转染Tca8113细胞,并于转染后24h,分别给予0Gy、2Gy、4Gy、8Gy、10Gy的射线照射照射后将培养板放入37℃培养箱继续培养24h,利用MTT法观察Gadd45a-siRNA转染组与对照组经射线照射后细胞存活情况。
2)对数生长期的Tca8113细胞接种6孔板,待细胞达到40%融和时,将Gadd45a-siRNA及对照序列转染Tca8113细胞,并于转染后24h,分别给予0Gy、4Gy、10Gy的射线照射,照射后将培养板放入37℃培养箱继续培养24h,流式细胞术分析Gadd45a-siRNA转染组与对照组经放射线照射后细胞凋亡情况。
1. Gadd45a在口腔鳞状细胞癌中的表达及其临床意义口腔鳞状细胞癌及癌旁组织的免疫组化染色结果显示：口腔鳞状细胞癌及癌旁组织均高表达Gadd45a蛋白。并且,Gadd45a蛋白表达存在两种表达模式,一种是细胞浆和细胞核均着色,细胞核占优势,我们称之为细胞核模式；另一种是细胞浆着色明显,细胞核不着色或着色浅,我们称之为细胞浆模式。60例癌旁组织中,Gadd45a的表达均为细胞核表达模式。而在106例口腔鳞状细胞癌组织中,只有60例表现为细胞核模式,其余46例的阳性着色部位以细胞浆为主,细胞核着色浅或不着色,为细胞浆模式。近一步的统计分析表明,口腔鳞状细胞癌组织中Gadd45a表达模式的转换与患者的年龄、肿瘤的组织学分级、肿瘤临床分期及淋巴结转移之间存在密切的关系。年龄＜60岁的肿瘤患者组织中,Gadd45a的表达以细胞浆模式为主,而年龄＞60岁的肿瘤患者组织中,Gadd45a的表达以细胞核模式为主(p0.05)。Gadd45a表达模式在不同组织学分级的口腔鳞状细胞癌之间存在显著的差异(p＜0.05),高分化及中分化口腔鳞状细胞癌组织中Gadd45a的表达分布以细胞核模式为主,而在低分化口腔鳞状细胞癌组织中Gadd45a的表达分布以细胞浆模式为主。72.2%的Ⅰ、Ⅱ期肿瘤患者组织中Gadd45a的表达以细胞核模式为主,而在Ⅲ、Ⅳ期肿瘤患者中以细胞核模式表达Gadd45a的组织标本只占48.6%,二者间存在显著的差异(p＜0.05)。在存在淋巴结转移的肿瘤患者组织标本中,以细胞浆模式表达Gadd45a的比例明显高于无淋巴结转移的患者(p＜0.05)
2. Gadd45a基因沉默对Tca8113细胞生物学性状的影响
2.1. Gadd45a在Tca8113细胞中的表达：为了研究Gadd45a基因在口腔鳞状细胞癌发生、发展中的作用,我们选择高分化的舌鳞状细胞癌细胞系Tca8113作为研究对象。细胞免疫荧光染色结果显示,Gadd45a在Tca8113细胞中广泛表达,其着色部位主要在细胞核,与高分化口腔鳞状细胞癌组织标本中Gadd45a的表达模式基本一致。
2.2. Gadd45a-siRNA干扰效率的检测：为了证明Gadd45a-siRNA的特异性及有效性,real time quantitive RT-PCR及Western Blot方法被用来检测Gadd45a-siRNA转染组和对照组Tca8113细胞中Gadd45a的表达,结果显示,靶向Gadd45a的siRNA有效抑制了Tca8113细胞中Gadd45a mRNA及蛋白水平的表达。
2.3. Gadd45a基因沉默对Tca8113细胞增殖的影响：我们利用MTT法检测了Gadd45a-siRNA转染组与对照组Tca8113细胞的增殖能力,结果显示,转染Gadd45a-siRNA的Tca8113细胞在转染后48h及72h的增殖能力较对照组明显增强。
2.4. Gadd45a基因沉默对Tca8113细胞周期的影响：利用siRNA技术将Tca8113细胞中的Gadd45a基因沉默以后24h,收集细胞通过流式细胞仪检测细胞周期的变化,结果显示,Gadd45a基因沉默导致Tca8113细胞G2/M期监测点异常,处于G2期的细胞比例明显减少,而S期细胞的比例显著增多(p＜0.05)
2.5. Gadd45a基因沉默对Tca8113细胞迁移能力的影响：Gadd45a-siRNA转染组及对照组Tca8113细胞接种于Transwell上层小室,37℃培养箱培养16h,计数迁移的细胞数,观察Gadd45a基因沉默对Tca8113细胞迁移能力的影响,结果显示,Gadd45a-siRNA转染组迁移的细胞数明显高于对照组(p＜0.05),表明Gadd45a基因沉默增强了Tca8113细胞的迁移能力。
3. Gadd45a基因沉默对Tca8113细胞放疗敏感性的影响
3.1.单纯射线照射对Tca8113细胞生物学性状的影响
1)我们通过倒置显微镜及HE染色技术观察了不同剂量射线照射对Tca8113细胞形态的影响,结果发现Tca8113细胞经10Gy射线照射后24h,细胞体积变大,细胞间隙变宽,凋亡及坏死漂浮的细胞增多,细胞密度明显低于未照射或低剂量照射组细胞。
2) MTT实验被用来观察放射线对Tca8113细胞增殖的影响,结果显示,4-10Gy放射线有效抑制了Tca8113细胞的增殖,且呈剂量依赖性
3) Annexin V-PI细胞凋亡双染试剂盒被用于检测放射线诱导的Tca8113细胞的凋亡,结果显示,4-10Gy射线照射明显诱导了Tca8113细胞的凋亡,且呈剂量依赖性。
4)细胞周期PI染色显示,10Gy射线照射导致了Tca8113细胞G2/M期的阻滞,使处于G1及S期的细胞明显减少
3.2.放射线照射诱导了Tca8113细胞Gadd45a基因的表达上调：为了研究Gadd45a在口腔鳞状细胞癌放疗中的作用,我们首先通过real time quantitive RT-PCR和Western Blot观察了Tca8113细胞在接受射线照射前后Gadd45a表达的变化情况,结果发现,Tca8113细胞在接受4Gy或10Gy射线照射后24小时,Gadd45a mRNA水平较照射前明显升高(0..00005 vs 0..0644±0.000065 vs 0..00002)。并且10Gy射线照射亦显著诱导了Tca8113细胞Gadd45a蛋白的表达上调(p=0.0028)。
3.3. Gadd45a基因沉默合并射线照射对Tca8113细胞生物学性状的影响：为了检测Gadd45a基因沉默对Tca8113细胞放疗敏感性的影响,我们首先利用real time quantitive RT-PCR和Western Blot检测了Gadd45a-siRNA的有效性,结果显示Gadd45a-siRNA有效抑制了Tca8113细胞中Gadd45a基因及蛋白水平的表达(p＜0.05)。随后我们采用MTT及流式细胞技术观察了siRNA实验组及对照组Tca8113细胞在接受不同剂量射线照射时细胞存活分数及凋亡情况的变化。MTT结果显示,Tca8113细胞在受到4Gy及以上剂量射线照射时,siRNA实验组细胞存活分数明显高于对照组(p＜0.05)。流式细胞技术检测结果也显示Tca8113细胞在受到4Gy及10Gy射线照射时,Gadd45a基因沉默组细胞的凋亡受到明显抑制,细胞凋亡分数较对照组明显下降(p＜0.05)
1. Gadd45a在人口腔鳞状细胞癌中存在细胞浆-细胞核表达模式的转换,并且Gadd45a的表达模式与口腔鳞状细胞癌的组织学分级、TNM分期及淋巴结转移密切相关。
2. Gadd45a在人舌鳞状细胞癌细胞中的表达缺失促进了癌细胞的生长和迁移,其机制可能是通过干扰细胞周期调控以及抑制细胞发生凋亡。
3.放射诱导的人舌鳞状细胞癌细胞中Gadd45a基因表达升高促进了细胞凋亡,增强了人舌鳞状细胞癌细胞对放疗的敏感性。
创新性和意义
1.本研究的创新点是在国内外首次发现Gadd45a在人口腔鳞状细胞癌中的表达存在细胞浆-细胞核表达模式的转换,并且与患者的组织学分级及TNM分期有关。并通过体外实验进一步证实,Gadd45a基因表达缺失促进了舌鳞状细胞癌细胞的生长及迁移。为以Gadd45a为靶点进行基因治疗提供了理论依据。
2.本研究首次采用RNA干扰技术揭示,放射诱导的舌鳞状细胞癌细胞中Gadd45a的表达升高增强了人舌鳞状细胞癌细胞对放疗的敏感性,为探索口腔鳞状细胞癌放疗增敏的靶基因提供了新的思路和方向。
【关键词】：
【学位授予单位】：山东大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2011【分类号】：R739.85【目录】：
中文摘要8-16
ABSTRACT16-23
符号说明23-24
第一部分 Gadd45a在口腔鳞状细胞癌中的表达及意义27-39
材料和方法28-30
第二部分 Gadd45a基因沉默对Tca8113细胞生物学性状的影响39-64
材料和方法40-54
第三部分 Gadd45a基因沉默对Tca8113细胞放疗敏感性的影响64-81
材料和方法65-71
全文总结论81-82
附图表82-96
参考文献96-115
致谢115-116
攻读博士学位期间发表的文章116-117
学位论文评阅及答辩情况表117-118
附外文论文118-154
欢迎：、、)
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制作洋葱鳞片叶皮装片和制作人体口腔上皮细胞装片时，清洁以片后在载玻片上分别滴加的是（　　）A．清水，生理盐水B．清水，清水C．生理盐水，清水D．生理盐水，生理盐水
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制作口腔上皮细胞细胞临时装片的实验步骤简单的总结为：擦、．滴、．刮、．涂、．盖、染吸．“擦”，用干净的纱布把载玻片和盖玻片擦拭干净；“滴”，把载玻片放在实验台上，用滴管在载玻片的中央滴一滴生理盐水；“刮”，用消毒牙签在口腔上膛轻轻地刮几下；“涂”，把带有口腔上皮细胞的牙签膜放在载玻片中央的生理盐水滴中，涂抹均匀；“盖“，用镊子夹起盖玻片，使它的一端先接触载玻片上的液滴，然后缓缓放平；“染吸”，在盖玻片的一侧滴加碘液，另一侧用吸水纸吸引，重复2～3次，使染液浸润到标本的全部．制作洋葱表皮细胞临时装片的实验步骤简单的总结为：擦、滴、撕、展、盖、染．“擦”，用干净的纱布把载玻片和盖玻片擦拭干净；“滴”，把载玻片放在实验台上，用滴管在载玻片的中央滴一滴清水；“撕”，把洋葱鳞片叶向外折断，用镊子从洋葱鳞片叶的内表面撕取一块薄膜；“展”，把撕取的薄膜放在载玻片中央的水滴中，用解剖针轻轻的把水滴中的薄膜展开；“盖“，用镊子夹起盖玻片，使它的一端先接触载玻片上的液滴，然后缓缓放平；“染”，在盖玻片的一侧滴加碘液，另一侧用吸水纸吸引，重复2～3次，使染液浸润到标本的全部．综上所述：A符合题意，B、C、D选项不符合题意．故选：A
本题考点：
制作临时装片观察人的口腔上皮细胞；制作临时装片观察植物细胞．
问题解析：
本题考查的知识点是制作临时装片观察人的口腔上皮细胞．据此解答．您所在位置：
&& 文章详情
细胞角蛋白19 mRNA在口腔鳞状细胞癌中表达的研究
作者：冯燕
梁尚争&&&&作者单位：1.泸州医学院附属口腔医院
口腔内科；2.口腔颌面外科，四川
泸州 646000
探讨口腔鳞状细胞癌（OSCC）患者癌组织中细胞角蛋白（CK）19 mRNA的变化和其发生的可能机制以及CK19 mRNA检测的临床应用价值。方法
收集未接受过放疗和化疗的20例OSCC患者的手术标本（包括癌组织20块、癌旁组织20块和颈清扫的淋巴结43枚），采用荧光定量聚合酶链式反应（FQ-PCR）法检测组织内CK19 mRNA的表达，比较CK19 mRNA在上述组织中的相对表达量。结果
CK19 mRNA在OSCC癌组织内表达比其在正常口腔黏膜内表达高1.85倍，比其在癌旁组织内表达高1.66倍。9例患者颈清扫淋巴结内CK19 mRNA表达阳性，阳性率为45%（9/20），而9例患者的22枚淋巴结中CK19 mRNA表达阳性率是81.8%（18/22），占20例患者43枚淋巴结的41.9%（18/43）。淋巴结CK19 mRNA阳性患者的癌组织与癌旁组织和正常口腔黏膜的表达量比CK19 mRNA阴性患者低。结论
CK19 mRNA在OSCC癌组织中的表达高于其在癌旁组织和正常口腔黏膜内的表达，可能是由于癌组织中CK19的合成明显增加所致。淋巴结中CK19 mRNA的表达可以作为检测OSCC淋巴结微转移的指标之一，运用FQ-PCR法检测淋巴结中CK19 mRNA的表达来检测OSCC的淋巴结微转移比普通病理法检测更灵敏。
【关键词】& 口腔鳞状细胞癌 细胞角蛋白19 荧光定量聚合酶链式反应 微转移
&&& Study on the expression of cytokeratin 19 mRNA in oral squamous cell carcinoma& FENG Yan1, GU Ya-lan2, NIE Min-hai1, ZHANG Qi-mei1, LIANG Shang-zheng2.（1. Dept. of Oral Medicine, The Affiliated Dental Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou 646000, C 2. Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery, The Affiliated Dental Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou 646000, China）&&
&&& [Abstract]& Objective& To elucidate the possible mechanism of oral carcinogenesis and to explore the value of clinical application of the detection of cytokeratin（CK） 19 for oral squamous cell carcinoma（OSCC） patients. MethodsThe cancerous tissues, para-cancerous tissues and excised lymph nodes were collected from 20 operated patients with OSCC. The patients didn&t receive radiotherapy and chemotherapy before hospitalization. The relative expression of CK19 mRNA in those tissues was detected by fluorescent quantitative polymerase chain reaction（FQ-PCR）. ResultsThe expression of CK19 mRNA in the cancerous tissues was 1.85 and 1.66 times higher than that in normal oral mucosa and in para-cancerous tissues, respectively. The expression of CK19 mRNA in lymph nodes from 9 patients with OSCC was positive and the positive rate was 45%（9/20）. The positive rate of CK19 mRNA in all lymph nodes from 9 patients with OSCC was 81.8%（18/22）, and the positive rate of CK19 mRNA in all lymph nodes from 20 patients with OSCC was 41.9%（18/43）. CK19 mRNA level in the cancerous tissues relative to para-cancerous tissues and normal oral mucosa of the patients whose CK19 mRNA expression was positive was lower than that of the patients whose CK19 mRNA expression was negative in lymph nodes, respectively. Conclusion& The possible reason that the expression of CK19 mRNA in the cancerous tissues was higher than that in para-cancerous tissues and normal oral mucosa was that the CK19 synthesis in cancerous tissues increased obviously. The detection of CK19 mRNA in lymph nodes was regarded probably as one of the markers for detecting OSCC micrometastasis in lymph nodes. The detection of CK19 mRNA in lymph nodes by FQ-PCR was more sensitive than hematoxylin-eosin staining in diagnosing OSCC micrometastasis.
　　[Key words]& oral squamous cell carcinoma； cyto- keratin 19； fluorescent quantitative polymerase chain reaction； micrometastasis
　　荧光定量聚合酶链式反应（fluorescent quantita-tive polymerase chain reaction，FQ-PCR）是一种新的核酸定量技术，具有高灵敏性、高特异性和高精确性等优于常规聚合酶链式反应（polymerase chainreaction，PCR）的特点，能同时进行扩增和检测[1]。
　　本研究采用FQ-PCR分别对不同病例的癌组织、癌旁组织、颈清扫淋巴结和正常口腔黏膜细胞角蛋白19（cytokeratin 19，CK19）mRNA的表达进行检测。
　　1& 材料和方法
　　1.1& 研究对象
　　选取月泸州医学院附属口腔医院口腔颌面外科20例病理确诊的口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）患者，男15例，女5例，年龄36～78岁，平均年龄为（56.25&11.60）岁。按照WHO口腔鳞状细胞癌组织分型标准，高分化标本18例，高、中分化之间的标本2例。收集OSCC患者癌组织20块、癌旁组织20块和颈清扫的淋巴结43枚。癌组织为手术切除癌组织的中央组织，癌旁组织为距手术切除癌组织2 cm的组织，颈清扫淋巴结术后组织病理学检查均无转移。选取20例来自同一时期唇裂修补术及口腔良性病变患者的口腔正常黏膜或良性病变周围的正常黏膜作为正常口腔黏膜，其中男11例，女9例，年龄1岁7月～80岁，平均年龄为（30.46&23.68）岁。
　　1.2& 组织标本的采集和处理
　　组织标本取自术中，每例OSCC癌组织、癌旁组织、淋巴结和正常口腔黏膜均分为2份，一份标本离体后采用4%中性甲醛固定，送病理科作病理诊断；另一份标本离体后放入含有RNA保存液的2 mL冻存管内置于液氮保存待用。每一份标本均采用FQ-PCR法对CK19 mRNA的表达进行检测。
　　1.3& 荧光定量聚合酶链式反应
　　1.3.1& 组织总RNA的提取和cDNA的合成& 按照总RNA提取试剂盒说明书提取组织总RNA，使用核酸蛋白测定仪测定总RNA的浓度和纯度。按M-MVL逆转录试剂盒要求合成cDNA。
　　1.3.2& 引物的设计和合成& 采用Primer Express 2.0软件设计，针对CK19全序列的830～1 029 bp设计引物序列（由上海基康生物技术有限公司合成），PAGE纯化。CK19上游引物序列：5&-AATTGAACCGGGA-GGTCGCT-3&，下游引物序列：5&-GCTGATCAGC- GCCTGGATAT-3&，扩增产物长度约为200 bp；管家基因GAPDH由逆转录试剂盒提供，GAPDH上游引物序列：5&-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3&，下游引物序列：5&-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3&，扩增产物长度约为450 bp。在PCR扩增仪上设置退火温度和反应时间，确定最佳PCR扩增条件，扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
　　1.3.3& 荧光定量聚合酶链式反应& 在BIO-BRA iCycler
　　荧光定量PCR仪中以最佳PCR条件进行扩增，50 &L反应体系包括SYBR Green Real Time PCR Master Mix 25 &L、蒸馏水18 &L、10 &mol/L CK19上游引物1 &L、10 &mol/L CK19下游引物1 &L、10 &mol/L GAPDH上游引物1 &L、10 &mol/L GAPDH下游引物1 &L、模板cDNA样品20 mL/L。反应条件如下：95 ℃预变性60 s，95 ℃变性15 s，59 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，40个循环，以双蒸水作阴性对照。
　　1.3.4& 检测结果的计算& 根据热循环仪检测反应体系中荧光信号的强度值，即Cｔ值，记录癌组织、癌旁组织、淋巴结和口腔正常黏膜中目的基因CK19和管家基因GAPDH的Cｔ，假设癌组织、癌旁组织及正常口腔黏膜中CK19的相对表达量为Z，根据公式计算Z=2-△△Cｔ，△△Cｔ=△Cｔ实验组－△Cｔ对照组，△Cｔ=（CtCK19－CtGAPDH）。
　　1.4& 统计学处理&
　　采用SPSS 13.0软件包进行统计分析，计量资料组间两两比较采用t检验，多组间的比较采用方差分析。
　　2& 结果
　　2.1& FQ-PCR扩增产物电泳分析
　　FQ-PCR扩增产物电泳图见图1。在凝胶成像系统中进行观察，在200 bp处可见目的条带，450 bp处可见GAPDH对照条带。1、11：标准相对分子质量参照物；2、10：GAPDH对照；3、7：正常口腔黏膜标本；4：阴性对照；5：淋巴结CK19 mRNA阴性；6：淋巴结CK19 mRNA阳性；8：癌组织标本；9：癌旁组织标本图 1& FQ-PCR扩增产物电泳图Fig 1& FQ-PCR product band of the CK19 mRNA in 2% agarosegel
　　2.2& FQ-PCR检测结果
　　OSCC癌组织组、癌旁组织组相对于正常口腔黏膜组的FQ-PCR检测结果见表1。经方差齐性检验，P=0.22＞0.05，方差齐性。F=40.23，P＜0.000 1。进一步两两比较显示，癌组织组与癌旁组织组及正常口腔黏膜组间CK19 mRNA差异均有统计学意义（P＜0.000 1），癌旁组织组与正常口腔黏膜组间差异无统计学意义（P＞0.05）。癌组织内CK19 mRNA比正常口腔黏膜组高1.85倍。OSCC癌组织组与癌旁组织组FQ-PCR检测结果相比，癌组织组、癌旁组织组的Z平均值分别为1.70&0.36、1.03&0.25，癌组织组比癌旁组织组高1.66倍。配对t检验，t=10.585，P＜0.000 1。经2组配对统计分析比较，分析2组间的相关性，相关系数为0.67，P=0.002＜0.05，说明2组间有相关性。FQ-PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，发现9例患者颈清扫淋巴结中CK19 mRNA表达阳性，阳性率为45%（9/20），9例患者的22枚淋巴结中CK19 mRNA表达阳性率是81.8%（18/22），占20例患者43枚淋巴结的41.9%（18/43）。淋巴结中CK19 mRNA阳性与CK19 mRNA阴性患者的癌组织与癌旁组织FQ-PCR检测结果相比，独立样本t检验，t=2.72，P=0.017。CK19 mRNA阳性、阴性患者的Z平均值分别为1.47&0.16、1.86&0.44。CK19 mRNA阳性患者的癌组织与癌旁组织的表达量比CK19 mRNA阴性患者低（P＜0.05）。淋巴结CK19 mRNA阳性与CK19 mRNA阴性患者的癌组织与正常口腔黏膜FQ-PCR检测结果相比，独立样本t检验，t=-2.22，P=0.049。CK19 mRNA阳性、阴性患者的Z平均值分别为1.69&0.49、2.08&0.22。CK19 mRNA阳性患者的癌组织与正常口腔黏膜的表达量比CK19 mRNA阴性患者低（P＜0.05）。
　　3& 讨论
　　OSCC是最常见的口腔恶性肿瘤。近年来，与口腔黏膜增生和恶性变相关的CK19引起人们关注。CK19是构成细胞骨架的一种酸性多肽，是鳞状细胞癌中相对分子质量最小的细胞角蛋白。本实验结果发现，OSCC癌组织中CK19 mRNA的表达相对于正常口腔黏膜高1.85倍，与采用免疫组化、电泳和Western杂交方法等研究的结果相同[2]；癌组织中CK19 mRNA的表达比癌旁组织高1.66倍，与钟来平等[3]的研究结果相似。说明癌组织中CK19 mRNA的表达也高于癌旁组织，提示癌组织中CK19 mRNA的表达明显增加。
　　目前，CK19已经作为多种上皮来源的肿瘤微转移的一个标记物，分别用于检测多种上皮来源的肿瘤的淋巴结[4-7]、骨髓[8-10]、外周血[11]中肿瘤的微转移，用于判断肿瘤的分期和预后。本研究对20例标本颈清扫的43枚淋巴结进行CK19 mRNA检测，9例患者颈清扫淋巴结中CK19 mRNA表达阳性，阳性率为45%，9例患者的22枚淋巴结中CK19 mRNA表达阳性率是81.8%，占20例患者43枚淋巴结的41.9%。作为结缔组织来源的淋巴结中出现了上皮来源的CK19 mRNA的表达，而在苏木精-伊红染色的病理切片中没有发现转移，提示淋巴结中CK19 mRNA的表达可以作为检测OSCC淋巴结微转移的指标之一，运用FQ-PCR法检测淋巴结中CK19 mRNA的表达来检测OSCC的淋巴结微转移比普通病理法检测更灵敏。
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