Dpn1酶切时间_百度知道
Dpn1酶切时间
大约时间多少比较好啊定点突变，PCR后，要用Dpn1酶切？酶切体系是怎样的
我有更好的答案
按默认排序
一般40min-1小时30分钟
其他类似问题
等待您来回答
下载知道APP
随时随地咨询
出门在外也不愁&& 查看话题
【求助/交流】定点突变PCR后加DPN1酶的作用
如题，定点突变做完PCR后，要用DPN1在37℃处理，据说是消除模板，我想知道的具体点，谢谢各位虫友交流····
没人指教哦 消除原有质粒位于突变位点区域的parent template 降解模板质粒DNA，因为DpnI是甲基化依赖的，模板DNA带有甲基，而新合成的带有突变的环状DNA没有甲基化修饰，所以不能被降解，这样提高突变的筛选效率 楼上正解~~
var cpro_id = 'u1216994';
欢迎监督和反馈：本帖内容由
提供，小木虫仅提供交流平台，不对该内容负责。欢迎协助我们监督管理，共同维护互联网健康，如果您对该内容有异议，请立即发邮件到
联系通知管理员，也可以通过QQ周知，我们的QQ号为：8835100
我们保证在1个工作日内给予处理和答复，谢谢您的监督。
小木虫，学术科研第一站，为中国学术科研研究提供免费动力
广告投放请联系QQ： &
违规贴举报删除请联系邮箱： 或者 QQ:8835100
Copyright &
eMuch.net, All Rights Reserved. 小木虫 版权所有&& 查看话题
【求助/交流】定点突变-DpnI消化
& && &我最近做定点突变，采用反向PCR方法扩整个质粒+基因片段（突变位点设计在两互补的突变引物中间），高保真酶跑20个循环，直接在20uLPCR产物中加入1uLDpnI消化3h，取10uL转化JM109，涂Amp平板，一颗菌未长，郁闷中，请大家帮忙！这种突变方法需要注意些什么呢？
& &&&请问DpnI消化前或后需要纯化吗？我没有，好些资料上也说不需要纯化。
感觉问题不是出在消化这一步了。消化不好应该有菌落长出来才对！
认为是在PCR扩增问题。 Originally posted by 月月大可 at
感觉问题不是出在消化这一步了。消化不好应该有菌落长出来才对！
认为是在PCR扩增问题。 那请问怎么样检测是否PCR扩增出问题了？谢谢 Originally posted by 04swlcm at
那请问怎么样检测是否PCR扩增出问题了？谢谢 P完跑胶看是否有质粒大小条带。确认P出来了再消化。 Originally posted by 04swlcm at
那请问怎么样检测是否PCR扩增出问题了？谢谢 没有很好的方法，单纯的看大小和扩增出来没有意义并不大。
注重引物的设计，如果重复几次没有结果就换成粘性末端的引物试试，也许可以。 PCR产物消化前是不用纯化的。
你可以做50ul的体系，做25个循环，用好一点的聚合Mei，P完后点8ul上样跑个胶，观察是否看得见你要的条带。
看不见也不要紧，接下来就可以用DpnI消化了。
转化用的感受态最好要效率高一点。
祝你好运！ 先请教个问题，DpnI消化的目的是什么？还有我查了NEB的说明书，DpnI只有在识别位点被甲基化后才可以切割，通过PCR方法扩出来的产物是完全不会被甲基化的，所以你的这一步消化一点作用都没有。如果鉴定PCR产物是否正确能不能拿突变之前的模板一起跑个胶看带型一不一样呢，或者把产物做一下单酶切，看大小正确吗。祝你成功 楼上的好像完全不懂定点突变的原理啊！去找个官方的介绍看看再说吧。
我做过不少点突变，各种各样的，同时突变几个的，加进去的，减少的，随意改变连续7个以内氨基酸残基的我都做过，一次成功率几乎100%，应该说这种方法是非常强大的。关键就在PCR这步，我做的时候会按照protocol上做对照，如果你PCR做出来的条带比对照的明显亮很多，那基本上就成功了。
引物的设计也是关键，原protocol上说的引物设计方法效率非常差，最好的设计方法是两条引物3端分别突出一段。这两个地方弄好了，基本上就没问题了。
另外，DpnI消化之前不用纯化，直接把酶加到反应体系里混匀然后放37度就行了。推荐转化时用DMT菌株，这种菌株有和DpnI相似的功能，能把模板链消化掉，使成功率更加接近100%。如果没有这种菌株，可以将酶切时间从1小时延长到2-3个小时。 想问一下楼上，我正在做定点突变这个实验，用DpnI酶切时间需要一个小时那么久吗？我看的这个说明书上说只需要5分钟就好了！但是，按照说明书上做下来并没有长出菌落，而且你一般做转化时用的感受态一般是多少啊，我这个说明书上说45μl，总感觉少了点！而且，你热激的时间是30s还是90s啊？你在做复苏菌体是培养基是用的LB还是NZYMa啊？我这边问题很多，还望能帮忙解答！！谢谢！ 一方面可能是你PCR过程出现问题，一般用Dpn1消化之前，先跑电泳，看看有没有大概大小正常的条带，如果有的话再去做转化。
另一方面可能是感受态细胞的问题。建议把模板质粒也导入JM109做平行对照。 : Originally posted by 空谷幽风 at
先请教个问题，DpnI消化的目的是什么？还有我查了NEB的说明书，DpnI只有在识别位点被甲基化后才可以切割，通过PCR方法扩出来的产物是完全不会被甲基化的，所以你的这一步消化一点作用都没有。如果鉴定PCR产物是否正 ... DPNI的作用就是把你的模板消化掉
var cpro_id = 'u1216994';
欢迎监督和反馈：本帖内容由
提供，小木虫仅提供交流平台，不对该内容负责。欢迎协助我们监督管理，共同维护互联网健康，如果您对该内容有异议，请立即发邮件到
联系通知管理员，也可以通过QQ周知，我们的QQ号为：8835100
我们保证在1个工作日内给予处理和答复，谢谢您的监督。
小木虫，学术科研第一站，为中国学术科研研究提供免费动力
广告投放请联系QQ： &
违规贴举报删除请联系邮箱： 或者 QQ:8835100
Copyright &
eMuch.net, All Rights Reserved. 小木虫 版权所有dpn1酶的具体使用方法
18:41:07&&&来源：&&&评论：&&
[dpn1酶的具体使用方法] 在用片段敲除大肠杆菌(Escherichia coli)基因过程中，我想将pcr后的敲除片段用dpn1酶处理一下消除模板，请问具体怎么做？多大的体系加多少酶？还要加缓冲液吗？还是直接在pcr体系里加酶？求大神指导啊！:dragon1::dragon1::dragon8::dragon8::drag 关键词:[模板 基因 大肠杆菌 缓冲液 聚合酶 克隆 里加]…
在用片段敲除大肠杆菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)基因过程中，我想将pcr后的敲除片段用dpn1酶处理一下消除模板，请问具体怎么做？多大的体系加多少酶？还要加缓冲液吗？还是直接在pcr体系里加酶？
求大神指导啊！:dragon1::dragon1::dragon8::dragon8::dragon8:回复其实这个都行。我做点突的时候，取10ul体系，加1ul DpnI, TaKaRa公司的酶可以不用buffer，直接用酶37°C消化过夜。
祝好！回复基本上不用加buffer，你的模版才几十ng吧，我们都是加1ul酶，一小时就足够了。你要是实在不放心，可以做个对照看看，一个反应里面不加pcr的，然后同时消化转化看克隆数就知道了。回复
其实这个都行。我做点突的时候，取10ul体系，加1ul DpnI, TaKaRa公司的酶可以不用buffer，直接用酶37°C消化过夜。
祝好！ 过夜不会太久了吗？而且我pcr的量很多，有几百ul，是把它们合起来切还是分开？回复
其实这个都行。我做点突的时候，取10ul体系，加1ul DpnI, TaKaRa公司的酶可以不用buffer，直接用酶37°C消化过夜。
祝好！ 过夜不会太久了吗？而且我pcr的量很多，有几百ul，是把它们合起来切还是分开？回复
过夜不会太久了吗？而且我pcr的量很多，有几百ul，是把它们合起来切还是分开？... 这个，这么大的量使用DpnI有点浪费，没有经验。
少量模板还可以使用该酶来处理，还比较干净。
如果有别的办法还是不要这么干的好。
将本文分享到下面的网站：
相关热词搜索：
[dpn1酶的具体使用方法]延伸阅读：
频道总排行
频道本月排行&& 查看话题
dpn1酶的具体使用方法
在用片段敲除大肠杆菌基因过程中，我想将pcr后的敲除片段用dpn1酶处理一下消除模板，请问具体怎么做？多大的体系加多少酶？还要加缓冲液吗？还是直接在pcr体系里加酶？
求大神指导啊！:dragon1::dragon1::dragon8::dragon8::dragon8:
其实这个都行。我做点突的时候，取10ul体系，加1ul DpnI, TaKaRa公司的酶可以不用buffer，直接用酶37°C消化过夜。
祝好！ 基本上不用加buffer，你的模版才几十ng吧，我们都是加1ul酶，一小时就足够了。你要是实在不放心，可以做个对照看看，一个反应里面不加pcr的聚合酶，然后同时消化转化看克隆数就知道了。 : Originally posted by shiyiyaya at
其实这个都行。我做点突的时候，取10ul体系，加1ul DpnI, TaKaRa公司的酶可以不用buffer，直接用酶37°C消化过夜。
祝好！ 过夜不会太久了吗？而且我pcr的量很多，有几百ul，是把它们合起来切还是分开？ : Originally posted by shiyiyaya at
其实这个都行。我做点突的时候，取10ul体系，加1ul DpnI, TaKaRa公司的酶可以不用buffer，直接用酶37°C消化过夜。
祝好！ 过夜不会太久了吗？而且我pcr的量很多，有几百ul，是把它们合起来切还是分开？ : Originally posted by 思念de季节 at
过夜不会太久了吗？而且我pcr的量很多，有几百ul，是把它们合起来切还是分开？... 这个，这么大的量使用DpnI有点浪费，没有经验。
少量模板还可以使用该酶来处理，还比较干净。
如果有别的办法还是不要这么干的好。
var cpro_id = 'u1216994';
欢迎监督和反馈：本帖内容由
提供，小木虫仅提供交流平台，不对该内容负责。欢迎协助我们监督管理，共同维护互联网健康，如果您对该内容有异议，请立即发邮件到
联系通知管理员，也可以通过QQ周知，我们的QQ号为：8835100
我们保证在1个工作日内给予处理和答复，谢谢您的监督。
小木虫，学术科研第一站，为中国学术科研研究提供免费动力
广告投放请联系QQ： &
违规贴举报删除请联系邮箱： 或者 QQ:8835100
Copyright &
eMuch.net, All Rights Reserved. 小木虫 版权所有