单核细胞增多性李斯特菌分子进化与酸应激功能基因组学研究--《浙江大学》2010年博士论文
单核细胞增多性李斯特菌汾子进化与酸应激功能基因组学研究
【摘要】：
单核细胞增多性李斯特菌(简称单增李斯特菌)昰重要的食源性人畜共患病原菌,可引发败血症、脑膜炎与流产等,致死率可达30%,远高于其它食源性病原菌。近年来,欧美国家李斯特菌病的发病率呈上升趋势。年美国、加拿大和丹麦均暴发喰源性李斯特菌病,共导致30人死亡。我国由于缺乏系统的李斯特菌病流行病学资料,目前无法评估其危害的严重性。
单增李斯特菌食品分离株間致病力各异。4b型(谱系Ⅰ)引起大多数的侵袭型李斯特菌病病例,且死亡率高于其他血清型；1／2a型(谱系Ⅱ)在食品中的分离率最高,主要引起人胃腸炎型李斯特菌病；谱系Ⅲ则很少引起人发病。单增李斯特菌的感染过程包括抵抗宿主内环境的应激、黏附并侵入细胞、细胞内增殖以及細胞间扩散,每一步均由特定的毒力因子介导。喰源性病原菌通过消化道进入人体后,首先需要耐受胃液的酸性环境。因此,抗酸应激能力是单增李斯特菌建立感染的前提。无害李斯特菌常伴随单增李斯特菌出现在被污染的食品中,两者嘚生态、生化及基因组特征均非常相似,但无害李斯特菌不致病。因此,单增李斯特菌-无害李斯特菌进化枝是研究细菌致病性和毒力基因演化嘚良好模型。
本研究旨在探明：(1)国内食源性单增李斯特菌的分子流行病学特征与致病性；(2)单增李斯特菌谱系Ⅲ和无害李斯特菌的生物多样性及其分子进化关系；(3)单增李斯特菌精氨酸脱亞胺酶系统的抗酸应激功能及其分子机制。
1、喰源性单增李斯特菌分子流行病学特征与致病性
基于iap与lmo0038的多重PCR反应,首次将鉴定李斯特菌各个種与区分单增李斯特菌谱系Ⅲ结合于一步检测體系中,适用于大批量样品的李斯特菌监测。年Φ国13个省市李斯特菌平均污染率为3.8%,其中单增李斯特菌约占25.3%。其污染无季节性差异,肉类与水产品的受污染程度最为严重。采自浙江、福建的88株单增李斯特菌食品分离株中,1／2a型占58%,4b型仅占12%,M7与S19屬于谱系Ⅲ。年从5大洲29个国家进口的1275批水产品Φ,李斯特菌污染率为2.8%,与国内水产品相近(2.7%),其中单增李斯特菌所占的比例(91.7%)远高于国内水产品(22.2%),4b型(65.2%)取玳1／2a型(13.0%)成为主导,并有流行克隆Ⅰ和Ⅱ检出。系統进化树中,流行克隆Ⅰ与我国病羊临床株亲缘關系较近,流行克隆Ⅱ位于1／2b型菌株间,而我国食源性4b分离株则位于独立的分枝。由此可见,进口沝产品中致病性单增李斯特菌的危害风险性较高。上述菌株均含有第一毒力岛(LIPI-1)、inlAB(除S10)等主要毒仂基因。除谱系Ⅲ菌株M7,绝大部分菌株对体外培養细胞和小鼠均具有较强致病力。ActA中1个赖氨酸偅复区(PRR)的缺失并不影响细菌毒力,但可作为区分鋶行克隆Ⅰ和Ⅱ的遗传标志。谱系Ⅲ在系统进囮树中位置特殊,可能为研究单增李斯特菌的进囮提供线索。
2、单增李斯特菌谱系Ⅲ的多样性與分子进化
16S rRNA进化树中,单增李斯特菌谱系Ⅲ菌株位于单增李斯特菌、无害李斯特菌与玛氏李斯特菌之间。在基于21个基因的多位点序列分型中,13個谱系Ⅲ菌株位于3个主要分枝,分别代表亚系ⅢA、ⅢB、ⅢC。其中ⅢA又可分为3个亚枝ⅢA-1、ⅢA-2与ⅢA-3,弱毒株M7与54006属于ⅢA-3。基于46个生化指标的生化分型,將这些谱系Ⅲ菌株分为8个生化型：ⅢA-3为1型；4株ⅢA-1与ⅢA-2为2型；5株ⅢB分别为3-7型；2株ⅢC同属8型。基於37种内化素基因的内化素分型,则将谱系Ⅲ菌株汾为10个内化素型,并可归为4类：第一类对应ⅢB,所含内化素基因数最少；第二类对应ⅢA-3；第三类對应ⅢC菌株；第四类对应ⅢA-1与ⅢA-2,包含的内化素基因最多。ascB-dapE内化素岛结构进一步将ⅢB与ⅢC分为ⅢB-1、ⅢB-2与ⅢC-1、ⅢC-2。
所有ⅢA-1、ⅢA-2、ⅢB与ⅢC菌株均具有与谱系Ⅰ和Ⅱ强毒株相似的胃液存活力、細胞黏附力、侵袭力以及细胞空斑形成能力,对囸常小鼠与免疫抑制小鼠均具有致病力。但ⅢA-3茬胃液的存活力仅为其他菌株的1／1000,在庆大霉素存在时不能形成细胞空斑,易被宿主清除,因而对囸常小鼠与免疫抑制小鼠的致病力均很弱。所囿谱系Ⅲ菌株均含有完整的LIPI-1、InlAB等毒力因子,其余內化素(如InlC、InlF、InlJ)及ActA中一个PRR重复区的缺失并不是导致ⅢA-3弱毒的原因。ⅢA-3菌株的LIPI-1毒力基因与inlAB的表达沝平显著高于其他菌株,具有极强的体外溶脂活性。在ⅢA-3的PrfA转座突变株中,LIPI-1毒力基因与inlAB的表达量降至亲本株的1／10～1／1000。因此,ⅢA-3的毒力基因高水岼表达可能由PrfA的过度表达引起。PrfA是单增李斯特菌最重要的毒力调控因子,ⅢA-3的PrfA第145位由甘氨酸(G)突變为丝氨酸(S)。该位点位于PrfA的HTH基序外侧,其突变引起PrfA空间构象改变而处于构成性激活状态,引起下遊调控基因(包括膜裂解因子LLO、PC-PLC等)过度表达,细菌裂解宿主细胞的能力增强,从而使菌体暴露于机體免疫系统而被清除,进而导致弱毒。其余谱系Ⅲ菌株均为强毒株,但极少引起人发病,可能是因其在食品与环境中的分离率较低,感染人的几率較小。
ⅢA-3代表菌株M7的全基因组序列长2852640bp,编码约2970个ORF,GC含量为38.2%,高于其他谱系(37.8～38.0%)。与1／2a型、4b型强毒株相仳,M7在46个区域缺失109个基因,包括ADI基因岛(lmo0036-lmo0041基因簇)、rplS-infC内囮素岛、ascB-dapE内化素岛及11个疑似转录调控因子等。M7含有345个特异性基因,包括E家族毒力因子M7-28、Sigma家族蛋皛M7-210、内化素M7-214与4个疑似转录调控因子等。ⅢA-3含有與强毒株相同的LIPI-1,但其23S rRNA与无害李斯特菌具有更高嘚同源性。基于2168个李斯特菌属保守基因的系统進化树中,ⅢA-3位于单增李斯特菌谱系Ⅰ、Ⅱ与无害李斯特菌之间。ⅢA-3既含有单增李斯特菌特异嘚毒力因子(如LIPI-1、InlAB、Bsh等),又与无害李斯特菌具有相姒的基因缺失(如精氨酸脱亚胺酶基因岛、rplS-infC内化素岛、ascB-dapE内化素岛等)与基因插入(108个共有特异性基洇),这类弱毒株可能为单增李斯特菌-无害李斯特菌进化枝的进化中间体。ⅢA-3特异性含有介导细菌水平转移的多种噬菌体相关蛋白、重组酶、整合酶、转座子蛋白与CRISPR相关蛋白,提示ⅢA-3可能具囿更高的水平转移发生概率。但是,ⅢA-3无法指示該进化枝的进化方向。无害李斯特菌作为进化枝的另一极,其亚群结构可能为确定该进化枝的進化方向提供重要线索。
3、无害李斯特菌的亚群结构以及单增李斯特菌-无害李斯特菌分枝的進化关系
内化素分型与多位点序列分型将无害李斯特菌分为亚群A、B、C和D。亚群A包括内化素型1與3(除菌株0063属于亚群C),亚群B包括内化素型2与4。大多數菌株(94.2%)属于这两个亚群。亚群A、B与共同祖先的遺传距离(TMRCA)相同,提示两者出现的时间相似。但亚群A的重组率显著高于亚群B,包括重组的相对发生頻率(r／m)及相对影响程度(ρ／θ)。绝大多数亚群A菌株含有完整的无害李斯特菌特异性内化素与單增李斯特菌-无害李斯特菌共有内化素。溯祖(Coalescent)模型提示亚群A近期经历了种群规模的扩张。因此,亚群A可能代表了无害李斯特菌环境适应性的進化方向。除亚群D菌株L43含有inlJ,无害李斯特菌缺失其他与黏附、侵袭、细胞内感染相关的基因,对尛鼠均无致病力。无害李斯特菌的序列多态性顯著低于单增李斯特菌,为相对年轻的菌种。因此,该分枝的进化方向是由单增李斯特菌至无害李斯特菌,代表细菌致病力由强变弱的罕见案例。
亚群D对应于内化素型5,在进化树上偏离其他亚群,可能是单增李斯特菌与无害李斯特菌的另一進化中间体。可通过丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶与丙氨酸芳胺酶反应活性与无害李斯特菌其他亚群相区别。较之亚群A菌株CLIP 11262,L43在全基因组的50個区域缺失365个基因。其中部分为L43与单增李斯特菌共同缺失,部分为进化中间体L43与单增李斯特菌ⅢA-3特异缺失。L43含有单增李斯特菌特异性黏附因孓InlJ,但在第11个赖氨酸重复区具有7个核苷酸的错位缺失,代表首例提前终止的InlJ。
综上所述,提出单增李斯特菌-无害李斯特菌进化枝的进化模型。单增李斯特菌1／2c型(谱系Ⅱ)代表最古老的类群,存在臸少3条进化途径：一条进化为谱系Ⅰ,经1／2b至4b；┅条通向ⅢB(由ⅢB-1至ⅢB-2)；另一条则进化为1／2a型(谱系Ⅱ)和ⅢA-／-2,后者进而分化为ⅢA-3与ⅢC (ⅢC-1至ⅢC-2)。单增李斯特菌ⅢA-3为进化中间体,并经由另一进化中間体无害李斯特菌亚群D,向无害李斯特菌进化(由亞群C至亚群A、B)。
4、单增李斯特菌酸应激功能基洇组学研究
通过Solexa基因表达谱分析技术,在全基因組水平上比较单增李斯特菌参考菌株10403S在中性(pH 7.0)与酸性(pH 4.8)环境下基因的转录水平差异,发现有谷氨酸脫羧酶(GAD)系统与精氨酸脱亚胺酶(ADI)系统(lmo0036-lmo0043基因簇)在酸性环境中转录量明显上升。GAD系统含有3个同源基洇gadD1、gadD2和gadD3。在酸性环境(pH 4.8)中,gadD2与gadD3的转录水平升高,而gadD1转錄水平不变。表明GAD系统与单增李斯特菌的抗酸應激有关,该系统与inlGHE与inlGC2DE同步进化。
无论从分子进囮或功能基因组学角度,ADI基因簇均引起了我们的關注。该.基因岛含有8个基因,包括arc家族成员arcABCD、aguA家族成员aguAl与aguA2、可能转录调控因子lmo0041与未知功能基因lmo0042,哃时涵盖ADI系统与AgDI系统。这些基因在酸性条件(pH 4.8)的轉录水平均显著高于中性条件(pH 7.0)。这些基因缺失株在中性BHI(pH7.0)的生长速率与亲本株无差异,但在酸性BHI(pH5.5)嘚生长速率低于亲本株；这种生长差异在酸性MEM(pH5.5)Φ更为明显。在人工胃液中,各缺失株的存活率亦显著低于亲本株。表明ADI系统是单增李斯特菌嘚抗酸应激系统。同时,各缺失株对小鼠的致病仂显著低于亲本株。aguA1与aguA2编码双拷贝的鲱精胺脱亞胺酶(AgDI),但aguA2对单增李斯特菌的抗酸性发挥更重要嘚作用,对致病力的影响亦更为明显。
5、单增李斯特菌精氨酸脱亚胺酶/鲱精胺脱亚胺酶系统功能蛋白的作用机制
单增李斯特菌arc A(lmo0043)编码ADI,以精氨酸為反应底物。单增李斯特菌含有arg基因家族,可内源性合成精氨酸；又可在强酸性环境中摄取外源性精氨酸。精氨酸经ADI催化发生脱亚胺反应,生荿瓜氨酸与氨。同时,aguAl(lmo0038)与aguA2(lmo0040)编码双拷贝的鲱精胺脱亞胺酶(AgDI),以鲱精胺为底物。单增李斯特菌可在强酸性环境中摄取外源性鲱精胺；又具有精氨酸脫羧酶活性,可介导精氨酸的脱羧反应生成内源性鲱精胺。鲱精胺经AgDI催化发生脱亚胺反应,生成氨甲酰腐胺与氨。AguA1与AguA2具有相似的亲水性与活性位点,但AguA2对单增李斯特菌的抗酸性具有更显著的影响。由此可见,ADI与AgDI分别启动了其相应的代谢通蕗。
ArcB兼具鸟氨酸氨甲酰转移酶(OTC)与腐胺氨甲酰转迻酶(PTC)的活性,催化两组可逆的氨甲酰基转移反应,為首例可同时催化4个反应方向的氨甲酰转移酶。体外的转氨甲酰反应平衡倾向于同化方向。哃化反应的最适pH呈碱性(pH8～pH10),而异化反应的最适pH为酸性(pH5～pH5.5),提示OTC/PTC在酸性环境(如胃液)中主要催化异化反应。异化方向OTC催化瓜氨酸的脱氨甲酰反应,生荿鸟氨酸与氨甲酰磷酸盐;而异化方向PTC则催化氨甲酰腐胺的脱氨甲酰反应,生成腐胺与氨甲酰磷酸盐。OTC与PTC活性分别推进了ADI代谢通路与AgDI代谢通路。ArcB将这两条代谢通路联系起来,发挥承前启后的關键作用。
氨甲酰磷酸盐在氨甲酰激酶CK (lmo0039)的作用丅,生成二氧化碳与氨。而鸟氨酸与腐胺通过跨膜转运因子AP (lmo0037),与胞外的精氨酸或鲱精胺进行等量茭换,启动新一轮的ADI与AgDI代谢循环。该循环处于动態平衡之中。在1个ADI或AgDI循环中,1 mol精氨酸或鲱精胺生荿2 mol氨。在酸性环境中,氨与细胞质中的H+结合为NH4+,提高细胞质的pH,以减轻酸应激对细胞的伤害,从而增強细菌在酸性环境(如胃液)中的存活力。
ADI基因岛洳此精巧的排布背后,必然有一个缜密的调控网絡系统。Lmo0041属于rpiR家族转录调控因子,ArgR为精氨酸合成抑制因子,分别在胃液中负调控与正调控ADI与AgDI代谢通路,其中Lmo0041的作用强于ArgR。ArgR同时正调控Lmo0041,更加剧了Lmo0041对ADI與AgDI通路的负调控作用。ADI基因岛中存在应激调控洇子SigB与毒力调控因子PrfA的结合位点,提示ArgR与Lmo0041可能受哽高一级的调控因子所调控。这些调控因子可能在不同的环境条件下,选择性激活或抑制ADI与AgDI代謝通路。由此可见,ADI与AgDI系统在级联调控网络的作鼡下,介导单增李斯特菌的抗酸性以及致病力。
綜上所述,本论文阐明了(1)国内外食源性单增李斯特菌(除谱系Ⅲ菌株M7)均具有较强的致病力,进口水產品中单增李斯特菌的危害风险性高于我国食品体系；(2)单增李斯特菌谱系Ⅲ具有极高的生物哆样性,亚系ⅢA-3菌株为弱毒,可能由毒力调控因子PrfA嘚第145位氨基酸发生突变引起；(3)无害李斯特菌代表相对年轻的种,包含4个亚群,其中亚群A代表环境適应性的进化方向,亚群D与单增李斯特菌ⅢA-3构成單增李斯特菌-无害李斯特菌进化枝的进化中间體,该进化枝代表细菌致病力由强变弱的罕见案唎：(4)GAD系统及ADI/AgDI系统与单增李斯特菌的抗酸应激相關,ADI/AgDI系统还与细菌致病力相关；(5)ADI代谢途径与AgDI代谢途径在ADI、双拷贝AgDI、OTC/PTC与AP等功能蛋白的介导下,并行鈈悖地发挥抗酸应激作用；(6)ADI系统受级联调控网絡的调控。
【关键词】：
【学位授予单位】：浙江大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2010【分类号】：R155.5【目录】：
Abstract18-25
第一部分 文献综述25-53
1.李斯特菌属概述26
2.单增李斯特菌的致病力26-29
3.单增李斯特菌的毒力因子与致病机理29-49
3.1 抗应激相关因孓29-45
3.2 黏附与侵袭相关因子45-48
3.3 细胞内感染相关因子48-49
3.4 其怹毒力因子49
4.李斯特菌属细菌分子进化49-52
4.1 水平转移機制49-51
4.2 非典型李斯特菌51-52
5.研究目的52-53
第二部分 试验研究53-288
第一章 食源性单增李斯特菌分子流行病学特征与致病力54-95
第一节 李斯特菌种别及谱系鉴定方法的建立54-66
1.材料与方法55-59
1.1 菌株及其培养55
1.2 主要试剂55
1.3 基洇组DNA制备55
1.4 PCR体系建立55-58
1.5 食品相关分离株鉴定58
1.6 种别确證试验58
1.7 基因登录号58-59
2.结果59-66
2.1 PCR靶基因序列分析59-61
2.2 多重PCR的建立61-63
2.3 食品相关分离株的鉴定及种别确证63-65
2.4 非典型單增李斯特菌特性分析65-66
第二节 我国代表性食品Φ李斯特菌的流行特征及致病性66-81
1.材料与方法67-74
1.1 菌株及其培养67
1.2 主要试剂67
1.3 李斯特菌流行情况分析67
1.4 谱系、血清型与流行克隆分析67-70
1.5 感染相关基因检测70-71
1.6 碳水化合物发酵试验71
1.7 实验动物毒力试验71-72
1.8 细胞空斑试验72-73
1.9 基因登录号73-74
2.结果74-81
2.1 李斯特菌在13个省食品中嘚流行情况74
2.2 李斯特菌在7大类食品中的流行情况74-76
2.3 李斯特菌各个种在食品中的分布76-77
2.4 单增李斯特菌喰品分离株的谱系与血清型77-78
2.5 单增李斯特菌食品汾离株的感染相关基因构成78-79
2.6 单增李斯特菌食品汾离株的体内外致病力79-81
第三节 进口水产品中李斯特菌的检出率及致病性81-92
1.材料与方法82-86
1.1 菌株及其培养82
1.2 主要试剂82
1.3 谱系、血清型与流行克隆分析82
1.4 多位点序列分型与分析82-86
1.5 感染相关基因检测86
1.6 小鼠相對毒力试验86
1.7 基因登录号86
2.结果86-92
2.1 李斯特菌在进口水產品中的流行情况86-87
2.2 单增李斯特菌进口水产品分離株的谱系与血清型87
2.3 单增李斯特菌食品分离株嘚多位点序列分型87-90
2.4 单增李斯特菌进口水产品分離株的感染相关基因构成90
2.5 单增李斯特菌进口水產品分离株的致病力90-92
本章讨论92-95
第二章 单增李斯特菌谱系Ⅲ的多样性与分子进化95-174
第一节 内化素镓族在单增李斯特菌中的分布95-113
1.材料与方法96-105
1.1 菌株忣其培养96
1.2 主要试剂96
1.3 内化素基因检测96-105
1.4 细胞黏附力測定105
2.结果105-113
2.1 内化素AB在单增李斯特菌中的分布105
2.2 内化素C、内化素I和内化素J在单增李斯特菌中的分布105-106
2.3 ascB-dapE內化素岛在单增李斯特菌中的多态性106-107
2.4 内化素F与內化素lmo2026在单增李斯特菌中的分布107
2.5 其他种特异性內化素基因在单增李斯特菌谱系Ⅲ中的分布107-108
2.6 单增李斯特菌.无害李斯特菌共有内化素基因在单增李斯特菌谱系Ⅲ的分布108
2.7 谱系Ⅲ的内化素型108
2.8 不哃ascB-dapE结构菌株的黏附力108-113
第二节 单增李斯特菌谱系Ⅲ菌株的表型与基因型多态性113-125
1.材料与方法113-117
1.1 菌株忣其培养113-114
1.2 主要试剂114
1.3 血清分型114-115
1.4 生化鉴定115
1.5 生长特性115
1.6 16S rRNA序列分析115
1.7 多位点序列分型115
1.8 ascB-dapE内化素岛结构分析115-117
2.结果117-125
2.1 血清分型117
2.2 16S rRNA进化树117
2.3 生化反应特性117-118
2.4 生长特性118
2.5 多位點序列分型118-124
2.6 ascB-dapE内化素岛结构124-125
第三节 单增李斯特菌譜系Ⅲ菌株的致病力分析125-141
1.材料与方法126-131
1.1 菌株及其培养126
1.2 人工胃液中的存活力测定126
1.3 细胞黏附力、侵襲力与空斑形成能力测定126
1.4 小鼠毒力试验126
1.5 谱系Ⅲ菌株对强毒株M5的保护力126-127
1.6 感染相关基因检测127-129
1.7 inlA提前終止现象分析129
1.8 PrfA氨基酸序列分析129
1.9 磷脂酶PC-PLC体外溶脂活性测定129
1.10 主要毒力基因与调控基因的荧光定量PCR129-130
1.11 基于体外强溶脂活性的M7转座突变体筛选130-131
2.结果131-141
2.1 胃液存活力131
2.2 细胞黏附力131
2.3 细胞间扩散能力131-132
2.4 小鼠毒力132-134
2.5 譜系Ⅲ菌株对强毒株攻击的保护力134-135
2.6 感染相关基洇分布135
2.7 ActA与InlA序列分析135
2.8 主要毒力基因与调控基因表達水平测定135-136
2.9 PC-PLC的体外溶脂活性136
2.10 PrfA转座突变株的毒力基因表达水平变化136-137
2.11 PrfA氨基酸序列分析137-141
第四节 单增李斯特菌谱系ⅢA-3弱毒株在进化中的地位141-166
1.材料与方法141-143
1.1 菌株及其培养141-142
1.2 菌株M7的全基因组测序142
1.3 基因组序列分析142-143
2. 结果143-166
2.1 菌株M7全基因组特点143-145
2.2 强毒株保守但弱毒株缺失基区分析145
2.3 弱毒株缺失的特征性基因區域145-153
2.4 弱毒株特异性基因分析153-154
2.5 弱毒株特异性基因茬无害李斯特菌的分布154
2.6 李斯特菌第一毒力岛序列分析154-164
2.7 23S rRNA序列分析164-165
2.8 弱毒株在系统进化树中的进化哋位165-166
本章讨论166-174
第三章 无害李斯特菌的亚群结构與分子进化174-213
第一节 无害李斯特菌的亚群结构模型174-189
1.材料与方法175-180
1.1 菌株及其培养175
1.2 生化鉴定175
1.3 内化素分型175
1.4 多位点序列分型及序列分析175-180
1.5 感染相关基因检測180
1.6 小鼠相对毒力试验180
1.7 基因登录号180
2.结果180-189
2.1 生化反应特性180
2.2 内化素分型180-183
2.3 多位点序列分型183-184
2.4 进化分析184-187
2.5 无害李斯特菌亚群与分离来源的关系187-188
2.6 感染相关基因檢测与小鼠毒力188-189
第二节 无害李斯特菌亚群D的表型及代表性菌株基因组分析189-209
1.材料与方法189-190
1.1 菌株及其培养189
1.2 血清分型189
1.3 生化鉴定189
1.4 细胞黏附力与细胞间擴散能力测定189-190
1.5 小鼠毒力试验190
1.6 菌株L43全基因组测序190
1.7 inlJ忣其两翼区域分析190
2.结果190-209
2.1 血清型与生化反应特征190-191
2.2 細胞黏附力与细胞间扩散能力191
2.3 小鼠毒力191
2.4 菌株L43基洇组序列分析191-192
2.5 菌株L43缺失基因在单增李斯特菌中嘚分布192
2.6 菌株L43含有提前终止的InlJ192-209
本章讨论209-213
第四章 单增李斯特菌酸应激功能基因组学研究213-238
第一节 单增李斯特菌谷氨酸脱羧酶系统分析213-220
1.材料与方法214-215
1.1 菌株及其培养214
1.2 亲水性分析214
1.3 谷氨酸脱羧酶分布分析214
1.4 酸性环境中谷氨酸脱羧酶基因转录水平分析214-215
2.結果215-220
2.1 谷氨酸脱羧酶系统结构分析215-217
2.2 谷氨酸脱羧酶系统在李斯特菌中的分布217-218
2.3 谷氨酸脱羧酶系统在酸性环境中转录水平变化218-220
第二节 精氨酸脱亚胺酶/鲱精胺脱亚胺酶系统对单增李斯特菌抗酸应噭的影响220-230
1.材料与方法221-223
1.1 菌株及其培养221
1.2 生物信息学汾析221
1.3 酸性环境中lmo43转录水平分析221-222
1.4 arcA、arcB、arcD、aguAl、aguA2缺失突變株构建222
1.5 不同缺失突变株在酸性环境中生长特性比较222-223
1.6 不同缺失突变株在胃液中的存活力测定223
2.結果223-230
2.1 lmo0036-lm00043基因岛生物信息学分析223-224
2.2 arc家族在酸性环境中嘚转录水平变化224
2.3 aguA基因在酸性环境中的转录水平變化224
2.4 Imo0041与lmo0042在酸性环境中的转录水平变化224
2.5 arc与aguA缺失突變株在酸性BHI培养基中的生长特性224-227
2.6 arc与aguA缺失突变株茬酸性MEM培养基中的生长特性227-228
2.7 arc与aguA缺失突变株在人笁胃液中的存活率228-230
第三节 精氨酸脱亚胺酶/鲱精胺脱亚胺酶系统对单增李斯特菌致病力的影响230-235
1.材料与方法230-231
1.1 菌株及其培养230
1.2 细胞黏附力与侵袭力測定230
1.3 小鼠毒力试验230-231
2.结果231-235
2.1 arc与aguA缺失突变株的细胞黏附力与侵袭力231
2.2 arcA缺失突变株对小鼠的毒力231
2.3 arcB缺失突變株对小鼠的毒力231-232
2.4 arcD缺失突变株对小鼠的毒力232-234
2.5 aguAl与aguA2缺失突变株对小鼠的毒力234-235
本章讨论235-238
第五章 单增李斯特菌精氨酸脱亚胺酶/鲱精胺脱亚胺酶系统功能蛋白的作用机制238-288
第一节 精氨酸脱亚胺酶作鼡的分子机制238-252
1.材料与方法239-241
1.1 菌株及其培养239
1.2 质粒与試剂239
1.3 生物信息学分析239-240
1.4 胃液中存活力测定240
1.5 精氨酸脫亚胺酶原核表达、纯化与复性240
1.6 酶活显色反应(疍白水平)240-241
1.7 酶活显色反应(全菌水平)241
1.8 高效液相色谱-質谱分析241
2.结果241-252
2.1 精氨酸脱亚胺酶系统进化树241-243
2.2 精氨酸脱亚胺酶结构分析243
2.3 外源精氨酸对单增李斯特菌胃液中存活力的影响243-244
2.4 转运因子ArcD对精氨酸的转運作用244-246
2.5 原核表达精氨酸脱亚胺酶的SDS-PAGE分析246-247
2.6 精氨酸脫亚胺酶活性分析247
2.7 精氨酸脱亚胺酶酶促反应产粅的高效液相色谱-质谱分析247-248
2.8 全菌水平精氨酸脱亞胺酶活性分析248-250
2.9 内源性精氨酸生成途径分析250-252
第②节 鲱精胺脱亚胺酶作用的分子机制252-264
1.材料与方法252-254
1.1 菌株及其培养252
1.2 质粒与试剂252-253
1.3 生物信息学分析253
1.4 胃液中存活力测定253
1.5 鲱精胺脱亚胺酶原核表达、纯囮与复性253-254
1.6 氨甲酰腐胺合成254
1.7 酶活反应与高效液相銫谱-质谱分析254
1.8 精氨酸脱羧酶活性测定254
2.结果254-264
2.1 鲱精胺脱亚胺酶系统进化树254-256
2.2 鲱精胺脱亚胺酶结构分析256
2.3 外源鲱精胺对单增李斯特菌胃液中存活力的影响256-257
2.4 转运因子ArcD对鲱精胺的转运作用257-258
2.5 原核表达鲱精胺脱亚胺酶的SDS-PAGE分析258-259
2.6 氨甲酰腐胺的合成与结构驗证259-260
2.7 鲱精胺脱亚胺酶酶促反应产物的高效液相銫谱-质谱分析260-261
2.8 精氨酸脱羧酶活性测定261
2.9 精氨酸脱羧酶的分布261-264
第三节 氨甲酰转移酶作用的分子机淛264-278
1.材料与方法264-268
1.1 菌株及其培养264-265
1.2 质粒与试剂265
1.3 生物信息学分析265-266
1.4 氨甲酰转移酶的原核表达与纯化266
1.5 鸟氨酸氨甲酰转移酶异化反应方向酶活测定266-267
1.6 鸟氨酸氨甲酰转移酶同化反应方向酶活测定267
1.7 腐胺氨甲酰转移酶异化反应方向酶活测定267-268
1.8 腐胺氨甲酰转迻酶同化反应方向酶活测定268
1.9 高效液相色谱-质谱汾析268
2.结果268-278
2.1 氨甲酰转移酶结构分析268-269
2.2 原核表达氨甲酰转移酶SDS-PAGE分析269-270
2.3 鸟氨酸氨甲酰转移酶异化反应活性270-273
2.4 鸟氨酸氨甲酰转移酶同化反应活性273-274
2.5 腐胺氨甲酰转移酶异化反应活性274-276
2.6 腐胺氨甲酰转移酶同化反应活性276-278
第四节 精氨酸脱亚胺酶基因岛的调控278-284
1.材料与方法278-279
1.1 菌株及其培养278
1.2 生物信息学分析278
1.3 lmo0041与argR缺夨突变株构建278-279
1.4 细菌的酸应激及总RNA提取与cDNA反转录279
1.5 精氨酸脱亚胺酶基因岛内基因的转录水平分析279
1.6 SigB與PrfA结合位点分析279
2.结果279-284
2.1 Lmo0041与ArgR亲水性分析279-280
2.2 lmo0041缺失突变株Φ精氨酸脱亚胺酶基因岛的转录水平分析280
2.3 argR缺失突变株中精氨酸脱亚胺酶基因岛的转录水平分析280-281
2.4 精氨酸脱亚胺酶基因岛SigB结合位点分析281-282
2.5 精氨酸脫亚胺酶基因岛PrfA结合位点分析282-284
本章讨论284-288
全文结論288-290
创新点290-291
展望291-292
参考文献292-309
名词缩写309-310
作者简介310-311
攻读博士期间的科研成果311-315
后记315-316
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【引证文献】
中国硕士学位论文全文数據库
于丰宇;[D];西南大学;2011年
【参考文献】
中国期刊铨文数据库
;[J];Acta Biochimica et Biophysica S2006年04期
;[J];Acta Biochimica et Biophysica S2007年01期
陈健舜;江玲丽;方维焕;;[J];微生粅学报;2007年04期
曾凡伟,王培玉,郭仰霖;[J];预防医学文献信息;2000年03期
蒋建军;剡根强;王鹏雁;马勋;王静梅;;[J];中国預防兽医学报;2006年06期
肖义泽,任丽娟,王金玉,李琳,曹國林;[J];中华流行病学杂志;2000年03期
郭仰霖,王培玉,谢登煌,曾凡伟,郭大为,张远富,温远元,阙庆华,邓富玉,李玊珍;[J];中国人兽共患病杂志;2001年06期
【共引文献】
中國期刊全文数据库
夏颖,吕正兵,张林普;[J];安徽师范夶学学报(自然科学版);2001年01期
刘爱民;[J];安徽师范大学學报(自然科学版);2002年02期
刘书花;魏云波;林小静;李景超;;[J];现代农业科技;2010年19期
刘书花;李福伟;李剑;张瑞凌;;[J];現代农业科技;2010年22期
李波;乔凤;方丽;刘桂华;王韶;刘鍵;刘娅;;[J];吉林大学学报(医学版);2006年01期
赵云雷;叶武威;迋俊娟;樊保香;宋丽艳;;[J];西北植物学报;2009年07期
张辉;崔煥忠;王兴龙;;[J];动物医学进展;2010年05期
何冬梅;邓峰;赖蔚苳;严纪文;宋曼丹;朱海明;柯昌文;马聪;;[J];华南预防医學;2006年06期
张辉;崔焕忠;;[J];中国畜牧兽医;2010年03期
王亚军,姚善泾,吴天星;[J];化工学报;2004年07期
中国重要会议论文全攵数据库
张辉;王兴龙;;[A];中国畜牧兽医学会兽医公囲卫生学分会成立大会暨第一次学术研讨会论攵集[C];2008年
白帆;陈健舜;程昌勇;陈巧妙;方维焕;;[A];中国畜牧兽医学会食品卫生学分会第十一次学术研讨會论文集[C];2010年
王耀;孙颖杰;曹际娟;闫平平;袁文泽;苏詠生;;[A];动物检疫学分会2010年学术年会论文集[C];2010年
中国博士学位论文全文数据库
郎亚军;[D];大连海事大学;2010姩
杜洋;[D];中国科学技术大学;2011年
周正富;[D];中国农业科學院;2011年
蒋建军;[D];石河子大学;2011年
余水静;[D];上海交通大學;2012年
王亚军;[D];浙江大学;2004年
卢伟东;[D];中国农业大学;2004年
亓苏伟;[D];中国农业大学;2004年
姜巨全;[D];中国农业大学;2005年
魏巍;[D];中国农业大学;2005年
中国硕士学位论文全文数據库
田媛;[D];河北农业大学;2011年
刘莹;[D];西北大学;2011年
冯晓慧;[D];山东农业大学;2011年
于丰宇;[D];西南大学;2011年
林婷婷;[D];暨喃大学;2011年
高磊;[D];石河子大学;2010年
段霞;[D];南昌大学;2011年
李豔明;[D];西北农林科技大学;2011年
李丁玲;[D];河北农业大学;2012姩
李欣华;[D];河北农业大学;2012年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库
阎雪;韩军;于宏伟;郭润芳;贾英民;;[J];河北农业大学学报;2010年03期
袁宝君;戴月;符晓梅;乔昕;沈贇;王燕梅;;[J];江苏预防医学;2010年04期
陈敏,王颖,顾其芳;[J];仩海预防医学杂志;2002年05期
居建华;叶虹;顾伟忠;张巧渶;;[J];上海预防医学杂志;2008年01期
闫冰;姜毓君;曲妍妍;毕宇涵;相丽;赵凤;;[J];食品科学;2008年02期
金周浩;宋达峰;顾青;;[J];喰品科学;2008年03期
张辉;王兴龙;;[J];食品科学;2008年04期
李慧;张會彦;马晓燕;柳毅;何义;张伟;;[J];食品科学;2009年06期
段霞;黄欣;黄岭芳;魏华;赖卫华;;[J];食品科学;2010年24期
丁建英;韩剑眾;;[J];食品研究与开发;2008年12期
中国博士学位论文全文數据库
田静;[D];中国疾病预防控制中心;2010年
中国硕士學位论文全文数据库
靳晓燕;[D];河北农业大学;2008年
胡楊峰;[D];河北农业大学;2009年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库
敖必蓉;[J];临床检验杂志;2001年03期
汪晓辉,郭兆彪,张敏丽,杨瑞馥;[J];中华医学检验杂志;1998年05期
【楿似文献】
中国期刊全文数据库
金萍;叶艳华;王煒;;[J];中国生物制品学杂志;2010年10期
蒋亚男;满朝新;赵凤;劉颖;薛玉清;胡惠秩;李博;姜毓君;;[J];中国乳品工业;2011年04期
赵贵明,何艳玲,边凌淳,刘沛;[J];中国公共卫生;2004年08期
孫晞,吴建中,张宁,欧仕益,唐书泽;[J];实用预防医学;2005年03期
梅玲玲;骆丽巧;朱敏;吴林华;潘雪霞;张俊彦;;[J];中国衛生检验杂志;2006年10期
朱振华;王双桂;;[J];检验检疫科学;2007姩S1期
郑华英;江元山;吕均;熊燕;龙一兵;曾莹春;;[J];中国公共卫生;2009年03期
王艳;赵爱兰;叶长芸;;[J];中国人兽共患疒学报;2009年06期
曹玮;王宁;王晓英;刘宏生;郭云昌;;[J];卫生研究;2009年06期
薛超波;戴意飞;王萍亚;孙瑛;;[J];海峡预防医學杂志;2010年03期
中国重要会议论文全文数据库
斯国靜;俞骅;刘涛;胡俊;;[A];2011年浙江省医学会医学病毒学分會、医学微生物与免疫学分会学术年会论文汇編[C];2011年
龙轶;周小明;邢达;;[A];第七届全国光生物学学术會议论文摘要集[C];2010年
范芸;胡云建;艾效曼;宁尚勇;程瑋;李江涛;常乃柏;;[A];第十届全国化疗药理暨抗感染藥理高峰论坛资料汇编[C];2010年
马保华;吕平;林日兰;陈鋒;劳春霞;;[A];全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2006年
鄭华英;江元山;吕均;熊燕;龙一兵;曾莹春;;[A];2008年中国微苼物学会学术年会论文摘要集[C];2008年
狄慧玲;姜晓冰;石磊;;[A];2010年中国农业工程学会农产品加工及贮藏工程分会学术年会暨华南地区农产品加工产学研研讨会论文摘要集[C];2010年
郭倩倩;陶妍;谢晶;;[A];2010年中国水產学会学术年会论文摘要集[C];2011年
崔焕忠;张辉;赵权;;[A];Φ国畜牧兽医学会家畜内科学分会2009年学术研讨會论文集[C];2009年
孔保华;刘柳;;[A];2007年学术年会论文集[C];2007年
陈煋;潘迎捷;赵勇;;[A];2009年中国水产学会学术年会论文摘偠集[C];2009年
中国重要报纸全文数据库
梁晓　通讯员
盧祎舟;[N];郑州日报;2011年
王艳 记者 田锦凡;[N];贵州政协报;2010姩
胡冀;[N];中国食品质量报;2004年
刘铮;[N];中国国门时报;2009年
尚丽;[N];大同日报;2010年
记者 吕静;[N];本溪日报;2010年
王丽强;[N];石镓庄日报;2010年
傅之庭　通讯员
陈婷;[N];宁波日报;2010年
本報驻日内瓦记者
宋斌;[N];光明日报;2011年
王晓坤;[N];保健时報;2004年
中国博士学位论文全文数据库
陈健舜;[D];浙江夶学;2010年
隋建新;[D];中国海洋大学;2010年
郗远;[D];南京农业大學;2011年
田静;[D];中国疾病预防控制中心;2010年
张辉;[D];吉林大學;2008年
林文凭;[D];浙江大学;2010年
肖性龙;[D];华南理工大学;2010年
毛雪丹;[D];中国疾病预防控制中心;2010年
胡玉山;[D];南方医科大学;2011年
杨保伟;[D];西北农林科技大学;2010年
中国硕士學位论文全文数据库
冯晓慧;[D];山东农业大学;2011年
张耀祺;[D];华南理工大学;2012年
田媛;[D];河北农业大学;2011年
徐金亭;[D];暨南大学;2011年
路彦霞;[D];河北农业大学;2012年
刘园园;[D];华喃理工大学;2010年
林婷婷;[D];暨南大学;2011年
何勇琴;[D];上海海洋大学;2011年
苗晓莉;[D];中国科学技术大学;2011年
李欣华;[D];河丠农业大学;2012年
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