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时间：2012-05-18 12:40
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免疫组化结果如何分析？
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（1）阳性着色细胞计数法。在40*光镜下，随机选择不重叠的10个视野，人工或机器计数阳性着色细胞，每组3~6张不同动物组织切片，然后进行组 间比较即可。
（2）灰密度分析法。通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用image j进行灰密度分析，然后进行统计分析即可。
（3）评分法。通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度（0~3分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色）、阳性范围进行评分（1~4分为 0~25%、26~50%、51~75%、76~100%），最终可以分数相加，再进行比较。
对于以上这几种方法，各有利弊，请细心选择。要想得到正确结果的前提是你要做出着色均匀、背景很浅的高质量切片。
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病理免疫组化染色方法质量控制应注意的问题免​疫​组​化​可​以​辅​助​病​理​诊​断​、​指​导​治​疗​、​评​估​预​后​,​所​以​在​做​免​疫​组​化​过​程​中​的​质​控​问​题​处​理​尤​其​重​要​。​随​着​免​疫​组​化​试​剂​新​种​类​不​断​出​现​及​方​法​的​改​进​,​特​别​是​即​用​型​试​剂​盒​的​出​现​,​使​抗​体​的​标​记​更​加​简​便​、​快​捷​,​更​加​规​范​化​。​免​疫​组​化​标​准​化​染​色​技​术​是​一​项​实​验​性​很​强​的​技​术​,​任​何​一​个​环​节​出​现​问​题​,​都​可​以​直​接​影​响​免​疫​组​化​结​果​。​因​此​,​本​文​就​免​疫​组​化​标​准​化​染​色​质​量​的​应​注​意​的​问​题​报​告
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请教一个问题：免疫组化图像最好如何分析，用哪个软件好？可否帮我弄个免费的软件?
城市：上海
本人在做免疫组化实验，已做的差不多了，想请教大家如何来分析对比各组的图像，要用哪个图像软件呢，网上可以下载免费的吗？谢谢了，
城市：上海
推荐一文，供参考。全自动显微镜及图像分析系统处理免疫组化图像
引言随着免疫组织化学技术的不断成熟，免疫组化技术已经成为当今生物医学中形态、功能、代谢、物质构成等综合研究的有力工具，在病理学、神经科学、发育生物学、细胞生物学和微生物、寄生虫、病毒等病原体的诊断和研究中具有巨大的实用价值。然而如何对免疫组化染色的结果进行准确的分析，且具有很高的重复性，尽量少的人为误差，一直是大家所关注但仍未能很好解决的问题[1]。本文利用新引进的全自动显微镜和图像采集分析系统对免疫组化结果进行了图像采集分析，结果比较令人满意。1 材料和方法1.1 临床资料本实验分为实验组和对照组。实验组包括30例肩袖撕裂的病人撕裂处单侧SAB，对照组为14 例非肩袖撕裂者的SAB。标本切取后立即经10%中性福尔马林固定，石腊包埋，切片厚度为3μm，进行常规免疫组织化学染色。1.2 免疫组化试剂小鼠抗人IL － 6 抗体（ Santacruz biotechnology，Inc. 博士德公司分装）工作浓度1：100，生物素化二抗，SABC 等均购自博士德公司，其他试剂均采用分析纯。1.3 仪器及软件系统一：数码像机（model Penguin 600CL ，Pixera Inc.，美国），Leica 全自动显微镜（model DMLA，Leica Inc.，德国），软件Simple PCI（v5.2，Compix Inc.，美国）；系统二：数码像机（model DC 200，Leica Inc. 德国，），Leica 手动显微镜（model DMLA，Leica Inc.，德国），软件Qwin（v2.3，Leica Inc.，德国）。1.4 图像采集分析方法根据Kraan 等[2]采用计算机图像分析系统分别对免疫组化染色切片SAB 中免疫组化染色进行计量分析。每次均在开机20 分钟后，分别用两套系统在40 倍物镜下采集图像。从每张切片中选取一有代表性区域，系统一以序列方式4×5 连续取20 个高倍视野（×400 倍），系统二手动连续取20 个高倍视野。分别对SAB 切片免疫组化染色胞浆中的阳性表达进行定量分析，计算每视野阳性染色的光密度（OD）值和积分光密度（iOD）值，并取20 个视野的积分光密度之和。1.5 统计学分析统计数据采用SPSS11.0 分析，结果用均数±标准差（ X ±s）表示，P2 结果2.1 免疫组化染色结果在实验组所有肩袖撕裂病人SAB 中，均可看到IL－6 阳性表达，微血管周围IL－6 表达更为突出。正常对照组病人SAB 中IL－6 阳性表达较少。由成像结果来看，白平衡的处理、成像质量、色彩还原度等方面，系统一明显优于系统二。2 . 2 数据分析结果实验组所有肩袖撕裂患者SAB 中，均可见IL－6阳性表达，实验组与对照组经SPSS 进行不齐方差t检验，OD 值与iOD 值均有显著差异，系统一与系统二均可得到相同结论解（见下表）。从结果中可知，OD 值比较虽可得出实验组和对照组的差异，但iOD值比较更为显著（表1 和表2）。表1 系统一所测IL-6 免疫组化染色结果（ X ±s）实验组n＝30 对照组n=14 P 值OD 1.8 1.3 = 0.006iOD(×103) 16.713±3.468 1.367±0.617 表2 系统二所测IL-6 免疫组化染色结果（ X ±s）实验组n＝30 对照组n=14 P 值OD 0.0 0.4 =0.019iOD(×103) 10.861±2.292 1.307±0.350 3 讨论免疫组织化学作为一种逐渐成熟起来的技术已渗透在临床和科研的各个方面，作为一种方法学，这门技术也在不断的需求中不断地发展和完善。如何对免疫组化进行标准化定量就是一个很关键性的问题。很多工作者在前期的染色方面做了大量的工作，采用多种手段，严格各项操作步骤，尽量保证每次实验条件相同等等，使得实验结果基本能达到要求，具有较高的可重复性。然而有了良好的染色切片不等于最终的结果，采取什么样的图像采集分析系统，如何进行标准化的图像采集分析，也是不容忽视的一步。本研究通过应用两套图像采集分析系统对IL－6 免疫组化染色切片采图并分析比较，探寻了一条新的标准化免疫组化结果分析之路。3.1 图像分析方法本研究采用Kraan 等[2]的图像分析方法，选取一有代表性区域，连续取20 张高倍视野而且分析过程利用统一的标准分割染色区域并加以计算，大大减少了人为的误差。尤其是应用系统一中SimplePCI 的序列功能，以竖4 张横5 张方式连续采集分辨率为 的图像20 张，建立分割标准，程序化分析每张切片，数据导出为excel 格式，输入SPSS 软件做检验，基本上完全自动化、标准化。操作过程中明显体现了系统一的优势，首先是方便快捷，节约了大量时间，其次是结果更加准确，显著减少了误差，而系统二需要每次调整，难以保证连续取片的不重叠、不分离。3.2 灰度、平均光密度与积分光密度以往的文献中，免疫组化结果取值不统一，有人采用最基本的灰度，有人采用了经过转换的平均光密度，也有些人采用了积分光密度。但是究竟哪种更好，最能真实反应结果，数据更具有通用性，却很少有人提及。灰度是我们用数字图像采集分析系统的基础，所有的结果即我们最终分析的阳性表达量的采集计算均为灰度，但是灰度是个无量纲的相对值，仅将光亮度表达为0 到255 级，入光量不同、采集系统不同时结果会不同，故灰度值的通用性和可比性较差。光密度是指在同一照明强度下，不同组织成份透过光线的数值，是由灰度值换算而来，可用来反映物质含量的绝对值。根据光吸收定律即朗伯－ 比尔定律， 公式为：A=Log[I0(x,y)/I(x,y)]=K(x,y)C(x,y) L(x,y)，式中A 为吸光度，I0 为出射光强度，I 为入射光强度，K 为吸光系数，C 为被测物浓度，L 为被测物厚度， (x,y)为像素点位置。但是灰度与光密度转换不是一个简单的函数关系，而是需要每次采用光密度板校正，并利用软件拟合曲线，才能得到准确的绝对光密度值。在未作特别说明的时候光密度即指平均光密度，为整个视野中每一点的光密度的叠加除以点数的总和，即OD＝？ A / N ，其中N 为点数的总和。而积分光密度的定义是整个视野内每一点光密度的叠加[3]。由此即可看出后者将面积因素考虑在内才能准确反映物质含量。简单来说，阳性表达物质量基本相同的两张切片，一张单位面积上的阳性表达浓度较高面积较小，而另外一张单位面积上浓度低但面积大，反映到平均光密度上，切片一平均光密度值肯定大于切片二，然而积分光密度值则会没有明显差别，能够真实地反映出结果。本研究中对比了OD 值与iOD 值结果，认为还是积分光密度iOD 更为准确。3.3 操作注意事项要想获得准确的免疫组化结果，就要注意每一个细节。无论是采用哪种图像采集分析系统，首要一点是保证光源的稳定，良好的稳压是必不可少的，而且每次取图一定要预热20 分钟以上，这一点很多文献都已提及[4,5]。此外最好是在条件一致的情况下，一次将所有的切片采集完，但实际工作中这一点并不容易做到，因为有大量的切片，需要分多次才能完成。此时则需保证每次条件的一致性。也就是一定要将采图的各项设置包括光源、光圈大小、白平衡、曝光强度、敏感度、对比度、Gamma 值等等均改为手动调节且固定，只有这样才能保证每次取图系统的设置值一样。光密度转换时注意，不能简单用统一的公式换算，每次一定要用光密度板测定，并用系统中的分析软件重新拟合曲线，只有这样才能保证最后得到的是绝对光密度值，才具有通用性和可比性。校正光密度一定要用标准的光密度板，本实验所用的是中国计量科学研究院制造的DV－7 型光密度板。图像分割时注意也要建立统一的标准，本文中采用Johansson[6]等人建议的HIS（色度、亮度、饱和度）来代替RGB（红、绿、蓝）分割，更符合人眼的视觉特性。本文采用两套图像采集分析处理系统对免疫组化图像进行采集分析，可以明显感觉到随着科技进步，先进技术和仪器设备的应用也给免疫组化这一传统的方法带来了新的发展，只要我们严格每一项操作步骤，无需像半定量 DNA 等更复杂的技术也能得到准确的分析结果，达到我们实验的目的。
另外，我这边刚装了中文版，还没用过，要的话可以把公司的培训课件传给你。也可以传到DXY。软件只是一个工具，如何分析在于你自己准备采用何种方法分析。
城市：上海
荐一文，供参考。 全自动显微镜及图像分析系统处理免疫组化图像 引言 随着免疫组织化学技术的不断成熟，免疫组化技术已经成为当今生物医学中形态、功能、代谢、物质构成等综合研究的有力工具，在病理学、神经科学、发育生物学、细胞生物学和微生物、寄生虫、病毒等病原体的诊断和研究中具有巨大的实用价值。然而如何对免疫组化染色的结果进行准确的分析，且具有很高的重复性，尽量少的人为误差，一直是大家所关注但仍未能很好解决的问题[1]。本文利用新引进的全自动显微镜和图像采集分析系统对免疫组化结果进行了图像采集分析，结果比较令人满意。 1 材料和方法 1.1 临床资料 本实验分为实验组和对照组。实验组包括30例肩袖撕裂的病人撕裂处单侧SAB，对照组为14 例非肩袖撕裂者的SAB。标本切取后立即经10%中性福尔马林固定，石腊包埋，切片厚度为3μm，进行常规免疫组织化学染色。 1.2 免疫组化试剂 小鼠抗人IL － 6 抗体（ Santacruz biotechnology，Inc. 博士德公司分装）工作浓度1：100，生物素化二抗，SABC 等均购自博士德公司， 其他试剂均采用分析纯。 1.3 仪器及软件 系统一：数码像机（model Penguin 600CL ，Pixera Inc.，美国），Leica 全自动显微镜（model DMLA，Leica Inc.，德国），软件Simple PCI（v5.2，Compix Inc.，美国）；系统二：数码像机（model DC 200，Leica Inc. 德国，），Leica 手动显微镜（model DMLA，Leica Inc.，德国），软件Qwin（v2.3，Leica Inc.，德国）。 1.4 图像采集分析方法 根据Kraan 等[2]采用计算机图像分析系统分别对免疫组化染色切片SAB 中免疫组化染色进行计量分析。每次均在开机20 分钟后，分别用两套系统在40 倍物镜下采集图像。从每张切片中选取一有代表性区域，系统一以序列方式4×5 连续取20 个高倍视野（×400 倍），系统二手动连续取20 个高倍视野。分别对SAB 切片免疫组化染色胞浆中的阳性表达进行定量分析，计算每视野阳性染色的光密度（OD）值和积分光密度（iOD）值，并取20 个视野的积分光密度之和。 1.5 统计学分析 统计数据采用SPSS1
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1、染色过强 原因 解决办法抗体的浓度过高或抗体孵育时间过长 降低抗体滴度（一般指浓缩性抗体）抗体 孵育时间：室温1小时或4℃过夜 孵育温度过高，孵育温度超过37℃ 一般室温20-28℃ DAB显色时间过长或DAB浓度过高 显色时间不能超过5-10分钟，以显微镜下 观察为准2、非特异性背景染色 原因 解决办法操作过程中冲洗不充分 每步冲洗3×5 组织中含过氧化物酶未阻断 可再配置新鲜3%H2O2封闭，孵育时间延长 组织中含内源性生物素 正常非免疫动物血清再封闭 血清蛋白封闭不充分 延长血清蛋白封闭时间 3、染色弱 原因 解决办法抗体浓度过低，孵育时间过短 提高抗体浓度，孵育时间不能少于60分钟超过有效使用期 及时更换试剂操作中，滴加试剂时缓冲液未沥干，致使试剂稀释 每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液（但防止切片干燥）室温太低，低于15℃ 若室温低于15度，要改放在37℃孵育箱孵育30-60分钟（或4℃冰箱过夜）蛋白封闭过度 封闭时间不要超过10分钟4、染色阴性原因 解决办法 操作步骤错误 重新试验，设立阳性对照 组织中无抗原 设立阳性对照片，以验证实验结果 一抗与二抗种属连接错误 仔细确定一抗与二抗种属无误 补充：一、非特异性染色的主要因素 组织的非特异性染色的机理很复杂，其产生的原因主要可分为以下几点： （1）一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去 。 （2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。 （3）除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如Forssman氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。 （4）从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。 （5）抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。 （6）荧光素不纯，标本固定不当等。 二、消除非特异性染色的方法 消除荧光抗体非特异性染色的方法应根据产生的原因采取适当的方法，常用的方法有以下几种： （一）动物脏器粉末吸收法 常用肝粉（猪、大白鼠或小白鼠），其次是骨髓粉、鼠脑粉和鸡胚粉等。每毫升荧光抗体中加入肝粉50～100mg,在中充分混匀，在室温中振动2h， 4℃中过夜，再搅拌10min，高速离心（r/min）30min，1～2次后，即可使用其上清液。吸收一般应在临用前进行，吸收后之荧光抗体保存冰箱中勿超过2周。染色应作吸收前后之比较，吸收时可先用缓冲盐水将组织干粉浸湿，离心（r/min）30min，除去上清液，再加入荧光抗体进行吸收，以免消耗过多的抗体。 肝粉或新鲜细胞吸收是一种非特异性的消除方法，对荧光抗体的荧光色素和蛋白都有吸附作用。如检查组织中的病毒抗原时，也可用相同的组织干粉或匀浆沉淀物吸收之。 用脏器肝粉吸收对荧光抗体损失较多，如果根据Hiramotos氏等的方法将组织的20%生理盐水匀浆液，用生理盐水洗2～3次，12000r/min 10min离心沉淀，用其沉淀物吸收其荧光抗体即能完全达到目的，京极方久氏认为这样吸收对荧光抗体几乎没有损失，他们常用此法，效果甚佳，吸收后放置一周左右，用时有必要再吸收一次。 【肝粉的制法】 （1）将若干只小白鼠或大白鼠放血杀死，取出肝脏，用生理盐水洗2～3次，除去血液，剥掉表面的结缔组织的脂肪。 （2）剪碎，用生理盐水反复洗涤至无血色止，然后再加生理盐水少许，用组织捣碎机或匀浆器作成匀浆。 （3）将肝匀浆装入内（1/3左右），交换地用2～3倍量生理盐水和丙酮反复洗涤各三次，至上清无血色止，每次完毕先用2000r/min离心沉淀15 min后，再除去上清液。 （4）最后用丙酮洗涤肝浆，再用布氏漏斗过滤，或离心沉淀，将沉淀物平铺在洁净的玻璃板上，37℃烤干（过夜）。 （5）在乳钵中充分研磨，用120目铜筛筛选过后，分装，密封，低温干燥保存。 （二）透析法 荧光素如FITC分子可以通过半透膜，而蛋白质大分子不能透过，可将未与蛋白结合的荧光素透析除去。 （1）将标记完毕的荧光蛋白液装入一透析袋或玻璃纸袋内，液面稍留空隙，紧扎。 （2）浸入0.02mol/pH 7.1～7.4的PBS中（悬于大于标记物体积约50～100倍的PBS内），在4℃中透析，每日更换3～4次PBS，约5～7天，透析液中无荧即可（在荧光光源照射下）。 （三）葡聚糖凝胶G-50柱层析法 除游离荧光素可用2×46cm柱层析法，详细方法参阅第二章。加入荧光抗体15～18ml（按床体积的5%～10%加样），使其缓慢渗入柱内，待即将全部入柱时，加入PBS少许，关闭下口，停留30～40min ，使游离荧光充分进入细筛孔中，然后再接通洗脱瓶开始滴入洗脱液。加入洗脱液一定量后，荧光抗体即向下移行，逐渐与存留于上端的游离荧光素之间拉开明显的界线，随着大量洗脱液的不断加入，二者分离距离越来越大，荧光抗体最先流出，分前、中、后三部分收集，测F/P比值，合格者合并，浓缩，分装。洗脱液用20%磺基水杨酸测定蛋白（发生沉淀反应），继续洗脱，游离荧光素则相继被洗脱下来，至洗脱液中无蛋白和荧光素后，此层析柱即可再用。 若用以除去荧光抗体中的游离荧光素和硫酸铵等盐类，可先在过柱前透析一夜，否则，NH4+太浓，在蛋白未完全洗脱时即出现NH4+，因而影响提纯与回收蛋白，一般待洗脱液出现蛋白时，即进行收集，之后出现SO4++（用1%BaCl2检查发生白色沉淀）。最后是NH4+，（用纳氏试剂检查呈黄棕色沉淀），待洗脱液无SO4++及NH4+后可再用。 如仅用小量荧光抗体，可用1×20cm的柱层析柱，取2g Sephadex G-50装柱，即可过滤2～3.5ml荧光抗体。 （四）DEAE纤维素柱层析法 标记过多或过少荧光素的抗体分子可用DEAE-纤维素柱层析法除去。方法如下： DEAE-纤维素柱的装柱，洗脱、再生方法等与提纯IgG方法相同。装柱所需DEAE-纤维素量以干重每克交换20～50mg标记蛋白量为宜 。常用梯度洗脱法如下： （1）层析柱用0.01mol/L、pH7.2PB平衡，标记物上柱后，先用0.01mol/L、pH7.2PB洗脱，洗出无色或淡绿色液体，洗脱液量（根据床体积大小每梯度乘3），然后依下列各种离子强度洗脱液， 分别洗脱和收集： 0.01mol/L、pH7.2PBS（0.05mol/L NaCl）……洗脱部分1。 0.01mol/L、pH7.2PBS（0.01mol/L NaCl）……洗脱部分2。 0.01mol/L、pH7.2PBS（0.02mol/L NaCl）……洗脱部分3。 将此三部分收集液（每管5ml）分别测定其F/P比值，0.05mol/L NaCl pH7.2PB洗脱液280nm光密度高峰管合并，浓缩保存备用。因这部分非特异性染色荧光最少，是比较好的荧光抗体。其他两部分可以废弃。 （2）柱上吸附的过度标记蛋白可继续增加NaCl的浓度至 2.0mol/L洗脱完。 经过DEAE-纤维素层析后的标记抗体，其抗体量一般约损失50%，因此有些要求不太高的抗体，如抗细菌荧光抗体，不一定要这样处理，可用染色效价测定的稀释法除去非特异性染色。 （五）荧光抗体稀释法 先测定荧光抗体特异性染色与非特异性染色的效价，若二者效价相差较大，则可将荧光抗体稀释至一临界浓度，使特异性染色呈阳性，而使非特异性染色保持阴性，稀释方法和染色效价测定方法相同。 （六）纯化抗原法 用各种方法提纯单一成分的抗原是产生单价特异性抗体的最主要条件。近代免疫化学技术（免疫吸收法）和柱层析法等提供了很大的可能性，可参考有关专著。 （七）纯化抗体法---免疫吸收法 例如抗IgA血清的纯化方法---免疫吸收法。如分泌型IgA（ SIgA）抗原纯度不高，所制的抗血清常与IgG呈交叉反应，为此需要吸收，常采用纯化的人IgG戊二醛聚合物加以吸收纯化。方法如下： 1．人IgG聚合物的制备 在5ml含40mg/ml人IgG的0.1mol/L pH7.0磷酸缓冲溶液中，加入2.5%戊二醛溶液1ml，边加边搅，5min即出现混浊，逐现大块胶块，放置30min后，用研钵将凝胶磨细，继用1.0mol/L pH7.0磷酸缓冲溶液反复洗涤3次，末次加蒸馏水至20ml，即为人IgG聚合物悬液。 2．免疫吸收法 将待吸收的抗SIgG血清加入待量IgG聚合物悬液，置室温搅拌60min,离心沉淀，上清液即稀释1倍的纯化抗SIgA血清。如用IgG聚合物作少量分次吸收，其效果更好。 （八）伊文氏蓝（Evans blue）衬染法 用0.01%伊文氏蓝的0.01mol/L pH7.2PBS稀释荧光抗体，可将背景细胞和组织染色，呈红色荧光，与特异性黄绿色荧光形成鲜明的对比，减少了非特异性荧光，宜作常规应用。伊文氏蓝一般先配成1%溶液，保存于4℃，用前再稀释至0.01%用以 和然释荧光抗体。 此外，还可以用胰酶消化组织切片或用10%牛血清蛋白封闭法等消除非特异性染色，提高特异性染色。
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