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地高辛标记核酸探针的标记方法
地高辛标记核酸探针的标记方法
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核酸探针已被广泛用于筛选重组克隆、基因多样性的种性检测和真菌种群内及种群之间的系统发育关系评价。最早使用的放射性同位素标记核酸探针具有敏感性高、特异性好、分辨力强的特点，但放射性同位素标记也存在着一系列令人困扰的问题,如成本高、探针半衰期短、放射性物质危害人体健康等。而且在进行放射性同位素标记实验时,需要有专门的实验室及相应的实验保护设施，还需要由经过培训的专业人员来操作,因而限制了在普通实验室进行分子生物学实验。
　　近几年发展起来的非放射性核酸探针大多通过酶促、光化学和化学手段掺入一种报道基团,这种报道基团可通过高灵敏度的冷光、荧光或金属沉淀等检测系统检测。另外,应用pH电极或感应器技术的电化学检测系统也有报道。在这些检测系统中,灵敏度最高的是生物素- 亲合素检测系统和半抗原-抗半抗原地高辛检测系统。由于生物样品中常含有内源性生物素及生物结合蛋白，生物素标记的核酸探针会发生一些非特异性结合，从而影响实验效果。与生物素-亲合素系统同样具有高灵敏度，却减少了非特异性结合的地高辛检测系统，已为人们所接受,并得到广泛的应用。
地高辛(Digoxigenin ,DIG) 又称异羟基洋地黄毒甙元，是一种类固醇半抗原分子。其化学结构如图1 所示。
采用人工方法可以将地高辛的线型间隔臂与dUTP 连接起来,形成DIG-11-dUTP，通过随机引物法或PCR法将其掺入到DNA探针中。RNA探针的标记是使用噬菌体信息编码的RNA聚合酶，通过体外转录将DIG-11-dUTP掺入到RNA探针中。寡核苷酸探针的标记则是通过末端转移酶催化，在3'末端加上DIG-11-dUTP/dATP 或DIG-11-ddUTP 尾巴。
对于目的DNA 或RNA 来说，分子杂交后,杂交部分可通过ELISA 实验程序加以检测，即加入一种结合有碱性磷酸酶的地高辛-特异性抗体，它与地高辛半抗原分子形成酶联抗体-半抗原(DIG) 复合物，再加入相应的显色底物，使杂交部分得以显示。
1 　地高辛标记核酸探针的主要标记方法
1. 1 　DNA 探针的标记方法
1. 1. 1 　PCR 掺入法 　
这种标记方法是通过聚合酶链式反应，在Taq 酶的作用下，将DIG-11-dUTP 掺入到新合成的DNA 链中。以本法标记的探针不但灵敏度高，产量也很高。少量的基因组DNA(1ng～50ng) 便可直接通过PCR 进行扩增、标记。
1. 1. 2 　随机引物法 　
用随机引物法可将DIG-11-dUTP 标记于DNA 链上。为得到最佳标记效果，标记前模板DNA 需作线性处理，而且至少要用苯酚-氯仿进行一次抽提，再用乙醇沉淀。
100～10000 碱基的模板链均可被有效地标记，但大于10000 碱基的模板链则需要在标记前作限制酶切消化。处理好的模板加入随机引物，按碱基互补原则，随机引物与模板DNA 退火后由Klenow 片段从引物3' 端延伸引物，便可将DIG-11-dUTP 均匀掺入到新合成的DNA 链中。
1. 1. 3 　切口平移法 　
切口平移法DNA 探针技术快速简便，且已非常成熟。先用适量的DNase I 在双链DNA 上打开若干个单链缺口，然后在E. coli DNA 聚合酶I 的5'- 3' 外切活性和聚合活性的共同作用下，在缺口的5' 端切除单链DNA 序列，随之由新合成的带有地高辛标记的脱氧核苷酸链取代。
本法适用于环形DNA 或大于1kb DNA 片段的标记。用于原位杂交的核酸探针，通过切口平移法标记最为有效。因为此方法可通过控制DNase I 的酶活性得到适当的缺口，从而得到长度大小适宜的探针，而探针的大小是原位杂交的一个重要参数，足够小的探针才可能穿透组织或细胞。
1. 2 　寡核苷酸探针的标记方法
合成的寡核苷酸探针被广泛应用于筛选基因文库、Southern 印迹、Northern印迹、斑点印迹及原位杂交试验。地高辛标记寡核苷酸有三种方法:3' 末端标记、5' 末端标记以及在探针3' 端加上数个DIG-11-dUTP 分子的尾巴(图2) 。
1. 2. 1 　3' 末端标记法 　
3' 末端标记法的主要特点是在每个合成的寡核苷酸(长度为14～100bp) 的3' 末端只添加一个地高辛残基(DIG-ddU TP)。用此方法标记寡核苷酸时,除末端转移酶外,无需其它特别的寡核苷酸合成试剂,方便快捷。所合成的探针适合于要求探针具有较高的特异性而灵敏度一般的试验,如Southern 印迹、Northern 印迹、斑点印迹及菌落P噬菌斑杂交实验。
1. 2. 2 　5' 末端标记法 　
5' 末端标记法是通过化学方法将地高辛标记于寡核苷酸的5' 末端。首先在5' 末端连接上一个氨基连接臂残基,将合成的寡核苷酸纯化后,再使DIG-NHS 与5' 末端的氨基残基发生共价结合,从而形成标记探针。这类探针的一个主要优点是其3' 端在DNA 合成反应中充当引物,使反应产物得以标记。
1. 2. 3 　3' 末端加尾法 　
3' 末端加尾法是由末端转移酶在探针3' 末端加上数个地高辛残基的尾巴。此方法标记的探针灵敏度较3' 末端标记法要高出10 倍左右,但由于存在长尾巴,往往会出现较严重的非特异性背景。
1. 3 　RNA 探针的标记方法
通过RNA 聚合酶SP6 、T7 或T3 经体外转录可将地高辛标记于RNA 探针上。用地高辛标记的RNA 探针具有很强的信号能力,且非特异性背景少,在Southern 印迹和Northern 印迹实验中,效果明显优于同为地高辛标记的DNA 探针,可与放射性同位素标记探针相媲美。另外,在筛选菌落P噬菌斑及原位杂交的实验中,RNA 探针也同样具有良好的效果。而且,由于DIG与UTP之间的键合对碱性不敏感,可通过碱处理方法得到所需大小的探针。
2 　影响探针标记方法选择的因素
使用地高辛系统时,可根据地高辛系统的不同用途、所获得的用以制备探针的模板类型、以及探针可达到的灵敏度,选择探针标记方法。总体而言,DNA 模板的纯度越高,标记的效率也越高。在进行标记前,应使用苯酚、氯仿抽提DNA 模板。此外,对于随机引物标记DNA 的方法而言,在标记反应之前,先将模板线性化并加热变性是至关重要的;而对寡核苷酸来说,在其3' 末端加上DIG-11-dUTP 的尾巴前,应该先经过凝胶或HPLC 纯化。
3 　杂交技术
使用地高辛标记的核酸探针进行分子杂交,其杂交动力学、杂交条件与放射性同位素标记的探针相似。探针的性质不同,杂交温度和时间也不同:DNAP不含甲酰胺:杂交温度为68 ℃,时间&6DNAP含50 %甲酰胺:杂交温度为42 ℃,时间&6寡核苷酸P不含甲酰胺:杂交温度为54 ℃,时间1～6RNA - RNA 杂交(RNA 探针) :杂交温度为68 ℃,时间&6RNA - DNA杂交(DNA 探针) :杂交温度为50 ℃,时间&6h 。
地高辛标记探针的一个最重要的优点就是稳定性很强。分子杂交后,杂交液中仍旧含有大量没有退火的地高辛标记探针,只要将这些剩余溶液倒回塑料试管中,分别在- 20 ℃(DNA探针) 和- 70 ℃(RNA 探针) 妥善储存,其稳定性至少可以保持一年之久。在使用这些探针时只需解冻后加热至95 ℃,变性10min 即可。如果杂交液中含有甲酰胺,则需68 ℃变性10min。
此外,在杂交这一环节中,为了避免探针浓度过高而产生干扰背景,有必要在正式杂交前先进行一次模拟杂交,以筛选最适的浓度。
4 　地高辛标记探针的显色检测
4. 1 　化学发光检测
化学发光检测能通过X 光片记录下很轻微的信号,其检测过程分四个步骤完成。首先使用封闭剂对杂交后的膜进行处理,以阻止抗体对膜的特异性吸引,然后加入结合有碱性磷酸酶的抗地高辛半抗原的抗体(Anti-DIG-AP) ,形成酶联抗体- 半抗原复合物,再加入化学发光底物CSPD 或CDP-StarTM(Boehringer Mannheim 公司的产品) ,使其与膜上的杂交探针所结合的抗体复合物充分反应,最后在X 光片上曝光,以记录化学发光信号。化学发光检测在尼龙膜上的效果优于在纤维素膜上的效果。
4. 2 　化学显色
化学显色同化学发光检测的显色原理相同，都是通过类似ELISA 实验的程序加以检测，不同的是化学显色加入的显色底物是5-溴-4-氯-3 吲哚酚磷酸盐(也称X-磷酸盐，BCIP) 和氮蓝四唑盐(NBT)，它与酶联抗体- 半抗原(DIG) 复合物在酶促作用下发生反应，于数分钟内开始呈现蓝紫色，随时间延长，颜色逐渐变深，通常于24h 终止反应。
(责任编辑：大汉昆仑王)
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地高辛药理作用
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　& 地高辛的药理作用及作用机制：　　1、对心脏的作用　　①正性肌力作用：有以下特点：A：加快心肌纤维缩短速度，使心肌收缩敏捷，舒张期相对延长；B：加强衰竭心肌收缩力，增加心搏出量，但不增加心肌耗氧量医学教育 网 搜集整理。　　②减慢心率作用：治疗量的强心苷对心率加快及伴有房颤的心功能不全者则可显著减慢心率。　　③对传导组织和心肌电生理特性的影响：治疗剂量下，医学教育 网 搜集整理缩短心房和心室的动作电位时程和有效不应期；高浓度时，强心苷可使最大舒张电位减小（负值减小），使自律性提高。　　2、对神经和系统的作用：中毒剂量的强心苷可兴奋延脑极后区催吐化学感受区而引起呕吐，还可兴奋交感神经中枢。还能降低CHF患者血浆肾素活性，进而减少血管紧张素II及醛固酮含量。　　3、利尿作用：对心功能不全患者有明显利尿作用。可直接抑制肾小管Na+-K+ATP酶，发挥利尿作用。　　4、对血管的作用：强心苷能直接收缩血管平滑肌，使外周阻力上升医学教育 网 搜集整理。
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? 辽宁 中医杂志 20 11 年第 38 卷第 4 期 地 高辛药动学相互作用 的研 究概述 ， 李倩
300193 天津 中医药大学中医药研究院 现代 中药省部共建国家重 点实验 室 天津市 中药化学与分析重点实验 室
天津 : ， 、 、 ， 摘
要 地 高辛为临床应用极为广泛的强心药
具有安全范 围窄 个体差异 大
治疗量与 中毒量接近等特 点 且 常和 ， ， ， 其他 药物联合使用
药物相互作 用对地 高辛血 药浓度有较 大的影响 易发 生 中毒等不 良反应
故 了解 它们之 间的相 互影 ， 。 ， 响 对临床合理用药具有重要意义 文章从地 高辛的药动 学相互作 用角度探讨其作用的机制及研究现状 以便 为临床更 、 。 加合理
安全使用地 高辛提供参考和依据 : ; 关键词
地 高辛 药动 学
相互作 用 中图分类号: R912
文献标识码: A 文章编号: 1000 － 17 19
04 － 0704 － 02 ， 。 强 心 苷 是一 类 具 有 强 心作 用的 苷 类 化合 物
［1］ ， 1. 2 P450 年临床使用至今已有 多年 的历史 目前仍 代谢过程 细胞色素 在许多 内源性及外源 ［2］
为治疗充血性心力衰竭 的主要药物之一 。但强心苷 ， 性化合物的氧化代谢 中起着重要的作用 它分布于全 ， ， ， 。
类药物安全 范 围窄 个 体差异 大
治疗量 与中毒量 接 身各组织 中
尤 以肝脏 细胞 中的含量 为最高 在所有 ， ， P450 ，CYP3A
当与其他药物联合用药时
易 因药物间的相互作用 家族 中 家族 的酶蛋白在肝微粒体 中占有 ， ， ， 。
导致药物浓度过高 发生 中毒等不 良反应 或使药物浓 较大的 比例
它在肝脏及肠道 中含量 丰富 地高辛是 ， ， CYP3A ， CYP3A
出现洋地黄化不足 是临床上需进行治疗药物
正在加载中，请稍后...地高辛的临床药学监护
&&&&地高辛属于洋地黄类药物，临床上主要用于充血性心力衰竭、控制心房颤动、心房扑通的心室率，是较常用的经典药物之一。但是此药物安全范围窄，个体差异大，治疗量与中毒量接近，合并用药不当可诱发或加重洋地黄中毒，临床上需要进行药物监测。近年来，随着治疗药物监测的开展，不良反应发生率已明显下降。但地高辛的合理使用仍存在一些值得重视的问题：一是电解质水平的监测，二是与药物相互作用的认识，三是积极进行治疗药物监测。
1、注意电解质水平的监测
&&& 在使用地高辛治疗的患者中，进行电解质水平的监测十分重要。我们知道地高辛的作用机制是通过对心肌细胞膜Na+-K+-ATP酶的抑制作用，使细胞内Na+水平升高，转而促进Na+-Ga2+交换，细胞内Ga2+水平随之升高，而有正性肌力作用。在有低钾血症或低镁血症的患者，药物浓度尽管在2ng/ml（地高辛有效血药浓度在0.8-2ng/ml）以下时毒性反应仍可能发生。因为K+或Mg2+的缺失增加了心肌对地高辛的敏感性。因此，在使用地高辛治疗的患者，最好保持正常的血清K+和Mg2+的浓度。这些电解质的缺乏可能会导致腹泻及呕吐等地高辛中毒的消化道症状。我们临床上已观察到几例老年患者就是在地高辛浓度不高的情况下，由于电解质紊乱而出现了这样的典型情况。因此在合并可引起电解质紊乱的药物如利尿剂、两性霉素及可的松等时应尤其注意监测患者的电解质浓度。并且在使用地高辛时，血钾浓度维持在3.8mmol/ml以上较安全。
2、关注地高辛与药物的相互作用
&&& 在住院患者中，地高辛的应用以老年患者居多，多种疾病共存的现象导致联合用药十分普遍。多种药物都可以与地高辛发生相互作用。下面列出需要特别注意且临床意义比较大的一些药物，供医生参考。
&&&&2.1地高辛与大环内酯类
&&& 研究表明，大环内酯类抗生素为磷糖蛋白(p hosphor-glycoprotein，P-gp) 抑制剂，而地高辛为P-gp 底物，所有大环内酯类抗生素均抑制P-gp介导的地高辛跨细胞膜转运，增加其在小肠的吸收，减少其在肾脏的排泄，导致血药浓度升高50 %。
&&&&2.2地高辛与利尿药
&&& 排钾利尿剂如噻嗪类、呋塞米、依他尼酸等可使电解质紊乱致低血钾，在低钾状态下，心脏摄取地高辛的量增加，心肌对地高辛敏感性增强，即使应用常规剂量也易发生中毒，导致心律失常。联用时应注意调整地高辛的剂量及补充钾盐，并监测地高辛血药浓度及血钾水平，避免因血钾过低而加重房室传导阻滞。
&&&&2.3 地高辛与消化系统用药
&&& 质子泵抑制剂奥美拉唑能显著升高胃内p H值,抑制胃酸对地高辛的破坏,使地高辛生物利用度增加。氢氧化铝、复方氢氧化铝、药用炭等使地高辛吸收减少,血药浓度降低。促胃动力药甲氧氯普胺、多潘立酮、莫沙必利等能加快胃及小肠蠕动，减少地高辛在小肠上端的吸收,导致血药浓度降低。
&&&&2.4 地高辛与钙制剂
&&& 高钙血症可使洋地黄毒性增加。氯化钙、葡萄糖酸钙与地高辛联用时可能引起严重的心律失常，因此应避免地高辛与钙注射剂联用。
&&&&2.5地高辛与阿卡波糖
&&& 阿卡波糖为口服降血糖药，其降糖机制是抑制小肠壁细胞活性及其与α-葡萄糖苷酶的可逆性结合，从而延缓碳水化合物的降解，造成肠道葡萄糖的吸收缓慢，降低餐后血糖水平。小肠壁细胞活性被抑制，则地高辛吸收亦减少。同时，阿卡波糖可吸附地高辛，而阿卡波糖口服后很少被吸收，主要在肠道降解或以原形方式随粪便排泄，这也必然影响人体对地高辛吸收。例如，患者，男，50岁，患2型糖尿病并发高血压、心房纤颤，每日接受胰岛素治疗控制血糖，接受地高辛治疗控制心功能。因单独胰岛素治疗对餐后高血糖、尿糖难以控制，增服阿卡波糖50 mg/次，3次/日。3个月后，患者突发严重心房纤颤，急送医院就诊。经查，患者血浆中地高辛浓度仅为0.23 ng/ml，低于有效浓度（0.8～2.0 ng/ml）。后停用阿卡波糖，地高辛浓升至1.6 ng/ml。当再次服用阿卡波糖后，血浆中地高辛浓度又再次下降。最后确认为阿卡波糖干扰了地高辛的作用，停止服用阿卡波糖。
&&&&2.6 地高辛与中药
&&& 很多中药都会影响地高辛血药浓度。而目前研究比较充分、已经证明能升高地高辛血药浓度、增加地高辛毒性有蟾酥。蟾酥为蟾蜍科动物中华大蟾蜍或黑眶蟾蜍的皮肤腺及耳后腺分泌的白色浆液干燥物，其主要成分为蟾毒素和蟾毒配基，都具有蟾甾双烯内酯型强心苷元结构。其作用性质与洋地黄相似，因此与地高辛等洋地黄类合用时强心苷毒性增强，易引起中毒。本院中成药中含蟾酥的中成药有麝香保心丸、血栓心脉宁胶囊、牛黄消炎丸，合用时注意监测不良反应的发生。
3. 及时地高辛血药浓度监测
&&& 地高辛的药动学、药效学个体差异较大，给予正常剂量的药物也可能发生中毒。血药浓度监测在地高辛剂量调整上，可以帮助医生判断药物是否用到足量，以及是否有中毒的可能性。因此当患者有合并多种疾病及用药复杂时，特别是与能升高地高辛血药浓度的药物联用时，注意监测地高辛血药浓度，防止不良反应发生。近日在临床有一患者，男，65岁，因反复心慌胸闷间作，加重伴头晕2天入院。该患者5年前诊断为心功能不全，长期服用美托洛尔、利尿剂治疗。2天前无明显诱因出现胸闷、头晕、恶心、呕吐3次、视物模糊，为求进一步治疗收入院。入院后询问用药史发现该患者一周前在社区医院就诊时医生给予处方地高辛0.25mg，qd。 因此考虑患者恶心、呕吐的症状与地高辛早期中毒有关。但是由于雅培公司不再生产地高辛检测的试剂盒，目前地高辛血药浓度已经暂停测定。因此不能确定这些消化道症状与地高辛的消化道不良反应相关。从这一病例可以看出血药浓度监测对临床诊断、药物治疗方面提供了有效的帮助。
目前临床药学室正在积极申购新的地高辛血药浓度监测仪，尽快恢复地高辛血药浓度，为临床提供全面服务。