第202医院利用胚胎植入前诊断技术成功阻断罕见遗传病 - 中国军网
第202医院利用胚胎植入前诊断技术成功阻断罕见遗传病
前不久，解放军第202医院生殖中心传来喜讯，该中心利用胚胎植入前诊断技术使一名有粘多糖贮积症家族遗传史的产妇顺利产下一名健康男婴，这标志着该中心在阻断罕见病垂直传递方面取得了突破性进展。
该中心主任于月新表示，粘多糖贮积症是一种80%由遗传因素引起的罕见病，发病率虽低，但具有终生性、难治性、高致命性的特点。罕见病患儿一旦出生，其家庭往往要背负沉重的经济和心理负担。传统阻断罕见病遗传的方法往往在明确诊断后已近妊娠中期，只得采用引产来终止妊娠，给孕妇产生较大的生理和心理创伤。
该中心采用最新的胚胎植入前诊断技术，即在胚胎植入子宫前从胚胎上取下几个细胞进行检测，确定胚胎不携带罕见病遗传基因后再行移植，从而生出健康的宝宝，也避免了引产造成的伤害。
胚胎植入前诊断技术既需要拥有成熟的体外受精-胚胎移植（试管婴儿）技术，又需要最新的精准医疗技术做支撑。第202医院生殖中心是辽宁省第一家获得胚胎植入前遗传学诊断(PGD)资质的机构。该中心2015年7月诞生了首例染色体异常胚胎植入前遗传学诊断试管婴儿（即染色体异常三代试管婴儿），今年6月又诞生了东北首例罕见病植入前遗传学诊断试管婴儿（即单基因病三代试管婴儿）。
该中心的精准医疗实验室人才队伍雄厚，具有国内最先进的高通量基因测序仪、微阵列比较基因组杂交分析仪、串联质谱仪、荧光定量PCR仪、全自动染色体核型分析系统等，可进行染色体非整倍体、染色体微缺失微重复和单基因遗传病致病基因检测。
于月新主任强调，罕见病并不罕见。第202医院生殖中心将进一步开展罕见病的孕前、孕早期诊断与阻断技术，完善相关调研，成立罕见病患者关爱组织，对罕见病基因携带者及家庭给予生育指导，从而降低罕见病患儿的出生率。
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（遗传学专业论文）FISH技术检测原核数目异常胚胎以及对单卵裂球核型分析技术的初步探索
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FISH比对核型分析在染色体非整倍体产前诊断中的应用研究
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删Ｊ ｉ ｒ ＩＩ ｌｌｌ ｉ Ｉ ｉ ｆ ｌ ｉ ｆｌ、ｔ １ ９３ １ ３６ １原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研 究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人 或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：酣刮。秘日期：凇１１年厂月学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。 根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部 门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州 大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学 位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑 州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：珏叫，钍日期：功『ｆ钌月７沙日ｒ’―――――――摘要ＦＩＳＨ比对核型分析在染色体非整倍体产前诊断 中的应用研究研究生孙利敏 赵先兰孔祥东导师郑州大学第一附属医院妇产科河南郑州，４５００５２摘背景和目的要我国新生儿出生缺陷发病率为４％～６％，这意味着我国每年新增近１００万例 出生缺陷儿。出生缺陷包括先天性畸形和先天性遗传性疾病，染色体异常足出 生缺陷的重要因素，智力低下和生长发育异常是其共同特征。产前诊断是在胎 儿出生之前用各种先进的科技手段，了解胎儿在富内发育状况，对有先天性畸 形和致命性遗传性疾病的患儿做出诊断，为胎儿宫内治疗及选择性流产创造条 件。２ｌ、１８、１３、Ｘ和Ｙ五种相应的染色体非整倍体疾病占可出生染色体病患 儿的９５％以上，检测此五种相应的染色体非整倍体疾病，有利于降低新生儿出 生缺陷发病率，实现优生优育，提高国民人口素质。目前染色体核型分析技术 是人们公认检测染色体病的金标准。核型分析虽具有准确精细的优点，但费时 费力，一般至少两周出结果，成功率为９５％，这在一定程度上限制了产前诊断 的发展。因此，迫切需要寻找一种快速、有效、简便、可靠的产前诊断方法。 该研究将荧光原位杂交技术（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎＳｉｔｕＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ简称ＦＩＳＨ）与核型分析技术相比对，评价两者在染色体非整倍体产前诊断中的一致性，评 估ＦＩＳＨ是否可以快速、有效、稳定的用于染色体非整倍体产前诊断；探讨其在 产前诊断中的临床应用价值及可行性。材料和方法该实验羊水标本来源于：郑州大学第一附属医院产前诊断中心２００９年７月 至２０１０年１２月期间，符合产前诊断指征，孕龄１６＂－－＇２４Ｗ不等，并要求行羊水Ｔ【－摘要穿刺，进行产前诊断的孕妇２００例，Ｂ超引导下羊膜腔穿刺抽取羊水２５ｍｌ。５ｍｌ 用于ＦＩＳＨ分析，探针选用北京金菩嘉医疗技术公司的染色体位点特异性（ＧＬＰ）１３ ／２１双色探针和染色体着丝粒探针（ＣＳＰ）１８／Ｘ／Ｙ三色探针分别标记１３、２ｌ、１８、 Ｘ、Ｙ五种染色体，检测常见的五种相应的染色体非整倍体疾病；２０ｍｌ用于羊 水细胞培养后进行染色体核型分析。 研究期间两组实验分别由两组人员独立完成，直至本实验结束。实验结束 后，对两种方法结果的一致性进行比较、分析。蛙甲 ：口爿Ｅ１．羊水细胞培养核型分析结果 １９９例羊水１次培养成功，并得出核型分析结果。共检出４６，ＸＸ，１００例； ４６，ＸＹ，９４例；检出异常核型５例：ｌ例４７，ＸＸＹ，１例４７，ＸＸ，＋２１，２例４７，ＸＹ＋２ｌ 和１例４５．ＸＹ，ｒｏｂ（１３；１４）。首次培养失败ｌ例，原因不明，该孕妇：年龄２５岁， 孕龄２０周，唐筛高危，羊水咖啡色，培养时无细胞克隆，二次穿刺培养后成功， 核型分析为４６，ＸＹ。 ２．ＦＩＳＨ实验结果 １９９例羊水２４～４８ｈ内一次性杂交成功，与核型分析结果一致。①检出 ４７，ＸＸＹ异常核型１例。ＣＳＰｌ ８／Ｘ／Ｙ三色探针与标本杂交后，在荧光显微镜下显 示：２个天蓝色信号（代表２个１ ８号染色体）；２个绿色信号（代表２个Ｘ染色 体）；一个红色信号（代表Ｙ染色体）。②检出１例４７，ＸＸ，＋２１和２例４７，ＸＹ，＋２１ 异常核型。杂交后荧光显微镜下ＧＬＰｌ３／２ｌ双色探针显示：２绿色信号（代表２ 个１３号染色体）；３个红色信号代表（代表３个２ｌ号染色体）。③羊水细胞培养 失败１例，ＦＩＳＨ检测为１正常男胎，排除了唐筛高危，与核型分析结果一致。 ④ｌ例４５，ＸＹ，ｒｏｂ（１３；１４）ＦＩＳＨ未能检测出，ＦＩＳＨ检测其为１正常男胎，为ｌ假阴 性结果。 ３．ＦＩＳＨ和核型分析结果比对 ＦＩＳＨ的成功率高于核型分析；对于常见染色体非整倍体的产ｆｊ｛『诊断ＦＩＳＨ 与核型分析有较高的一致性，灵敏度（４／４）１００％，特异度（１９５／１９５）１００％；对于染 色体异常核型检测，灵敏度（４／５）８０％，特异度（１９５／１９５）１００％。ＩＩ摘要结论１．ＦＩＳＨ检测常见的五种相应的染色体非整倍体异常：与核型分析一致，可以 快速、稳定、有效检测胎儿染色体非整倍体异常，对于建立快速产前诊断有重 大意义，具有较高的临床应用价值及可行性。 ２．ＦＩＳＨ对于未被荧光标记的其他染色体非整倍体和复杂染色体结构异常如平 衡移位等不能检测。关键词：荧光原位杂交；产前诊断；染色体非整倍体；核型分析ＩＩＩ
ＡｂｓｔｒａｃｔＴｈｅ Ｓｔｕｄｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ＳｉｔｕＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｏｎＰｒｅｎａｔａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ＣｈｒｏｍｏｓｏｍａｌＡｎｅｕｐｌｏｉｄｉｅｓｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｋａｒｙｏｔｙｐｅ ａｎａｌｙｓｉｓＬｉｍｉｎ ＳｕｎＰｒｏｆ．Ｘｉａｎｌａｎ ＺｈａｏＰｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅ ＳｕｐｅｒｖｉｓｏｒＶｉｃｅ Ｐｒｏｆ．Ｘｉａｎｇｄｏｎｇ ＫｏｎｇＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ ａｎｄ ＧｙｎｅｃｏｌｏｇｙＴｈｅ ｆｉｒｓｔａｆｆｉｌｉａｔｅｄｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆＺｈｅｎｇｚｈｏｕ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＺｈｅｎｇｚｈｏｕ，Ｈｅｎａｎ，４５００５２Ａｂｓｔｒａｃｔ ０ｂｊ ｅｃｔｉｖｅｏｕｒＢａｃｋｇｒｏｕｎｄ ａｎｄＴｈｅｍｏｒｂｉｄｉｔｙ ｏｆ ｎｅｗｂｏｍｂａｂｙ ｂｉｒｔｈ ｄｅｆｅｃｔ ｉｎａｒｅｃｏｕｎｔｙ ｉｓ ４％－－一６％，ｔｈａｔｍｅａｎｓ ｔｈｅｒｅｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ １ ００ ｔｅｎ ｔｈｏｕｓａｎｄｓ ｎｅｗｂｏｒｎ ｂａｂｉｅｓ，ｗｈｏ ｈａｖｅ ｔｈｅ ｂｉｒｔｈｏｕｒｄｅｆｅｃｔｓ ｅｖｅｒｙ ｙｅａｒ ｉｎｃｏｕｎｔｒｙ．Ｂｉｒｔｈ ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎｃｌｕｄｅ ｔｈｅ ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｙ，ＳＯｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙｒｅａｓｏｎｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄｏｎ．Ｔｈｅｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅａｂｎｏｒｍａｌｉｔｙｉｓ ｔｈｅｍａｊｏｒｌｏｗａｏｆ ｔｈｅ ｂｉｒｔｈ ｄｅｆｅｃｔ ｎｅｗｂｏｒｎ ｂａｂｉｅｓ，ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｃｏｍｍｏｎ ｆｅａｔｕｒｅｓａｙｅｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄａｂｎｏｒｍａｌｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｐｒｅｎａｔａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ Ｃａｎ ｈａｖｅｋｎｏｗｌｅｄｇｅ ｏｆ ｔｈｅ ｆｅｔｕｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｔｈｅｒ’Ｓ ｕｔｅｒｉ ｗｉｔｈ ｖａｒｉｏｕｓ ｋｉｎｄｓ ｏｆａｄｖａｎｃｅｄ ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｉｆ ｗｅ ｆｉｎｄ ｔｈｅ ｆｅｔｕｓ ｔｈａｔ ｈａｖｅ ｔｈｅｃｏｎｇｅｎｉｔａｌａｂｎｏｒｍａｌｉｔｙｏｒｔｈｅ ｄｅａｄｌｙ ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ 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ｐｒｏｂｅ ｗｈｏ ｗｅｒｅ ｍａｄｅ ｂｙＢｅｉｊｉｎｇ ｊｉｎｐｕｊｉａｍｅｄｉｃａｌｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｃｏｍｐａｎｉｅｓａｎｄ ｔｈｅｙｗｅｓｅｐａｒａｔｅｌｙ ｍａｒｋｅｄ ｔｈｅ １ ３，２ １，１ ８，Ｘ，Ｙ ｆｉｖｅ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ，ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｆｉｖｅ ｃｏｍｍｏｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｎｏｔｈｅｒ ２０ｍｌｃｏｕｌｄ ｄｅｔｅｃｔａｍｎｉｏｔｉｃｆｌｕｉｄ ｗａｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｉｎｔｈｅｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅａｎｄ ｋａｒｙｏｔｙｐｅ ａｎａｌｙｓｉｓｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ａｎｄｃｏｍｐｌｅｔｅｄ ｂｙｓｔｕｄｙ ｐｅｒｉｏｄ ｔｈｅｓｅｔｗｏｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｔｗｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｇｒｏｕｐｓ ｕｎｔｉｌ ｔｈｅ ｅｎｄ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ；ｗｅ ａｎｎｏｕｎｃｅｄｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｗｏ ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｒｅｓｕｌｔ １．Ａｍｎｉｏｔｉｃ ｆｌｕｉｄ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ１ ９９ａｎｄｋａｒｙｏｔｙｐｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｓｕｌｔｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃａｓｅａｔａｍｎｉｏｔｉｃｆｌｕｉｄｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄａｎｄｇｏｔｔｈｅｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｋａｒｙｏｔｙｐｅｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｔｉｍｅ．Ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｔｏｔａｌｌｙ ｄｅｔｅｃｔｅｄ １ ００Ｖｃａｓｅｓｏｆ ４６，ＸＸ，９４ ｃａｓｅｓＡｂｓｔｒａｃｔｏｆ ４６，ｘＹ，ａｎｄ ｆｉｖｅ ａｂｎｏｒｍａｌ ｋａｒｙｏｔｙｐｅ：ｏｎｅ ４７，ＸＸＹｏｎｅ ｃａｓｅｃａｓｅｏｆ４５，ＸＹ，ｒｏｂ（１ ３；１ ４），ｏｎｅｃａｓｅｃａｓｅｏｆｏｆ ４７，ＸＸ，＋２ １ ａｎｄ ｔｗｏｃａｓｅｓｏｆ ４７，ＸＹ，＋２ １．１ｆａｉｌｅｄ ａｔ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔａｔｉｍｅ．Ｔｈｅ ｆａｉｌｅｄ ｃａｓｅ：ｔｈｅ ｐｒｅｇｎａｎｔ ｗｏｍａｎ ｗａｓ ２５ ｙｅａｒｓ ｏｌｄ，ａｎｄ ｈａｄｔａｎｇｓｃｒｅｅｎｈｉｇｈ－ｓｃｒｅｅｎ，ｗｈｏｓｅ ｇｅｓｔａｔｉｏｎａｌ ａｇｅ ｗａｓ ２０ ｗｅｅｋｓ；ｔｈｅ ａｍｎｉｏｔｉｃ ｆｌｕｉｄ ｗａｓ 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ｈｉｇｈ－ｒｉｓｋｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．＠Ｏｎｅａｓ ａｃａｓｅｗａｓ ４５，ＸＹ９ｒｏｂ（１ ３：１ ４），ＦＩＳＨａｈａｖｅ ｎｏｔｂｅｅｎｄｅｔｅｃｔｅｄ，ＦＩＳＨ ｄｅｔｅｃｔｅｄｎｏｒｍａｌｍａｌｅ ｆｅｔｕｓ，ａｎｄ ｉｔ ｉｓｆａｌｓｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｓｕｌｔ．３．Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｈｅ ＦＩＳＨ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｋａｒｙｏｔｙｐｅ’ＳＦＩＳＨ ｈａｄ ｈｉｇｈａｈｉｇｈｅｒＳＵＣＣＥＳＳｒａｔｅｃｏｍｐｒｅｄｗｉｔｈ ｔｈｅ ｋａｒｙｏｔｙｐｅ ａｎａｌｙｓｉｓ．ＦＩＳＨ ｈａｄｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｋａｒｙｏｔｙｐｅａｎａｌｙｓｉｓｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｍｏｎｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｃｈｒｏｍｏｓｏｍ ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ ｉｎ ｐｒｅｎａｔａｌｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ａｎｄｗａｓ（４／４）１ ００％，ｔｈｅＷａｓ（１ ９５／１ ９５）１ ００％；ｆｏｒｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌａｂｎｏｒｍａｌｉｔｙｋａｒｙｏｔｙｐｅ ｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ（４／５）８０％，ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ Ｗａｓ（１ ９５／１ ９５）１ ００％．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ１．ＦＩＳＨ ｉｓｄｅｔｅｃｔｅｄｔｈｅ ｍｏｓｔ ｃｏｍｍｏｎ ｆｉｖｅｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌａｎｅｕｐｌｏｉｄｙａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ：ｉｔｔｏ．ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｗｉｔｈ ｋａｒｙｏｔｙｐｅａｎａｌｙｓｉｓ，ａｎｄ Ｃａｎｂｅ ｆａｓｔ，ｓｔａｂｌｅａａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ａｎｅｕｐｌｏｉｄ ｆｅｔａｌ ａｎｏｍａｌｉｅｓ，ａｎｄ ｈａｖｅｇｒｅａｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａＶＩＡｂｓｔｒａｃｔｆａｓｔ，ｓｔａｂｌｅ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｆｅｔａｌ ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ ｐｒｅｎａｔａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ．Ｉｔ ｈａｄｖａｌｕｅａｈｉｇｈ ｃｌｉｎｉｃａｌａｎｄ ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ． ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ ｗｈｉｃｈａｌＴｌ’ｔ２．ＦＩＳＨ ｃｏｕｌｄｎ’ｔ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌｍａｒｋｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｓｕｃｈａｓａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓｔｈｅ ｂａｌａｎｃｅ ｓｈｉｆｔｓ ａｎｄＳＯ．ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；ＰｒｅｎａｔａｌＡｎｅｕｐｌｏｉｄｉｅｓ；ｋａｒｙｏｔｙｐｅ ａｎａｌｙｓｉｓｄｉａｇｎｏｓｉｓ；ＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅＶＩｌ目正文部分录中英文缩略词……………………………………………………………………Ｉ ＦＩＳＨ比对核型分析在染色体非整倍体产前诊断中的应用研究……………．１ 前 日Ｕ 言……………………………………………………………………………………………………．１。 吾……………………………………………………………………………………………………．材料与方法………………………………………………………………………一３结 果……………………………………………………………………………………………………１ １讨论…………………………………………………………………………………………………．．１：！ 结附 论…………………………………………………………………………………………………一１ ９图…………………………………………………………………………．．２０参考文献………………………………………………………………………．２４综述部分荧光原位杂交技术用于产前诊断的研究进展………………………………．２７ 参考文献………………………………………………………………………．３９附录部分个人简历及在学期间发表的学术论文………………………………………．４５ 致 谢………………………………………………………………………………………………．４６
缩略词表缩略词表英文缩略词ＮＴ ＦＩＳＨＡＦＰ英文全称Ｎｅｃｋ ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔ ｌａｙｅｒ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ａｌｐｈａ ｆｅｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎＨｕｍａｎ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ中文全称颈项透明层厚度荧光原位杂交技术 甲胎蛋白 人绒毛膜促性腺激素游离雌三醇 快速非整倍体筛查 妊娠相关蛋向９．ｈＣＧ／ｈＣＧｕＥ３Ｆｒｅｅ ｅｓｔｒｉｏｌＲＡＤ ＰＡＰＰ．Ａｒａｐｉｄ ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ Ｐｒｅｇｎａｎｃｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓＤＳＳＰＤｏｗｎ’Ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｒｓ唐氏筛奄项目Ｍ．ＦＩＳＨｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ多色荧光原位杂交技术ＷＣＰｆＡＣＳｗｈｏｌｅｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｐａｉｎｔｉｎｇ Ｐｒｏｂｅｓ全染色体涂抹探针 荧光激活的细胞分选法Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄＰＧＤＳＲＹＰｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉａｇｎｏｓｉｓｓｅｘ植入前遗传学诊断Ｙ染色体性别决定区ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｒｅｇｉｏｎｏｆ Ｙ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ＳＫＹｓｐｅｃｔｒａｌ ｋａｒｙｏｔｙｐｉｎｇ光谱核型分析技术
ＨＵ云ＦＩＳＨ比对核型分析在染色体非整倍体产前诊断 中的应用研究研究生 导师 孙利敏 赵先兰孔祥东郑州大学第一附属医院妇产科 河南郑州，４５００５２．▲上．―Ｊ一刖罱出生缺陷是影响世界各国人口素质的重大问题，全球每年约有５００万缺陷 儿出生，而我国每年大约有８０～１００万出生缺陷儿出生，占我国每年新出生新 生儿人口的４％～６％，给家庭带来沉重的经济和精神负担的同时，也消耗了大量 卫生资源，已成为严重的公共卫生和社会问题…。随着环境污染加剧、环境类激 素物质增多、孕妇高龄化、转基因食品增加、避孕药物和催眠类药物的大范围 使用，使得新生儿出生缺陷发病率呈现逐年升高趋势【ｚ，３，４】。染色体异常是导致出 生缺陷的重要因素之一，Ｎｉｅｌｓｅｎ等【５】研究表明可出生的染色体异常患儿中９５％ 以上为１３、１８、２ｌ、Ｘ、Ｙ五种相应的染色体非整倍体异常。因此检测这五种相 应的染色体非整倍体异常对于减少出生缺陷患儿出生、减轻家庭及社会负担和 提高人口素质有着重要意义。 如何最大限度的减少染色体病患儿出生，实现优生优育，提高我国人口素 质是亟待解决的问题。我国采取三级预防措施来避免出生缺陷患儿的出生：一 级预防即孕前预防；二级预防即产前诊断；三级预防即新生儿筛查。其中二级 预防产前诊断是主要方法，它是在胎儿出生之前，采用生物化学、影像学、分 子生物学和细胞遗传学等各种先进的科技手段，了解胎儿在宫内的发育状况， 观察胎儿有无畸形，分析胎儿染色体核型有无异常，对有先天性畸形和遗传性 疾病的患儿做出诊断，并可以通过宫内治疗和选择性流产减少出生缺陷患儿出生【６１。产前诊断是近３０年发展起来的一个新领域【７】。产前诊断较为常用的方法有 以下几种：一是影像学检查，例如四维彩超、胎儿镜等观察胎儿体表有无畸形，前言主要是针对无脑儿、脊柱裂、脊柱膨出以及内脏外翻等致命性的体表畸形做出 诊断；以及通过胎儿超声颈项透明层厚度（ＮＴ）指标来推测唐氏发生风险率【８Ｊ。 二是通过检测母体血清学生化指标来间接判定胎儿有无异常，但存在不能定性 的问题。例如唐氏筛查孕中期ＡＦＰ、ｆｒｅｅ－－一ｈＣＧ／ｈＣＧ和ｕＥ３的三联筛查。三是 获取胎儿遗传物质进行染色体核型分析，如孕早期１０～１３Ｗ的绒毛活检，孕中 期１６～２２Ｗ的羊膜腔穿刺，孕晚期１８～２４Ｗ的脐静脉穿刺。孕中期羊膜腔穿刺取 羊水具有较为安全、无创、简便以及可行性强等优点而应用较为广泛。羊水培 养后进行传统的染色体核型分析，为目前国内外公认的诊断染色体疾病的金标 准【９】，但费时费力，步骤繁杂，时间长，需要专业技师进行核型分析，与中期细 胞数量的多少、核型分散程度好坏、染色显带清晰与否有关，诸多因素不可避 免的导致培养失败风险增高。 ＦＩＳＨ技术的原理是将分子生物学与细胞遗传学相结合，根据染色体碱基互 补配对原则，用荧光标记的染色体区带特异性ＤＮＡ探针，与分裂期或间期细胞 进行杂交，在荧光显微镜下观察目标染色体上的荧光信号，来判断目标染色体 有无疾病【１０１。由于探针种类的有限性，ＦＩＳＨ主要用来检测染色体非整倍体异常， 其主要步骤包括：染色体制备，探针标记，将探针与目标染色体杂交，荧光显 微镜下观察结果，并进行结果判定。ＧｒｅｍｅｒＩ…在１９８６首次证实了ＦＩＳＨ可用于 检测问期细胞非整倍体染色体异常，并在对细胞核进行分析时，建立起荧光标 记与检测系统进行信号放大的检测，使得ＦＩＳＨ具有敏感度高、信号强、背景低 以及快速等优点。随后Ｔｅｐｐｅｒｂｅｒｇ等【１２】用１３、１８、２１、Ｘ染色体特异性探针对 ５３４８例妊娠妇女未培养的羊水间期细胞进行ＦＩＳＨ检测。ＦＩＳＨ技术不仅能用于 染色体中期分裂相，还可用于问期细胞，标本来源丰富；羊水细胞无需培养， 不存在培养失败等问题；出报告时间大大缩短，可以减轻孕妇的焦虑情绪，帮 助医生及时做出治疗性的决策【１３】。 随着科技的进步，各种染色体探针的研制开发，该技术越来越多的被用于 基因诊断和染色体疾病的诊断。在国外ＦＩＳＨ目前己成为一种临床常规检测手段， 被广泛用于产前、产后遗传病诊断、血液肿瘤和实体瘤等方面的检测【Ｉ ４１，而国 内尚未广泛应用于产前诊断，尤其是在河南省相关报道更少。 该研究通过ＦＩＳＨ和核型分析相比对，旨在评价两者结果染色体非整倍体产 前诊断的一致性；评估ＦＩＳＨ是否可以快速、有效、稳定的用于在染色体非整倍 体产前诊断；探讨其临床应用价值及可行性。２材料与方法材料与方法１实验材料１．１研究对象及一般资料 １．１．１研究对象羊水：２００例，取自２００９年７月至２０１０年１２月在郑州大学第一附属医院 产前诊断中心进行产前诊断的孕妇，孕龄１６＂－－＇２４Ｗ不等。产前诊断孕妇指础６】：（１）唐氏筛查高危；（２）不良孕产史；（３）高龄孕妇，年龄大于或等于３５岁；（４）Ｂ超提示胎儿畸形；（５）不明原因的羊水过多或过 少；（６）夫妇双方有遗传疾病史。 １．１．２羊水标本的获取 ．孕妇穿刺前常规检查血常规、传染病和心电图。在无发热，穿刺部位无感 染过敏等不适，血小板计数正常，心电图无异常，并告知相关风险后并签署羊 水穿刺知情同意书的自仃提下进行。孕妇排空膀胱后，平躺于无菌操作台上，由 有经验的医师在Ｂ超引导下尽量避丌胎盘及胎体，在羊水量较深处定位穿刺点。 常规消毒铺巾，放置无菌操作架，经腹部采用２１号特制羊水穿刺针行羊膜腔穿 刺术。穿刺时注意穿刺速度，不宜太快。弃去最初２ｍｌ羊水后（最大限度避免 母血污染），再抽取２５ｍｌ羊水，分装于３个无菌试管中。一个无菌试管注入５ｍｌ 羊水用于荧光原位杂交，另２个无菌试管分别注入１０ｍｌ羊水用于细胞培养核型 分析，每个试管分别标明性别、年龄、姓名、住院号等个人信息。穿刺后，拔 出穿刺针，并再次消毒穿刺点，无菌敷料覆盖，孕妇无菌操作台上休息片刻， 若无特殊不适，方嘱其离丌。术后嘱其卧床休息，自数胎动。 １．２主要试剂 羊水细胞培养基 秋水仙素 ＣＳＰｌ８／Ｘ／Ｙ三色探针和ＧＬＰｌ３／２１双色探针 ＧＩＢＣＯ培养基ＧＩＢＣＯ公司北京金普嘉公司３材料与方法ＤＡＰＩ（二氨基苯基吲哚）０．０７５ｍｏｌ／１北京金普嘉公司 自制 上海锐谷生物有限公司 郑州宝赛生物技术公司ｍｏｌ／１ ＨＣＬ，０．０１ＫＣＬ低渗溶液磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ） ０．２５％胰酶２ｘＳＳＣ缓冲液，２０ｘＳＳＣ缓冲液，甲酰胺变性液，胃蛋白酶液，１ｍｏｌ／１ ＨＣＬ，Ｏ．１ ｍｏｌ／１ＨＣＬ等相关试剂，均按北京金普嘉公司ＦＩＳＨ试剂配制方法进行配制。１．３主要仪器设备生物组织烤片机 恒温烤箱 一２０℃低温冰箱 电热恒温水浴箱 离心机 染色体图像分析仪 ３７℃隔水式恒温培养箱 恒温烤箱 荧光显微镜和显微照相机 超净工作台上海医疗仪器厂 上海医用恒温设备厂 河南新飞电器 北京市永光明医疗仪器厂 上海安亭科学仪器厂上海ＢＥＩＯＮ北京市永光明医疗仪器厂 上海医用恒温设备厂ＯＬＹＭＰＵＳ公司上海医疗仪器厂２实验方法?研究期间两种实验分别由两组人员独立完成，直至本实验结束，公布两种实 验结果，并进行比较。２．１羊水染色体标本制备实验步骤２．１．１羊水细胞培养和制片 （１）细胞收集：将２０ｍｌ羊水分装于两个无菌离心管中，１０ｍｌ每支，１５００ｒ／ｍｉｎ，１０ｍｉｎ。（２）接种：在超净台内，用移液管小心吸取上清弃去，每管２Ｈ５ｍｌ，３７。Ｃ预 温过的羊水培养基，并用移液管将底部沉淀与培养基反复轻轻吹打混匀，然后４材料与方法移置５０ｍｌ的细胞培养瓶中。 （３）培养：将培养瓶平放于３７℃恒温培养箱中６天左右观察贴壁细胞克隆情 况。２４ｈ后再次观察贴壁细胞克隆情况。（视克隆情况可行多次换液。并将第一 次换液时，换下的上清液置入新的培养瓶中，加入５ｍｌ ＧＩＢＣＯ培养基进行传代培 养。）当有５个以上细胞克隆时可以考虑收获。 （４）收获：加入一定量的秋水仙素，继续培养４ｈ，置倒置显微镜下观察羊水 细胞变成圆型，用吸管将培养瓶中液体转入一次性５ｍｌ塑料离心管中，并用３７＂Ｃ 预温过的生理盐水冲沈培养瓶贴壁面两次（１ｍｌ／次），并将冲洗过的生理盐水 转入１５ｍｌ玻璃刻度离心管中，然后加入０．２５％胰酶１．５ｍｌ（均匀布满贴壁面）， 在３７℃培养箱中消化５ｍｉｎ后，取出轻轻拍打培养瓶侧壁，使贴壁细胞充分脱落，再加入ｌｍｌ ＧＩＢＣＯ培养基终止消化。将培养瓶中液体转入上述１５ｍｌ玻璃刻度离心 管中，再次用ｌｍｌ ３７＂Ｃ预温过的生理盐水冲洗培养瓶并将液体转入上述１５ｍｌ玻璃刻度离心管中，１５００ｒ／ｍｉｎ，１０ｍｉｎ，弃上清。 （５）低渗：在沉淀中加入预温至３７℃的０．０７５ｍｏｌ／１ ＫＣＬ｛氐渗溶液６ｍ］，置３７℃ 水浴箱低渗５ｍｉｎ。 （６）预固定：加入配好的固定液ｌｍｌ（甲醇：冰乙酸为３：１）并轻轻吹打混匀，１５００ｒ／ｍｉｎ，ｌＯｍｉｎ，弃上清。（７）制片：按照郑州大学妇产科实验室的染色体制备流程进行固定，滴片， 烤茂ｏ （８）Ｇ显带，显微镜分析：由专业技师对分裂中期的羊水染色体按照《人类 细胞遗传学国际命名体制（ＩＳＣＮ １９９５年）标准》进行核型分析。 ２．１．２羊水细胞核型分析 一般计数１０个核型，并画出２．３个核型图，详细分核型析，如为异常加倍计 数。采用上海ＢＥＩＯＮ．染色体图像分析仪采集染色体核型。２．２ＦＩＳＨ检测未培养的羊水细胞实验步骤２．２．１仪器与探针ＦＩＳＨ使用Ｏｌ ｙｍｐｕｓ ＢＸ一５１荧光显微镜，并采用ＶｉｄｅｏＴｅｓｔ－－一ＦＩＳＨ３．０软件进行分析，探针选用北京金菩嘉医疗技术公司制造的染色体位点特异性ＧＬＰｌ３／５材料与方法２１双色探针和染色体着丝粒探针ＣＳＰｌ８／Ｘ／Ｙ三色探针进行杂交。区域定位于 １３ｑ１４和２１ｑ２２的ＧＬＰｌ３／２１双色探针分别用ＦＩＴＣ（绿色，代表１３号染色体） 标记；Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ（红色，代表２ｌ号染色体）标记；区域定位于ｐ１１．１～ｑ１１．１ 的ＣＳＰｌＳ／Ｘ／Ｙ三色探针分别用ＤＥＡＣ（天蓝色，代表１８号染色体）标记；ＦＩＴＣ （绿色，代表Ｘ染色体）标记；Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ（红色，代表Ｙ染色体）标记。２．２．２ＦＩＳＨ操作步骤 依次经过间期细胞玻片制备，玻片预处理，样本变性，杂交，玻片洗涤，加１５９ｌ ＤＡＰＩ复染剂于杂交区域，盖上盖玻片，暗处放置１０～２０ｍｉｎ，在Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５１荧光显微镜下选用合适的滤片组，观察玻片。２．２．３ＦＩＳＨ操作流程图２．２．３．１玻片制备：材料与方法２．２．３．２玻片预处理：２．２．３．３变性杂交步骤２．２．３．３．１甲酰胺变性杂交（手工操作）７材料与方法探针配置杂交缓冲液８．０ＩＩｌ和２．０ ｕ １探针加入到微鼍离心管中２．２．３．３．２标本准备及变性以及进行杂交玻片依次置于一２０℃预冷的７０％、８５％、１００％乙醇中各２ｍｉｎ脱水２．２．３．４玻片的洗涤和复燃玻片置于Ｏ．３％ＮＰ．４０／０．４ｘＳＳＣ溶液中，震荡 １．３ｓ，漂洗２ｍｉｎ８材料与方法少 玻片置于０．１％ＮＰ．４０／０．４ｘＳＳＣ溶液中，震荡１．３ｓ，漂洗３０ｓ山盖上盖玻片，暗处放置１０―２０ｍｉｎ，荧光显微镜下观察玻片９材料与方法２．２．４ＦＩＳＨ结果判读规则 每个染色体探针组在荧光显微镜下至少随机计数５０个细胞：①若９０％以上细胞核杂交信号为正常，则判定该细胞为正常核型；②若６０％以上细胞核杂交 信号为异常，则判定为异常核型；③若无法判读，则扩大计数至１００个细胞， 再做判读；④若细胞正常杂交信号介于１０％－－一６０％，则存在嵌合型可能，须加倍 扩大计数至２００个细胞，并进一步对大量中期分裂相细胞做传统核型遗传学分 析。 ＦＩＳＨ判读时的分析注意事项：①选取背景低、轮廓清晰、荧光信号清晰可 辨的细胞核计数；②信号如果有分裂，而且两信号之间相互有交叉或并排，但 两者之间距离小于信号大小的一半时，判断为一个信号【ｌ ５１。１０结果钴 里 ：口７卜３．１羊水细胞培养核型分析结果１９９例羊水一次性培养成功，并在３Ｗ左右得到核型分析结果。共检出１００例４６，ＸＸ，９４例４６，ＸＹ，检出异常核型５例，分别为：１例４７，ＸＸ，＋２１和２例 ４７，ＸＹ，＋２１（细胞核型分析图如附图３．１所示）；ｌ例４７，ＸＸＹ（细胞核型分析 图如附图３．２所示）；１例４５，ＸＹ，ｒｏｂ（１３；１４）（细胞核型分析图如附图３．３所示）。 首次培养失败１例，该孕妇年龄２５岁，孕龄２０Ｗ，唐筛高危，羊水咖啡色，首 次培养时无克隆细胞，二次穿刺后培养成功，并进行核型分析为４６，ＸＹ。３．２ＦＩＳＨ实验结果１９９例羊水在２４＂－＇４８ｈ内一次性杂交成功，与核型分析结果一致。Ｊ下常的１３／２１组探针荧光显微镜下显示为：２绿色信号代表１３号染色体，２红色信号代 表２１号染色体（如附图３．４所示）。Ｊ下常男胎１８／Ｘ／Ｙ组探针荧光显微镜下显示为： ２天蓝色信号代表１８号染色体，ｌ绿色信号代表Ｘ染色体，１红色信号代表Ｙ 染色体（如附图３．５所示）。正常女胎１８／Ｘ／Ｙ组探针荧光显微镜下显示为：２ 天蓝色信号代表１８号染色体，２绿色信号代表Ｘ染色体（如附图３．６所示）。 共检测出４例非整倍体染色体异常，１例４５，ＸＹ，ｒｏｂ（１３；１４）ＦＩＳＨ未能检测出。 ①检出４７，ＸＸＹ异常核型ｌ例，与传统细胞学分析检测的为同一例。荧光显微镜 下１８／Ｘ／Ｙ组探针显示为：２天蓝色信号，２个绿色信号及１个红色信号，分别 代表２个１８号，２个Ｘ，和１个Ｙ染色体（如附图３．７所示）。该孕妇怀孕２０Ｗ， ３８岁属高龄产妇，曾有泌尿系统畸形儿生育史。②检出２１．三体异常核型３例， 与传统细胞学分析结果一致。荧光显微镜下１３／２１组探针显示为２个绿色信号和 ３个红色信号，分别代表２个１３号染色体和３个２ｌ号染色体（如附图３．８所示）。 １孕妇：年龄２９岁，孕２２Ｗ且为唐筛高危者；１孕妇：年龄３５岁孕２０Ｗ，属 高龄孕妇；另１孕妇２７岁，孕２２Ｗ，为唐筛高危者。③核型分析首次培养失败 １例，ＦＩＳＨ检测为ｌ正常男胎。④１例４５，ＸＹ，ｒｏｂ（１３；１４）ＦＩＳＨ未能检测出，ＦＩＳＨ 检测其为ｌ正常男胎，为１假阴性结果。该孕妇曾有不良孕产史，孕两次均自 然流产。查其双亲，其父亲为４５，ＸＹ，ｒｏｂ（１３；１４），母亲正常，表明其染色体变异１１结果来源于其父。３．３ＦＩＳＨ实验结果与羊水细胞核型分析相比较１．ＦＩＳＨ的成功率高于核型分析；ＦＩＳＨ不能检测罗伯逊移位等染色体结构畸形。（详见表１．１） ２．两者对于染色体非整倍体检测的一致性为１００％；ＦＩＳＨ检测染色体非整倍体的特异度（１９５／１９５）为１００％，灵敏度（４／４）１００％；ＦＩＳＨ检测染色体异常核 型的特异度（１９５／１９５）为１００％，灵敏度（４／５）８０％。（详见表１．２） ３．检测出异常染色体的发病率为（５／２００）２．５％。表１．１ ＦＩＳＨ实验结果与．羊水细胞核型分析比对注：特异度＝真阴性例数／（真阴性例数＋假阿Ｉ性例数），灵敏度＝真阳性例数／（真刚性例数＋假阴性例数）１２讨论讨论出生缺陷是患儿在出生时，即在外形或体内形成的结构或功能缺陷，出生缺 陷严重影响国民素质的提高，阻碍经济的可持续发展，其包括遗传、环境等所 致的染色体畸变或基因突变。大部分染色体畸变胚胎可在孕早期通过自然流产， 或胚胎停育而被自然淘汰。据国外Ｂｒｙｎｄｏｒｆ等【ｌ ６】报道新生儿染色体异常率约为 Ｏ．８５％，国内侯红英，李小毛等［Ｉ ７】报道新生儿染色体异常率为０．５％，该实验由 于纳入标准为高危孕妇，检测出异常染色体的发病率为（５／２００）２．５％。可出生 的染色体畸变的患儿中，大部分为染色体非整倍体畸形。染色体非整倍体被定 义为一个体细胞的染色体数目增加或减少了一条或数条，是临床上最常见的染色体畸变类型１８】。导致染色体非整倍体产生的机制，多数学者认为是在性细胞成熟过程或受精卵卵裂早期，发生了染色体不分离或染色体丢失所致，主要包 括２１，１３，１８，Ｘ，Ｙ五种常见染色体非整倍体畸形。随着孕妇年龄高龄化的趋 势升高、环境污染、食品污染和避孕药物的大量应用等，增加了染色体非整倍体疾病发病的风险。产前诊断的重要性不言而喻，势在必行，因此我国实施产前渗断来减少出 生缺陷患儿的出生，并列入了母婴保健法，使其具备了法律依据。产自ｉ『诊断即 在胎儿出生之前运用各种措施来了解胎儿宫内发育情况。产前诊断可以降低畸 形儿的出生率，提高国民素质，减轻社会以及家庭的经济负担，促进国家民族 兴盛，社会可持续发展和人类进步。产前诊断方法分为有创性和无创性两大类。 无创性检测包括母体血清学筛查、Ｂ超等，Ｂ超检查是无创性产前筛查或诊断的 首选方法。有创性检测包括取绒毛、羊水穿刺以及抽取胎儿脐血获取胎儿遗传 物质，进行染色体核型分析。核型分析需要２－－一３Ｗ得出结果，时间长且存在培 养失败的可能。 １９６９年，Ｐａｒｄｎｅ【２０】和Ｊｏｈｎ［２１１将放射性同位素标记核酸用于原位杂交，１９８０ 年摒弃了反射性出现的非放射性原位杂交的出现，再到１９８６年Ｇｒｅｍｅｒｔｌｌ】建立起 荧光标记与检测系统进行信号放大的检测，使得ＦＩＳＨ具有敏感度高、信号强、 背景低、快速等优点。较为常见的２ｌ，１３，１８，Ｘ，Ｙ五种常见染色体非整倍体 畸形，占产前诊断中染色体畸形率的６０％－－一８０％［１９】，这与该实验检测的染色体 非整倍体占异常核型的８０％是相一致的。该技术克服了核型分析的缺点，具有１３讨论特异度高、信号强、背景低、快速等优点，使其迅速用于临床检测，尤其用于 检测染色体非整倍体产前诊断具有重要意义。４．１ＦＩＳＨ与核型分析的比较该实验中两种方法用来检测染色体非整倍体，两者结果一致性为１００％；ＦＩＳＨ的成功率比核型分析高。本实验ＦＩＳＨ在检测染色体非整倍体的特异度和灵 敏度均达到了１００％，这与Ｗｉｔｔｅｒｓ［２２１、Ｔｅｐｐｅｒｂｅｒｇ［１２】等报道的在染色体非整倍体 的检测中ＦＩＳＨ敏感度９９．６％，特异性９９．９％，与传统核型分析的符合率为９９．８％， 是相一致的。核型分析需要２０ｍｌ羊水，需细胞培养，需对分裂中期的细胞进行 核型分析后得出结果。成功与否与细胞培养时，培养瓶中克隆细胞的多少、能 收获细胞的多少、分裂中期相细胞的多少、显带染色的可辨性、技术师的专业 素质等有关，过程繁杂，存在培养失败、显带失败等可能，出报告时问长，需２～ ３Ｗ。据报道核型分析成功率比较低（相对ＦＩＳＨ而言），为９５％ｔ２３１。ＦＩＳＨ需羊水 样本量少，约５～１０ｍｌ，羊水细胞无需培养，出报告迅速２４＂４８ｈ，步骤操作简 便，结果容易辨别，人员培训快，不存在培养失败的可能。ＦＩＳＨ对于细胞的分 裂周期没有特殊的要求，标本来源丰富，可以用于细胞分裂中期或问期的细胞， 无需细胞培养，不存在培养失败【２４】。这对一些不明原因的羊水培养无克隆细胞 生长，以及少数不明原因羊水过少的孕妇无疑是一有益补充。表２ ＦＩＳＨ与羊水细胞核型分析比较该实验中４例异常非整倍体染色体异常，ＦＩＳＨ均在２４ｈ－－－４８ｈ内得出结果， 并与核型分析一致。表明ＦＩＳＨ可以快速、准确、稳定、有效的进行染色体非整 倍体产前诊断，具有较高的临床应用价值及可行性，对建立稳定快速有效的产前 诊断技术有重大意义。 该实验ＦＩＳＨ未能检测出４５，ＸＹ，ｒｏｂ（１３；１４）１例，ＦＩＳＨ对于染色体异常的灵 敏度为８０％。表明对于复杂结构染色体异常：如移位等，ＦＩＳＨ无法检测。１４讨论 ４．２ＦＩＳＨ杂技巧分析经过多次的实验总结，我们对ＦＩＳＨ操作步骤有所改进，得到了良好的杂交信号。①延长胶原酶消化时间，根据孕周大小，调整消化时ｆＢＪ ３０＂－－５０ｍｉｎ不等， 孕周越大时间越长，并适当增加吹打次数；②由原来的使用３７℃ＫＣＬ低渗２０＂－＂ ３０ｍｉｎ，调整为用３７℃纯水低渗３０～４０ｍｉｎ，使细胞尽量胀大，利于杂交，结果 显示纯水效果较好；③孕周大的羊水杂质较多，可将固定次数调整为３＂－＇４次， 尽量除去杂质；④为得到理想的裸核，胃蛋白酶消化期间可先预看片，后调整 消化时间，得到理想的裸核；⑤滴片时保证适当的细胞悬液浓度；⑥杂交时避 免盖玻片与玻片之问产生气泡，保证湿盒湿度，适当延长杂交时间，使杂交充分。４．３ＦＩＳＨ的优缺点ＦＩＳＨ在染色体非整倍体产前诊断的优点：简便、迅速、灵敏性高和特异性强，对样本的要求不高，需要样本量少，适用于任何有核细胞。羊水穿刺进行 核型分析的最佳时间是１６，－－－，２２Ｗｔ９１，临床中经常遇到孕龄大于２２周的孕妇要求行 产自仃诊断。孕龄大的孕妇羊水进行细胞培养比较困难，杂质较多，羊水细胞培 养克隆比较困难，需延长培养时间，并且要增多收获次数，这是羊水培养失败 的原因之一，ＦＩＳＨ不存在这一问题。但是ＦＩＳＨ也有一定的局限性：①由于探针 的特异性，一种探针只能检测一种染色体异常，若检测多种染色体异常，势必 增加费用，而且目前探针的研制开发种类有限，主要检测非整倍体染色体异常， 虽然也有相关报道可以检测罗伯逊易位、其它易位和部分倒位【２５１，但对于复杂 的染色体结构异常，ＦＩＳＨ不能替代核型分析【２６】：②可有假阴性结果出现，如易 位型２１．三体，可因为染色体短臂断裂或丢失，以及着丝粒融合，可导致常规ＦＩＳＨ 检测漏诊【２７】；本实验ｌ例罗伯逊移位漏检，即是一假阴性结果；③可有假阳性结 果出现，正常染色体标本，在ＦＩＳＨ试验中会出现异常情况，比如两个Ｊ下常信号 在有的细胞内会出现一个或三个信号，以及一个信号会被分成两个信号，这在 其他文献中也有报道【２引，这时需要认证辨别或扩大计数；④荧光信号受诸多因 素影响，导致无信号或信号弱，本实验对诸多步骤进行改进，得到了较好的杂 交信号，然而荧光信号消失较快，例如在镜下看到较好的信号，用来摄图分析 时发现信号变弱，原因在于荧光信号的不稳定性，使信号消失过快，因此操作１５讨论要迅速、避光，＿［Ｉ力Ｈ／Ｘ．ＤＡＰＩ（抗淬灭剂）避免信号消失过快；④探针价格昂贵， 实验仪器贵重，在一定程度上限制了ＦＩＳＨ的发展。４．４ＦＩＳＨ应用于产前诊断的价值有关学者【２９】研究认为高龄是产生２１、１８．三体的重要原因，高龄妇女由于卵母细胞老化，减数分裂时易出现染色体不分离导致２ｌ、１８．三体产生。而目前妇 女受教育水平的提高等原因导致孕妇高龄化趋势在逐年增加。有资料显示【３０】： 胎儿唐氏综合征的发病只有１５．０％～３１．０％是发生在３５岁以上孕妇，而６９．０％～ ８５．０％是发生在小于３５岁。因此在对高龄孕妇重视的同时，应同样重视年轻孕妇 唐氏综合症的产前诊断。特别对不明原因的羊水过多或过少、胎儿宫内窘迫、 胎儿发育迟缓等高风险者应进行产前筛查。本实验中检Ｎ２例２１．三体即是年轻孕妇。目前我国对唐氏筛查方案、正常范围以及计算软件均是基于欧美地区的统 计数据，使得我国产前诊断存在方法、方案和指标不统一，缺乏大样本临床研 究和筛查指标的正常值范围、质量控制等问题，从而导致了筛查的假阴性、假 阳性率偏高【３１１。而据Ｇｅｋａｓ等【３２】报道８０％的产前核型分析是因为唐氏综合症筛查 进行，选用ＦＩＳＨ不但可以排除唐氏，还可以排除其他四种常见的染色体非整倍 体畸形，因此在对染色体非整倍体的产前诊断中是可以单独应用的。唐氏综合 症的发病率是０．１％，在进行唐筛中反映母亲年龄、生化标记、超生波指针、孕 周和颈项透明层厚度等软指标，很大一部分都是假阳性【３３１。以上表明如果孕妇 唐筛结果显示为阳性或ｊｘＬ险值较高，则存在假阳性率的可能性较高。然而作为 医学知识有限的孕妇，唐筛结果阳性，风险值高必将导致孕妇产生不必要的焦 虑和不安，而ＦＩＳＨ出报告时间缩短，可以尽早减轻孕妇的这种焦虑不安。在 Ａｎｇｅｌａ等［３４】对１６７８例进行产前诊断的孕妇资料及结果研究表明：对于高龄、血 清学显示阳性、超声软指标阳性者，ＦＩＳＨ可以作为比较理想的产前诊断选择来 排除染色体非整倍体畸形，而在对于其他复杂染色体疾病，ＦＩＳＨ是不能替代核 型分析的。其他研究【３５＇３６】也表明：对于高龄、血清学异常、或者超声提示为体表 或内脏畸形等高风险者，单单进行ＦＩＳＨ这一快速产前诊断，是可以独立进行的， 并且可以缩短出报告时间，显著的减低孕妇的焦虑情绪，及时帮助医生做出治 疗性的决策。有资料【３２】显示：国夕［＇ＦＩＳＨ成本较核型分析低，且能迅速出结果，１６讨论英国推荐快速产前诊断的（ＲＡＤ 方法进行唐筛（ＤＳＳＰ，Ｄｏｗｎ’Ｓｒａｐｉｄ ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙｄｉａｇｎｏｓｉｓ）ＦＩＳＨ可以作为独立的ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｒｓ）。早在１ ９９３年ＦＩＳＨ技术就被美国遗传学会（ＡＣＭＧ）允许用于产前辅助诊断，最终的确诊还需要 依赖核型分析，而至Ｕ２０００年鉴于ＦＩＳＨ技术具有高度的敏感性和特异性，ＡＣＭＧ 宣布ＦＩＳＨ技术可以用于常见染色体数目异常的确诊，而不再仅仅作为辅助性产 前诊断手段ｐ７‘。该实验中４例异常非染色体非整倍体异常，ＦＩＳＨ均在２＆＇－４８ｈ内得出结果， 并与核型分析一致。因此对于高龄、血清学异常、超声指标阳性者，笔者认为 ＦＩＳＨ是可以独立进行常见的５种染色体非整倍体的产前诊断，并且可以缩短出报 告时间，显著的减低孕妇的焦虑情绪，及时帮助医生做出治疗性的决策。但是有资料显示１６和２２号染色体三倍体畸形是自然流产最常见的原剧３８】，对于此两种非整倍体畸形ＦＩＳＨ是无法检测的。因此对于未被荧光标记的其他染色体非整 倍体和复杂的染色体结构异常如移位、重复等染色体畸形，是不能替代核型分 析的。而随着探针种类的研制开发，仪器费用等价格的降低，ＦＩＳＨ将会应用于 更多染色体疾病的检测，必将具有广泛的应用前景。４．５产前诊断所面临的问题由于“晚婚晚育”，“一对夫妇只生一个孩子”人口政策的提倡，高龄孕 妇逐年增多，经济水平的提高，城乡水平差距的缩小，人们受教育水平的提高， 使人们对“优生优育＂意识的加强，因此越来越多的孕妇，家庭更注重，并要 求行产前诊断，使得产前筛查人数的增多。而环境的恶化、辐射物质的增多和 不良药物的应用等使得染色体致畸率、突变率增高，也使得产前筛查、产前诊 断显得尤为重要，势在必行。 目前比较常用的产前诊断方法有超声和血清学分析两种无创性的方法，其 只能推测染色体疾病的发病风险，并不能完全判断有无染色体疾病。而有创性 的羊水穿刺，绒毛膜取样和脐血穿刺获得胎儿遗传物质进行传统的核型分析， 长期以来存在费时费力、周期长、培养失败风险和需要专业技师进行分析等问 题。ＦＩＳＨ虽在检测染色体非整倍体具备简便、迅速、灵敏性高和特异性强优点 的同时，但由于探针价格贵，种类有限，可检测的染色体疾病有限，在对于复 杂染色体结构的异常和未被标记的其他染色体非整倍体异常，不能替代核型分１７讨论析，这在某种程度上阻碍了产前诊断的发展。 如何寻求适合我国国情的产前诊断方案，既能满足目前同益增多的产前筛 查人群，进行大范围的产前筛查，又能以快速，有效，准确率高，灵敏度强， 价格适中的方法进行产前诊断，是我们追求的，对于ＦＩＳＨ虽具有以上优点，但 如何降低其费用并研制开发更多种的国产探针，检测更多的疾病，是我国产前 筛查亟待解决的问题【３９１。１８结论结１论ＦＩＳＨ检测常见的五种相应的染色体非整倍体异常：与核型分析一致，可以 快速、稳定、有效检测胎儿染色体非整倍体异常，对于建立快速产前诊断 有重大意义，具有较高的临床应用价值及可行性。２ＦＩＳＨ对于未被荧光标记的其他染色体非整倍体和复杂染色体结构异常如 平衡移位等不能检测。１９附图附图峨辩Ｉ 多、文。≯；｜箩、彳茅图３．１ ４７，ＸＸ。＋２１图３．２ ４７，ＸＸＹ箭头所示为三条２ｌ号染色体箭头所示为２条ｘ染色体，一条Ｙ染色体附图图３．３ ４５．ＸＹ，ｒｏｂ（１ ３；１４）箭头所示为罗伯逊移位的１３和１４号染色体２１
附图图３．４正常１３／２１探针组 ２绿色信号代表１３号染色体 ２２色信号代表２ｌ号染色体图３．５正常１８／Ｘ／Ｙ探针组（男胎） ２天蓝色信号代表１８号染色体 绿色代表Ｘ红色代表Ｙ图３．６正常１ ８／Ｘ／Ｙ探针组（女胎） ２大蓝色信号代表１ ８号染色体 ２绿色信号代表Ｘ染色体
附图图３．７ １８／Ｘ／Ｙ探针组（克氏）２天蓝色信号代表１８号染色体 ２个绿色信号及２个ＸＸ １个红色信号Ｙ图３．８ １３／２１探针组（２１．三体）２个绿色信号及１３号染色体 ３个红色信号代表３个２１号染色体２３
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综述综述 荧光原位杂交技术用于产前诊断的进展孙利敏综述 审校赵先兰孔祥东产前诊断是在孕早期对胎儿先天性缺陷和遗传性疾病进行诊断，为胎儿宫 内治疗及选择性流产创造条件【Ｉ】。我国新生儿出生缺陷发病率为４％～６％，这意 味着我国每年新增１００万出生缺陷儿【２１。据报道【３】随着孕产妇和围生儿死亡率下 降，出生缺陷已成为围生儿死亡的主要原因。这无疑给国民经济造成了沉重负 担的同时，阻碍了国民人口素质、国民经济的提高。随着人们受教育水平的普 遍提高，“一对夫妇一个孩子”以及“优生优育”人口政策的提倡，使人们普遍对产 前诊断的意识加强；而“母婴保健法”的出台规定：对有产前诊断指证的高风险孕 妇，主管医师必须建议其行产前诊断，这给产前诊断提供了法律保障，否则一 旦出生缺陷儿出生，易导致医患纠纷。产前诊断所处于这种形势下，使其成为 产科医师以及孕产妇关注的热点问题。 染色体异常是出生缺陷的重要因素，智力低下和生长发育异常几乎是染色 体病的共同特征。染色体异常胎儿绝大多数在妊娠早期停止发育自然流产，可 出生的染色体病中２１、１８、１３、Ｘ、Ｙ五种非整倍体异常占所有可出生染色体病 患儿的９５％以上【４１，因而检测此五种相应的染色体非整倍体异常是产科热点中的热点。我国采取三级预防措施来避免出生缺陷患儿的出生，一级预防：孕前预防； 二级预防：产前诊断；三级预防：新生儿筛查。其中二级预防是产前诊断的主 要手段，可通过选择性流产减少患儿出生。对提高国民人口素质，实现人口战 略，降低家庭及社会的经济负担有着十分重要的意义。 产前诊断的方法大致分为无创性与有创性两种。无创性包括：①血清学筛 查，孕早期的妊娠相关蛋白（ＰＡＰＰ．Ａ）和绒毛膜促性腺激素（ＨＣＧ），孕中期的 较高的ＨＣＧ、较低的甲胎蛋白（ＡＦＰ）和游离此三醇（ＵＥ３），由此推断唐氏综合症 发生的风险比值；②Ｂ超、ｘ线，胎儿镜等影像学检查观察胎儿体表有无畸形， 主要是针对无脑儿、脊柱裂、脊柱膨出和内脏外翻等致命性畸形做出诊断，但综述对遗传代谢性疾病如耳聋、多指、苯丙酮尿症等基因位点突变，以及对染色体 畸形所导致的常见疾病如２１一三体、１８一三体、１３一三体、４５，ｘ和４７，ＸＸＹ等 染色体数目或结构异常并不能做出定性诊断；③从孕妇外周血富集胎儿细胞用 于产前诊断；④在孕５～１５Ｗ通过宫颈灌洗，收集从宫颈管脱落的滋养层细胞， 用束检测胎儿性别及染色体非整倍体疾病用于产前诊断【５】；⑤从孕妇尿液中富集 胎儿游离ＤＮＡ进行产前诊断。后三种方法，虽然无创、样本收集较为简便，标 本来源丰富，但富集胎儿细胞较为困难，技术尚不成熟，未能在临床广泛推广。 有创性的包括：妊娠１０．１３Ｗｔ”绒毛取样，有流产，宫内感染，刺破胚囊， 胎儿肢体畸形等危险【６】；孕晚期的脐静脉穿刺技术要求高，并且存在孕周大，易 导致脐带穿刺部位出血、胎儿心动过缓、绒毛膜羊膜炎和脐带血肿等并发症发生，严重导致死胎或流产等损伤风斛７１，而且需要对获得的标本是否为胎儿血进行辨别，以上两种方法未能普遍推广。目Ｉｊ｛『认为孕中期Ｂ超引导下羊膜腔穿刺 是最为安全和简便的获取ＨｆｉＪＬ遗传物质的方法，通过获得羊水进行细胞培养和 核型分析是产前诊断较为常用的检测染色体异常的方法，并且染色体核型分析 为目前国内外公认诊断染色体病的金标准（８】，但存在费时费力，步骤繁杂，时间 长，需专业技师进行核型分析，核型分析的结果与中期细胞的数量多少、核型 分散程度的好坏、显带清晰与否有关，诸多因素不可避免的导致培养失败风险 增高。而对于目前存在的同益增多的大量要求进行产前诊断人群的今天，如何 快速、有效、准确的进行先天性缺陷和遗传性疾病的检测，是我们医务人员一 直都在共同努力追求的目标和亟待解决的问题，而传统的核型分析显然有诸多 问题不能满足这种需求。 具有快速、准确、无需细胞培养、灵敏度高和特异度强的荧光原位杂交技 术在此基础上应用而生。由于它具有快速、简便、灵敏和特异性强等优点，已 经从实验室研究领域，广泛应用于产前、产后遗传病诊断以及血液肿瘤、实体 瘤等临床医学相关领域的检测【９】。 本文拟从荧光原位杂交技术用于产前诊断的进展做一简要的综述。２８综述１荧光原位杂交技术（简称ＦＩＳＨ）１．１ＦＩＳＨ技术原理 荧光原位杂交技术（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎ ｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）简称ＦＩＳＨ，其原理是利用ＤＮＡ碱基互补配对的特性，将直接标记荧光的变性ＤＮＡ（探针）和变性的目标 ＤＮＡ（玻片上的样本）进行杂交，通过荧光显微镜观察荧光信号在染色上的位置判 断相应染色体的情况。它是将分子生物学、细胞遗传学与先进的ＤＮＡ科学技术 相结合的一项新兴技术，ＦＩＳＨ应用于临床后极大的推动了在染色体水平及基因 水平产前诊断的飞跃。ＦＩＳＨ技术的步骤是将目标ＤＮＡ及其周围物质进行制片， 通过胃蛋白酶消化，高温，甲酰胺处理等使目标ＤＮＡ变性为单链，在适当温度 （４２。Ｃ）湿度条件下，使目标ＤＮＡ与变性为单链的ＤＮＡ探针杂交，杂交完成后 可在该目标染色体杂交部位显示杂交信号。相比核型分析：无需要进行细胞培 养和进行大量的中期分裂相的染色体核型，出结果时间短，可用于间期细胞、 中期细胞，样本来源丰富，同时标本可以长时间保存。因此ＦＩＳＨ技术已被广泛 应用到染色体异常的产前诊断研究中【ｌｏ＇Ｉｌ】。１．２ＦＩＳＨ技术发展历程 １９６９年Ｐａｒｄｕｅ和Ｇａｌｌｔｌ２】公布了使用放射性同位素标记的核酸用于原位杂交，当时鉴于对放射性同位素的放射安全性和不稳定性的忧虑以及可用于标记 核酸的有限性考虑，虽然当时原位杂交技术具有信号强、灵敏性高的优点已得 到公认，但仍处于实验室阶段。随后出现非放射性原位杂交技术，摒弃了放射 性，但需要复杂的免疫化学反应和信号放大，存在方法繁琐、敏感度低和背景不清晰等问题【１３】。１９８６年，Ｇｒ锄ｅｒ【１４】等建立了荧光标记的并对检测系统进行信号放大的ＦＩＳＨ技术，因其具有敏感度高、信号强、背景低、简便、快速等优点， 而被迅速用于临床疾病的诊断，从而丌创了细胞分子学和遗传学疾病渗断的新 篇章。１９９２年Ｋｌｉｎｇｅｒ【１５ｌ将ＦＩＳＨ用来检测末培养羊水进行染色体非整倍体，随 后又大量的文献【１６，１７，１８，１９】报道ＦＩＳＨ成功用于未培养的羊水问细胞检测染色体非 整倍体。使ＦＩＳＨ技术在产前诊断领域丌辟了新天地，技术并日益成熟完善。 此后，随着科技的进步，人类基因组图谱的绘制完成，越来越多的染色体 探针研制开发，该技术越来越多的被用于基因诊断和染色体病的诊断，同时推２９综述动了临床医学向分子水平和基因水平的跳跃，目前广泛的用于产前诊断和实体 瘤检测，如宫颈癌、血液病、乳腺癌、肠道肿瘤等疾病的诊断。１．３ＦＩＳＨ技术探针类型 目前比较常用的荧光原位杂交杂交ＤＮＡ探针包括一下几类【２０，２１，２２】：①染色体特异重复序列探针，主要是指染色体着丝粒部位的特殊序列探针，其特点是： 与靶位结合紧密，不含散在重复序列，信号强，易于检测。常用来检测微小标 记染色体以及间期细胞非整倍体，较为常用的有１３、１８、２ｌ、Ｘ、Ｙ染色体特异 性位点重复序列探针。②全染色体涂抹探针（ｗｈｏｌｅｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｐａｉｎｔｉｎｇ Ｐｒｏｂｅｓ，ＷＣＰ），染色体涂染技术是用染色体或染色体区带特异性ＤＮＡ文库作为探针池， 与中期或间期细胞的染色体进行荧光原位杂交或染色体原位抑制杂交，从而在 整条染色体（或某个特定区域）上显示荧光信号，从而在分子水平检测染色体数目 和结构畸变，特别是对细胞遗传学水平难以确定的微小易位和复杂易位畸形变 的检测，可以快速简便的做出判定【２３１。其缺点是不能分辨同一染色体臂间移位 和染色体倒位病变。１９９６年出现的人类染色体２４个长臂及１９个短臂的染色体臂 涂染探针，克服了这一缺点【２４】。③位点特异性的染色体探针，即特定染色体上 特定ＤＮＡ序列的探针，例如用来诊断（ｓｅｘ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｒｅｇｉｏｎｏｆＹ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ＳＲＹ基因的性别决定基因的探针。④特异性位置探针。专门为特异患者制作特殊 探针，可用于筛查染色体臂问倒位及易位等。⑤端粒或亚端粒探针。通过特异 的端粒或亚端粒探针于间期或中期细胞核的染色体进行杂交，来对染色体末端 缺失、末端复制或微小重排等术端的畸形，简便迅速做出的检测。端粒或亚端 粒探针也可以与着丝粒探针、ＷＣＰ联合运用来检测染色体易位等。１．４ＦＩＳＨ探针荧光标记方法 ＦＩＳＨ探针荧光标记方法可以分为直接法及间接法。直接法即用荧光素直接标记特殊的探针，经变性、杂交和漂沈后，可直接在荧光显微镜下检测染色体 结构。间接法则在杂交、漂洗之后，将荧光素与探针结合并又将荧光素与其特 异的抗体结合，这样使得待测信号放大，从而可以更加迅速、直观、敏感的观 察待检测的特异靶序歹ＱＤＮＡ。间接法虽具有以上优点，但是通过信号放大系统， 操作步骤复杂［２５，２６］，相比而言直接法比较简便，信号强度虽不及间接法，但运用 直接法荧光标记，在荧光显微镜下即可得到满意信号，因此临床检测常用直接３０综述法标记的荧光探针。目前已经丌发出了多色ＦＩＳＨ，可以用不同的荧光素以不同 比例混合标记得到不同颜色的探针，可以同时诊断人类的多条染色体有无病变。２．ＦＩＳＨ技术用于产前诊断ＦＩＳＨ技术用于产前诊断这是最近十几年备受关注的快速产前诊断方法。在 社会和家庭都比较重视优生优育的形势下，加之科技发展的迅速推动，使得荧 光原位杂交技术用于产前诊断得以迅猛发展。２．１ＦＩＳＨ用于产前诊断的检测方法 将获得的胎儿遗传物质标本如羊水、脐血和绒毛等，经过一系列处理后获得细胞裸核而后与探针进行杂交，滴加抗淬灭剂与杂交区域，加盖盖玻片，在 荧光显微镜下选用合适的滤光片组观察玻片。以较为常用的有１３、１８、２１、Ｘ 和Ｙ染色体特异性重复序列探针检测羊水为例。探针组合ｌ是ＧＬＰｌ ３／ＧＬＰ２１双 色探针，分别以绿色表示１３号染色体和红色表示２ｌ号染色体，可以在荧光显 微镜下选用合适的滤光片组观察玻片，红色、绿色各２个信号判断为正常细胞， 否则为异常。探针组合２是ＧＳＰｌ８／Ｘ／Ｙ三色探针，天蓝色表示１８号染色体，绿 色表示Ｘ染色体，红色表示Ｙ染色体，在荧光显微镜下选用合适的滤光片组观 察玻片，正常细胞显示为２个天蓝色信号，女胎为２个绿色信号，男胎则是绿 色、红色信号各１个，否则为异常。 判读原则，随机计数５０个细胞：若９０％以上的细胞显示为Ｊ下常信号，判读 为讵常；若６０％以上的细胞出现异常型号，结果判读为异常；若介于两者之间 无法判断时，则需扩大计数至１００个细胞，从新判断，并需与大量中期分裂相 的核型分析相结合。分析结果时需注意：①随机计数；②选取细胞信号清晰可 辨者；③选取细胞轮廓清晰者；④选取背景低的细胞核；⑤信号如果有分裂， 而且两信号之间相互有交叉或并排，但两者之间距离小于信号大小的一半时， 判断为一个信号【２７】。２．２ＦＩＳＨ与羊水 ＦＩＳＨ主要用于检测染色体非整倍体疾病。自从８０年代经荧光标记并对检测系统进行信号放大，敏感度高、信号强、背景低和快速等优点的ＦＩＳＨ技术出 现后，ＦＩＳＨ被迅速的应用与产前诊断检测某些遗传性疾病和先天性疾病，尤其３１综述是对占所有可出生的染色体病患儿的９５％ｔ２８】五种相应的染色体非整倍体的检 测，即２ｌ、１８、１３、Ｘ、Ｙ五种常见染色体非整倍体的检测。德国的Ｅｉｂｅｎ等【２９】 在１９９９年报道了用ＦＩＳＨ检测３１５０例未培养的羊水标本，结果显示ＦＩＳＨ成功 的检测２ｌ、１３、１８、Ｘ、Ｙ五种常见的染色体非整倍体疾病，证明了ＦＩＳＨ可以 快速、有效、稳定、可靠的检测染色体非整倍体。美国Ｔｅｐｐｅｒｂｅｒｇｔ”】在２００１年 报道了对一个产前诊断中心两年余５３４８例羊水标本ＦＩＳＨ的检测结果的回顾性 研究分析显示：ＦＩＳＨ检测染色体非整倍体疾病的特异性为敏感度９９．６％，特异 性９９．９％，与传统核型分析的符合率为９９．８％。Ｗａｒｄ等【３０】，Ｗｉｔｔｅｒ等【３ｌ】和Ｓｔｕｍｍ 等【３２】以及国内也有类似报道，美国遗传学会认为ＦＩＳＨ可以进行常见染色体数目 异常的确诊，相比传统的核型分析具有较高的特异性和灵敏度。 目前有创性的绒毛取样，胎儿脐静脉穿刺取脐血及羊膜腔穿刺取的羊水， 三种方法来获得胎儿的组织检测某些遗传性疾病和先天性疾病，由于前两种方 法存在较高的导致流产和胎儿致畸的风险，以及技术要求高等原因，未能普遍 推广，而安全性高、简便、易操作推广的羊膜腔穿刺取羊水进行核型分析较为 普遍。而采用ＦＩＳＨ对未培养的羊水进行染色体非整倍体的检测是最近十几年发 展起来的，相对于核型分析，ＦＩＳＨ的优点如前所述，且在短时间内出报告，可 以极大的缓解孕妇的焦虑情绪，帮助临床医师及时做出治疗性的决策【３３，３４】。 ＦＩＳＨ应用于产前诊断，降低了先天性缺陷病患儿出生率，在孕早期即可减 少患儿的出生，利国利民，实现优生优育。但是ＦＩＳＨ不能检测复杂的染色体移 位及其他染色体复杂结构病变，因此我国仍将ＦＩＳＨ技术与传统核型分析技术相 结合进行产前诊断。２．３ＦＩＳＨ与灌洗宫颈收集的滋养细胞 据报道【３５】在胚胎受精后的５～１５Ｗ之间进行官腔灌洗可获得大量滋养细胞。１９７１年Ｓｈｅｔｔｌｅｓ［３６】曾经报道有胎儿滋养细胞从胎盘脱落至子宫颈管，并通过收集 宫颈管内胎儿滋养细胞辨别胎儿性别获得成功。Ａｄｉｎｏｌｌｆｉ和ＳｈｅｒｌｏｃｋＥ３７】在１９９５年 报道了对经收集宫颈取样滋养细胞标本进行ＦＩＳＨ分析诊断了２１．三体和另外１例 三倍体畸形。随后Ｓｈｅｒｌｏｃｋ［３８１又在１９９７年报道了ＦＩＳＨ对宫颈滋养细胞取样成功 检测出了２ｌ、１８染色体三倍体，及性染色体非整倍体异常。国内此方面研究起 步比较晚，１９９８年赵林淑等【３９１通过宫腔灌洗回收滋养细胞并通过阿的平荧光染 色，证明了Ｖｄ，体的存在，也证明了宫颈灌洗确实能得到胎儿细胞。２０００年王明泉３２综述等【４０】应用ＦＩＳＨ技术检测宫颈粘液细胞涂片，成功的对胎儿性别进行了检测，有 利于伴性遗传病的产前诊断。２００６年黄莺莺等【４１】通过对不同的宫颈取样方法比 较，论证了在孕５０～７９天宫腔灌沈收集胎儿滋养细胞的无创性和可行性。也有 通过对宫颈细胞取样对血红蛋白病及地中海贫血等分子疾病的诊断的相关报道［４２，４３］ｏ灌洗宫颈收集滋养细胞优点是：在孕早期即可进行；方法简便；获得的滋 养细胞较多，得到的胎儿遗传物质较多。缺点：虽为无创性，但存在冲洗液进 入宫腔