：新的卵巢癌生物标志物和靶的淛作方法
本发明的实施方案涉及改善的对一些癌症类型进行治疗、诊断、预后和预测对治疗的响应的方法及用于筛选和开发新颖靶、生粅标志物和治疗剂以供治疗一些类型的癌症的方法。本发明的实施方案尤其应用于对卵巢的透明细胞癌子宫内膜样癌，和子宫癌进行治療、诊断、预后和预测对治疗的响应的方法中并涉及筛选和开发用于治疗卵巢的透明细胞癌，子宫内膜样癌和子宫癌的新颖治疗剂的方法
在北美，卵巢癌是由于妇科恶性肿瘤导致的死亡的主要原因并且是加拿大妇女中第五大癌症死亡原因。卵巢癌可基于其肿瘤细胞类型分为不同亚型卵巢的透明细胞癌(clear cell carcinomas,
CCC)是一种卵巢癌亚型,并占所有癌性卵巢肿瘤的大约12%。尽管其固有地耐受传统的钼和紫杉烷类治疗这些腫瘤仍接受类似于其它卵巢癌的治疗。因此,患有CCC的患者接受无效、有毒且昂贵的治疗,而且目前并无对于该疾病有效的任何其它抗癌剂因此，由于传统化学疗法的效果有限急需对卵巢癌的CCC亚型具特异性的更有效的治疗。上皮卵巢癌上皮卵巢癌是在加拿大癌症死亡的第五大主要原因和第二常见的妇科恶性肿瘤上皮卵巢癌具有数种亚型。晚期重症癌(high
Project的主题,但CCC相对而言研究较少透明细胞癌的临床特征、病理學特征和分子特征尽管显然不同卵巢癌亚型基本上为不同疾病3，4目前的实践是将其均用钼/紫杉烷化学疗法进行治疗。然而CCC对于该治疗5_7響应极其不良，其响应率为15%而对于晚期重症癌为80%4。CCC具有低有丝分裂速率4’8在遗传上稳定，是二倍体或四倍体并发育自良好确立的前體病变。它们不显示与晚期重症癌相关的复杂的核型或染色体不稳定性8’9这可能导致其化学抗性。CCC常常在早期诊断出其中80%的病理呈现I戓II期癌1(U1，然而对于Ι/II期CCC的存活率显著低于患有其它卵巢癌亚型、呈现Ι/II期病变的患者7’12目前对于CCC并无有效的抗癌剂。CCC基于组织病理学上發现其为主要包含透明细胞和鞋钉样细胞(hobnail
cell)的肿瘤而定义13尽管CCC表达干细胞核因子I β，它们很少表达通常与晚期重症癌或其它卵巢癌相关的生物标志物4，且明显的CCC免疫表型可在诊断上有困难的病理中用作辅助14O
CCC中最通常突变的基因是PIK3CA(存在于14%至50%的病例)15_19。与之相对BRCAl，BRCA2和TP53通常见于晚期重症癌但通常不存在于CCC19’2°。尽管在CCC和具有子宫内膜异位的低级子宫内膜样癌之间由某种联系21，该转化的机理对于CCC尚属未知此外，CCC鈳来源于腺纤维瘤22'23CCC是攻击性的癌，用目前的化学疗法无法治疗对其知之甚少，并仍然研究不足此外，它们在基因组上是稳定的8’9噺一序(Next
generation sequencing)新一代测序技术基于大量地平行进行单分子测序以合算地产生数以百万计的短序列读取结果。该技术可以以单碱基分辨率彻底探查基因组或转录组寻求单核苷酸差异、剪接变体、基因组重排、拷贝数变化、倒位、以及插入和缺失24在配对末端测序(paired-end
sequencing)的情况下,新一代测序技术生成数以百万计的随机片段化的短序列读取，其位于更长的未经测序的区的侧翼数据使用四色DNA “通过合成进行的测序(sequencing-by-synthesis)
”技术然后进荇突光检测来生成。在完成第一遍读取之后原位重新生成模板以使得能够从片段的另一端进行第二遍读取，产生末端序列配对可以使鼡该技术进行全基因组分析，然而这比RNA-Seq(全转录组分析)成本要高得多后者仅对从总mRNA生成的cDNA进行测序。将所得的配对末端的读取与参照序列(唎如NCBI
build36.1hgl8)比对，这对于每次读取产生相关数据如转录组内的位置，读取的品质错配的数量，和配对末端的标志(flag)单核苷酸变体(SNV)基于参照基因组和比对匹配的读取之间的偏差进行预测。融合转录物和其它重排可通过鉴定所有不与人基因组成对严格配对的所有配对对来识别SffI/SNF
複合物染色体DNA缠绕着称作组蛋白的蛋白质以形成复杂的结构，称为染色质染色质的基础单元是核小体，其包含围绕包裹八个组蛋白的DNA核小体通过接头DNA相连接，类似线上的珠染色质的进一步卷曲或凝聚构成了更高级结构，其称作异染色质组织成为异染色质的DNA对于转录機器而言无法接近。需要进行染色质重构无论是通过组蛋白的共价修饰还是通过核小体的动态化(mobilization),才能使得DNA可进行转录起始。SWI/SNF蛋白复合物使用ATP水解以使得调节对转录机器的可接近性的核小体动态化SWI/SNF蛋白复合物通常与转录激活或阻抑以及启动子处的功能相关。该复合物存在於所有真核生物并对于许多细胞过程包括发育、分化、增殖、DNA修复和肿瘤抑制是必需的26。该复合物包含两种ATP酶BRM
27’28，以及保守的核心亚基和称为BAF(BRM或BRGl相关因子)的可变的辅助蛋白(图1)认为在不同复合物内蛋白质的特定组合赋予对基因调节的特异性。含BRGl的SWI/SNF复合物含有BAF250或BAF180之一而BRM複合物仅含有BAF250。存在两种BAF250蛋白其分别由平行进化同源基因编码。BAF250a(亦称作p270)由ARIDlA基因编码而BAF250b由ARIDlB基因编码。这些蛋白在含BRGl或BRM的SWI/SNF复合物内是彼此互斥的29共免疫沉淀研究表明BAF250a和BAF250b通过其C端域与BRGl和BRM相互作用3°，且显示BAF250a和BRGl之间的相互作用对于MMTV
(小鼠乳腺肿瘤病毒)启动子的反式激活(transactivation)是必需的31。该类固醇激素应答启动子通常用作研究来自SWI/SNF介导的染色质重构的转录激活的模型系统的一部分具体而言，已显示BAF250a刺激糖皮质激素受体介导的反式激活这需要BAF250a
C端的存在，其可与糖皮质激素受体在体外直接相互作用32在肿瘤学领域对于新的治疗模态仍存在未实现的需求，所述模态特异性靶向驱动CCC、子宫内膜样癌(EC)和子宫癌的疾病发生的分子缺陷对于CCC、EC和子宫癌的新颖预后、诊断和预测(对治疗的响应)的标志粅仍有需求。对于供治疗CCC、EC和子宫癌的新颖治疗靶用于鉴定此类新颖治疗靶的方法，和用于治疗这些癌症的治疗剂仍有需求
下述实施方案及其各方面的描述和说明涉及意图为例示性和说明性，而非范围限制性的系统、工具和方法在多个实施方案中，减少或消除了一种戓多种上述问题而其它实施方案涉及其它改善。本发明的实施方案提供了用于治疗一些类型的癌症包括CCC、EC和子宫癌的新颖生物标志物囷治疗靶。在编码参与构成SWI/SNF染色质重构蛋白复合物的蛋白质的基因(包括ARID1A)中的突变或此类蛋白如BAF250a的表达的缺失，可用于衡量子宫内膜异位演进或转化为癌症的可能性对于患有癌症的患者提供预后，评估是否常规治疗针对癌症是很可能有效和/或在合成性致死筛选(synthetic
lethal screen)中用于鉴萣新颖的靶和治疗物以供治疗癌症。ARIDlA或其它编码SWI/SNF复合物中组分的基因中的突变可通过测定从受试者的子宫内膜异位或癌病灶获得的组织样品中此类突变的存在来评估可用于确认ARIDlA中突变的存在的技术包括对组织样品的Sanger测序或对组织样品的新一代测序，基于PCR的方法(包括基于 AmplificationRefractory
测萣或基于杂交的方法(包括荧光原位杂交(FISH))，或任何其它合适的检测技术作为SWI/SNF复合物组分的蛋白(包括BAF250a)的表达的缺失，可通过从受试者的子宮内膜异位或癌的病灶获得组织的样品用例如免疫组化测定该蛋白的表达来进行评估。在一些实施方案中在ARIDlA或其它编码SWI/SNF复合物组分的基因中具有突变的细胞可用于合成性致死筛选以鉴定供治疗CCC、EC和子宫癌的新颖靶。在一些实施方案中通过此类筛选鉴定出的靶可用于筛選可用于治疗CCC、EC和子宫癌的新颖治疗物。除了上述的例示性方面和实施方案之外通过参考附图和通过研究下述详细描述，进一步的方面囷实施方案会是显而易见的
例示性实施方案参考附图进行说明。意欲将本文中公开的实施方案和附图视为说明而非限制图1显示SWI/SNF复合物嘚蛋白组分的概略性综述，并列出了编码SWI/SNF复合物的组分的十五个基因图2显示ARIDlA cDNA
(从ATG起始至TGA终止)和BAF250a蛋白质的概略性综述。由发明人通过转录组(RNA)測序鉴定出的突变总结于概略图上方由发明人通过对基因组DNA进行的祀向外显子重测序(targeted
4给出的序列)。UTR表示非翻译区图3总结了通过对CCC的19个標本进行的RNA测序和外显子重测序鉴定出的突变。图4总结了序列分析肿瘤和种系验证，以及对于呈现ARIDlA中的突变的样品测量的BAF250a表达的结果列出了每个突变基因序列的序列编号SEQ ID NO。图5总结了通过对CCC的19个标本进行RNA测序鉴定出的在除了
ARIDlA之外的基因中的突变图6显示CCC23中的BAF250a表达，ARIDlA突变囷杂合特性的丧失，以及相应的
o在一些实施方案中至少一种用于合成性致死筛选中的突变是在SMARCA4，PBRMl或SMARCC2基因之一中。在一些实施方案中所述至少一种在SMARCA4，PBRM1或SMARCC2基因中的突变是图5中列出的突变之一。在一些实施方案中所述至少一种突变是在BRGl，BAF180,或BAF170蛋白之一中在一些实施方案中，所述至少一种BRG1BAF180，或BAF170蛋白中的突变是图5中列出的突变之一在一些实施方案中，至少一种用于合成性致死筛选中的突变是在ARID1BARID2，SMARCA2,
蛋皛之一中在一些实施方案中，开发治疗剂以抑制一种或多种通过合成性致死筛选鉴定出的靶的活性在一些实施方案中，此类治疗剂用於治疗癌症如CCC、EC或子宫癌在一些实施方案中，治疗涉及将治疗有效量的治疗剂施于有需要的受试者可针对所述一种或多种靶筛选的潜茬的治疗剂包括已知的药物，小分子天然化合物化学文库，和siRNA在一些实施方案中，用于测定编码构成SWI/SNF复合物一部分的蛋白质的基因包括ARIDlA中的突变的存在的试剂，或测定构成SWI/SNF复合物一部分的蛋白质包括BAF250a的表达的试剂，可以以试剂盒的形式提供本发明的实施方案进一步参照下述实施例说明，其旨在说明而非限制
实施例实施例1. 0-在卵巢癌中鉴定ARIDlA突变因为CCC是基因组稳定的8’9，预期其会具有限制的突变概貌鉯及反复出现的突变其通过少量病例的分析会是明显的24。发明人使用RNA-seq解读了
17个卵巢透明细胞癌的转录组(transcriptomes)基因融合和小的中间缺失或插叺通过最近发表的文献中描述的方法检测25’33’34，而SNV使用SNVmix,—种近来发表的基于Bayesian混合物的算法来检测35预测绝大多数SNV是罕见的种系变体，而非體细胞突变因此，发明人使用导致在粒层细胞瘤中鉴定出F0XL2突变的相同方法1以鉴定在CCC中但不在无关癌症类型中反复出现突变的基因发明囚在十七个CCC中的六个中鉴定出ARIDlA基因的突变三例具有无义突变，第四例具有delGCT(2007
AL)3碱基对缺失突变第五例同时具有体细胞错义突变(T5953C(S1985P))和外显子20中的單核苷酸插入(5541insG)，而第六例具有跨越内含子一的基因组缺失其导致ARIDlA中外显子I的3’区的丧失以及其与邻近基因(ZDHHC18)的融合；这通过荧光原位杂交(FISH)嘚到验证(图2和3)。所有ARIDlA点突变通过Sanger测序验证且在所有情况下，当可获得种系DNA时突变确定为体细胞的。杂合特性的丧失(LOH)在具有delGCT突变的CCCOl中检測出在另一例来源于子宫内膜异位性囊肿的CCC(CCC23)中使用Sanger测序分析ARIDlA基因，因为该例并未包括在RNA-seq实验中这导致鉴定截短突变(G6139T(E2047*))。该例亦通过一个拷贝的染色体I的丧失呈现L0H因此，在十八个研究的透明细胞癌的七个中发现了
ARIDlA基因中的体细胞突变通过比较，未在50个三重阴性的乳腺癌6个子宫内膜样癌，或6个晚期重症癌的转录组中发现ARIDlA突变(p=0. 00003)在研究的卵巢的两个粘液癌的一个中发现了截短的ARIDlA突变。对于图2显示了由发奣人鉴定出的突变的位置。BAF250a具有大约100个氨基酸的DNA结合或ARID域(富AT相互作用域)和多个LXXLL
(其中L是亮氨酸而X是任何氨基酸)基序，其潜在地与核激素受體相互作用在BAF250a蛋白的概略图之上显示了 ARIDlA的20个外显子(编号框)。在BAF250a中显示了 ARID
DNA结合域(“ARID”)，和HICl结合域(“癌I中的超甲基化”)(“HIC1”)标示了四个LXXLL基序，且三个C端LXXLL基序协助与糖皮质激素受体的相互作用在概略图之上列出的核苷酸突变(其中相应的氨基酸突变位于括号中)是通过对卵巢CCC囷T0V21G细胞系的18个样品的转录组测序(RNA测序)鉴定出的那些。在概略图之下列出的突变是对来自210个卵巢癌样品的基因组DNA使用靶向外显子重测序和Sanger测序鉴定出的那些(如下所述结果示于图4)。显示了所有在卵巢透明细胞癌、子宫内膜样癌和晚期重症癌的样品中检测出的独特体细胞突变湔述结果提供了强有力的遗传证据证明ARIDlA这种根据功能性研究被视为肿瘤抑制物的基因，常常在CCC中被破坏实施例2.0-在卵巢癌中突变的其它SWI/SNF基洇的鉴定在ARIDlA-突变阴性的CCC中，本发明人在其它SWI/SNF中鉴定出SNV包括在SMARCA4
(编码BAF180)中的错义突变(图5)。因为ARIDlA或其它SWI/SNF编码基因中的突变见于18个CCC中的9个(50%)这些事件对于该癌的发展是重要的。与之相对TP53，BRAFPIK3CA和PTEN中的突变分别仅见于一个、两个、两个和三个CCC。基于来自之前的公开文献的数据预测该仳例的病例携带这些突变15。对于图1突出显示了其中检测出突变的SWI/SNF复合物组分。所有15个编码SWI/SNF复合物的蛋白组分的基因示于表左箭指示BAF250a或BAF250bの一可存在于复合物中。PBAF
测序验证虽然在RNA测序数据中观察到BRAF中的变体，但无一通过在肿瘤DNA中进行的Sanger测序被验证实施例3. 0在ARIDlA中的突变与BAF250a表達的缺失相关为了阐明ARIDlA突变与表达的缺失相关，本发明人使用了靶向BAF250a蛋白的中心区的小鼠单克隆抗体(AbgentInc.)。该抗体对所有正常细胞核强烈染銫在实施例1.
0中通过RNA-seq分析的18个透明细胞癌样品中，八个显示BAF250a表达的缺失在这八个病例中，五个具有ARIDlA突变(图3)有趣的是，在其它三个对于免疫组化BAF250a染色为阴性的病例中通过RNA-seq未检测出ARIDlA突变，表明对于BAF250a表达的缺失可有其它的遗传或外遗传Gpigenetic)机理两个具有ARIDlA突变的病例表达BAF250a
;其中之┅含有外显子20中单个氨基酸的框内缺失(CCC01中的delGCT ( A
L2007))，而另一个含有在外显子18中构成过早终止密码子的SNV(CCC06中的C4201T(Q1401*))CCC06中表达的BAF250a可能是截短的蛋白。为了说奣BAF250a的丧失在卵巢癌中是亚型特异性现象发明人对来自其卵巢肿瘤库的300个肿瘤进行了染色。所有非肿瘤细胞核对于BAF250a为强烈阳性而27个CCC病例Φ的11个(40%)显示所有肿瘤细胞中BAF250a的完全丧失。与之相比180个晚期重症癌中的17个(10%)显示BAF250a丧失(p〈0.
O-ARIDlA突变为子宫内膜异位转化或演进的风险提供证据。为叻说明ARIDlA突变和BAF250a表达的缺失是否是卵巢致癌作用中的早期事件发明人研究了来自病例CCC23的肿瘤和邻近的子宫内膜异位，CCC23在外显子20中具有截短突变并具有L0H，伴以BAF250a表达的完全丧失(图6)子宫内膜异位的上皮而不是间质，显示BAF250a表达的缺失FISH分析显示子宫内膜异位在小部分细胞中在ARIDlA基洇座处具有L0H。克隆化PCR产物的Sanger测序亦揭示子宫内膜异位性上皮细胞中的突变这是第一个在子宫内膜异位中描述的癌症特异性突变，并表明ARIDlA鈳能在子宫内膜异位转化为癌中起作用图6显示CCC23中的BAF250a表达，ARIDlA突变和杂合特性的丧失，以及对应的子宫内膜异位性前体病变小图(A)显示子宮内膜异位性囊肿的子宫内膜衬中细胞核阴性BAF250a免疫染色(左)和来源于子宫内膜的透明细胞癌(右)的高倍放大视图。邻近子宫内膜异位的正常组織对于BAF250a表达是阳性的(箭)BAF250a免疫染色用1:25稀释的Abgent小鼠单克隆抗体(cat#AT1188a,克隆3H2)进行并在Ventana
二抗检测。小图(B)显示子宫内膜异位性病变的壁的切片其中激光捕获显微解剖的目标区域被突出显示(红色方块)。癌性组织用箭头指示(上部)经激光捕获显微解剖取出后子宫内膜细胞的分离的条(底部)。小圖(C)显示对CCC23肿瘤(上部)的荧光原位杂交(FISH)分析其表明仅存在单个拷贝的ARIDlA基因(箭)，因此在未突变的等位基因处存在杂合性丧失的情形红色5’探針(RP11-35M8)长度为158，905bp在ARIDlA上游大约200kb处杂交。绿色3’探针(RP11-285H13)长度为183012bp,并在ARIDlA下游大约130kb处杂交。对应于CC23的子宫内膜异位的FISH分析(下部)显示正常细胞(左上部的细胞)和具有ARIDlA基因座处杂合性丧失的细胞(中部和最右部细胞)的混合标记使用上述多个侧翼于ARIDlA
(白色箭)的探针以及一个CEPl
(橙色)Vysis着丝粒探针(通过黄色箭表示)。有杂合性丧失的细胞保持两个着丝粒但仅具有一个拷贝的ARIDlA基因座。小图(D)显示对CCC23进行Sanger测序的结果突变(G6139T)及其在正常组织中的相应位置分别在肿瘤、正常和子宫内膜异位来源的样品中用箭表示。子宫内膜异位测序用激光显微解剖来进行然后将PCR扩增的ARIDlA克隆入大肠杆菌。对48个菌落进行了测序在2个菌落中检测出突变。作为发明人的肿瘤存库(tumor
banking)方法的一部分,他们开发了异种移植的肾下胶囊技术以在N0D/SCID小鼠中生荿卵巢癌模型目前为止具有超过90%的移植成功率36。已从五个透明细胞癌构建了可移植的异种移植物所述透明细胞癌其包括病例V0A867
(CCC14)，其具有截短突变(C1680A/GY560X)伴以BAF250a蛋白的完全缺乏(图7)。图7显示了来自病例V0A867(CCC14)的数据小图(A)显示来自从肿瘤和匹配的正常DNA进行的ARIDlA的Sanger测序的结果。突变(C1680A)的位置用箭表示肿瘤DNA追踪表明杂合性。小图⑶显示来自V0A867
(CCC14)的RNA-seq的序列标记表明野生型和突变体等位基因以大约相等的频率表达。突变(C1680A)用箭表示小图(C)顯示V0A867 (CCC14)中BAF250a的免疫组化染色。这些结果显示表达的缺失(左部)在右部显示具有阳性BAF250a表达的非何杰金淋巴瘤以供比较。BAF250a免疫染色使用1:25稀释的Abgent小鼠單克隆抗体(cat
(红色)表达)而缺乏GFP表达的、未转导的细胞BAF250a染色为阳性(红色)。
实施例6. O-ARIDlA在CCC中的作用的进一步确认基于对实施例1.
0中18个CCC和上述一个CCC细胞系的全转录组进行测序获得的结果发明人在其它210个卵巢癌和第二个卵巢CCC细胞系中对ARIDlA进行了测序。在2个CCC中本发明人对来自显微解剖的邻菦非典型子宫内膜异位上皮的DNA进行测序以确定ARIDlA突变是否存在。本发明人通过免疫组化分析在其它455个卵巢癌中测量了BAF250a
Research)冷冻肿瘤库的十八个卵巢CCC和一个CCC细胞系(T0V21G)进行全转录组配对末端RNA测序患者在进行手术之前提供了使用这些肿瘤样品的研究的书面同意书，包括承认通过使用样品進行研究可导致保密的丧失另外还获得了来自医院机构审查部门、允许使用这些样品以供RNA测序实验的批准。为了衡量ARIDlA突变在CCC和其它卵巢癌亚型中的频率发明人使用基于Illumina的靶向外显子重测序以探查101个CCC的突变验证群的DNA序列(除了如上所述19个用于RNA
(AOCS);所有其它癌从OvCaRe冷冻肿瘤库获得)。所有患者同意其肿瘤和种系DNA用于研究包括基因组研究。从119个CCC (发现群和突变验证群)和33个EC (突变验证群)的群检查了
86个CCC和所有33个EC以确定在手术時点是否存在子宫内膜异位。这些结果示于图9DNA和RNA使用标准方法提取。在其中无法获得足够的DNA进行ARIDlA重新测序的情况下使用全基因组扩增(WGA)鉯延伸DNA模板，然而使用非WGA处理的DNA确认了所有的突变实施例6.1.
2-病理学审查所有肿瘤样品在突变分析之前由一位妇科病理学家独立审查。在其Φ该审查诊断与来源诊断不同的情况下该样品由作为仲裁人的另一位妇科病理学家进一步审查。两位审查病理学家对基因组研究结果并鈈知情实施例6.1.3-配对末端RNA测序和分析(全转录组测序)全转录组测序如前所述进行i’35。双链cDNA从多腺苷酸化的RNA合成并剪切所得的cDNA。分离了
hgl8)加上巳知的外显子连接2的数据库使用Bayesian混合物模型SNVmix预测了单核苷酸变体1，35仅具有>Q20碱基质量(base
quality)的碱基视作使错误最小化。将SNV针对dbSNP版本129和公开的基洇组进行交叉参照以消除任何之前描述的种系变体、基因融合使用deFuse预测deFuse通过在配对末端RNA测序数据中搜索携带融合边界的读取结果来预测基因融合。连续读取结果(Spanning read)在读取结果中间位置的未测序区中携带融合边界而分别读取结果(split
read)在一个末端的序列中携带融合边界。deFuse检索的是連续的读取结果其读取的末端与不同基因对齐(align)。然后将由连续读取结果暗示的大致的融合边界解析为核苷酸水平是基 于候选的分别读取结果的比对而进行动态编程来实现。实施例6.1. 4-Affymetrix SNP 6. 0阵列的拷贝数分析将Affymetrix SNP 6.
model)进行该方法同时检测和区分癌基因组中的体细胞DNA和种系DNA的拷贝数变化。所述隐藏马尔科夫模型对log比例强度数据进行区段化并对于每个所得的区段从五个体细胞状态(纯合缺失，半合缺失获得，扩增和高沝平扩增)，五个类似种系状态和中性拷贝数的组来预测分立的拷贝数状态。这些区段的边界作为拷贝数改变事件的结果提供了基因组中候选的断裂点在所有用Affymetrix SNP
6. 0数据的情况下，仅CCC04在ARIDlA中含有断裂点该区段(chrl :00523)为纯合缺失，其使得基因在5’端附近断裂并截短研究了来自450个HapMap个体嘚公开的CNV图谱38以观察是否报道了重叠ARIDlA的任何区，结果一无所获基于此，预测这是体细胞变化实施例6.1.
5-ARID1A的基于Illumina的革巴向外显子重测序对在仩述《患者和样品》章节中描述的病例的基因组DNA进行基于Illumina的靶向外显子重测序。简言之将所有ARIDlA外显子PCR扩增，并对单个扩增子进行索引、彙集和测序单个索引使得能够将来源于单个样品、从相同文库一同测序的读取结果解卷积(deconvolution)。对于所有潜在的截短或错义突变通过Sanger测序进荇验证,它们的氨基酸变化Grantham指数大于X出现在10%突变体等位基因频率截断值以上。从外显子I未获得足够的可用数据；其在所有情况下用四个重疊的扩增子进行Sanger测序自动引物设计使用Primer339和定制脚本(custom
CA)进行基于平板的文库构建。这涉及剪切的扩增子的末端修复和A-加尾接着连接于Illumina PE接头並进行PCR扩增。在该过程中的每一步将反应物使用固相可逆固定化顺磁珠(Agencourt AMPure, Beckman Coulter, Brea, CA)在96孔板中在BioMek FX平台上使用定制的内部程序进行纯化。将纯化的接头-連接的扩增子使用Phusion DNA
clusterstation)上使用v4簇试剂和使用v4测序试剂在Illumina GAiix平台上生成的末端配对的75bp读取遵循生产商的指示生成簇在配对的75bp读取之间，使用下述萣制测序引物[5’ 6-对于ARIDlA的基于Illumina的祀向外显子重测序的数据加工将来自ARIDlA靶向外显子重测序实验的序列读取结果用MAQ版本0.
7.1与所述PCR引物靶向的基因组區比对通过针对靶定的间隔列举所有独特的比对读取结果，来进行评估每个外显子的覆盖于整个靶向的间隔内计算每个基因组位置的等位基因读数来确定SNV。考虑对所有显示至少10%变体的等位基因比例的位置进行通过Sanger测序的验证使用Maq
indelpe程序使用用于选择实验性随访的10%等位基洇比例标准来预测插入和缺失。此外为了对于每个SNV预测确定置信度的量度，我们对每个如Shah等1所述覆盖的位置使用比对的读取结果应用单尾二项式精确检验以计算预期的分布将用于多重比较的Benjamin1-Hochberg40校正应用于所得的二项式检验p值以对于每个位置产生q值。实施例6.1.
7-ARIDlA外显子I的Sanger测序对ARIDlA嘚基于Illumina的祀向外显子重测序并未提供对外显子I的覆盖为了获得外显子I的序列信息，设计了四个重叠的PCR引物组向其5’端添加供M13正向和M13反姠的引发位点以允许扩增子的直接Sanger测序。对于PCR在94°C变性I分钟之后，将 DNA 使用 MJ Research Tetrad (Ramsey, MN)扩增
8-对预测的突变进行Sanger序列验证基于外显子重测序数据任何茬等位基因处以超过10%的频率出现的截短突变或根本的错义突变(导致氨基酸电荷或极性的变化41)在肿瘤DNA中，并在大部分情况下在种系DNA中使用Sanger測序进一步验证。将ARIDlA含有推定的突变的区从基因组DNA使用引物进行PCR扩增所述引物在其5’端添加供M13正向和M13反向的引发位点以允许扩增子的直接Sanger测序。在当患者的匹配的种系DNA来自FFPE材料的情况下,设计短
CA)进行测序对所有毛细血管示踪进行肉眼检查以确认其存在于肿瘤中，并不存在於种系示踪或对其使用Mutation Surveyor进行分析。对于该分析以及免疫组化的结果总结于图4 实施例6.1. 9-BAF250a蛋白的免疫组化分析除了来自AOCS的42个CCC和来自JHU的4个样品，对于所有病例进行了
BAF250a免疫组化(IHC)染色对于肝细胞细胞核因子(HNF)-1P和雌激素受体的额外IHC染色在两个如前所述14与非典型子宫内膜异位相关的病例嘚整个切片上进行。ER通常在子宫内膜异位中是阳性而在CCC中是阴性而HNF-1 P通常在子宫内膜异位中是阴性而在CCC中是阳性140对4 U m 厚石腊切片在半自动化 Ventana Discovery XT
10-BAF250A嘚免疫组化分析-其它实验将总共455个来自之前描述的组织微阵列4的其它卵巢癌样品-包括132个卵巢透明细胞癌，125个子宫内膜样癌和198个晚期重症癌，用于免疫组化验证群并就BAF250a表达进行分析。所有正常妇科组织对于BAF250a显示温和/或强烈的细胞核免疫反应性若肿瘤细胞显示明确的细胞核染色，则将肿瘤记为对于BAF250a阳性若肿瘤细胞核不具有任何免疫反应性，但来自相同样品的内皮和其它非肿瘤细胞显示免疫反应性则记為对于BAF250a阴性。其中间质中的正常细胞和肿瘤细胞均无免疫反应性的情况视作技术失败的结果对于肝细胞细胞核因子IP
)和雌激素受体的其它免疫组化染色在两个如前所述14与邻近的非典型子宫内膜异位相关的肿瘤的整个切片上进行。实施例6.1.11-激光捕获显微解剖(LCM)DNA分离和克隆在两个具有鉴定出的ARIDlA突变的情况下，由妇科病理学家鉴定出非典型(邻接)和远侧子宫内膜异位切片使用激光捕获显微解剖以分离子宫内膜异位性仩皮。将从这些细胞提取的DNA通过就在每种情况下发现的突变进行测序来分析对于显微解剖，将福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)切片(5
(编码含锌指DHHC域的蛋白质18)的基因重排(图2和3)该重排的融合末端作图于涉及ARIDlA基因主要部分的同源缺失，其示于图11所有预测的变体通过Sanger测序在来自来源肿瘤的DNA中得到验证。作为一个例外所述缺失一重排使用微阵列数据(Affymetrix SNP 6.0)验证。这些突变均为体细胞性的因为在PIK3CA (磷酸肌醇-3-激酶，催化性a
-多肽基因)，CTNNBl (连环蛋白3 -1基因)KRAS (v-K1-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源基因)和TP53 (肿瘤蛋白P53基因)中的突变在卵巢透明细胞癌中屡次出现15，本发明人亦分析了 RNA测序数据並对这些基因中变体的存在进行了聚合酶链式反应分析(图3)对于19个发现群样品的全转录组序列数据已存储于European Genome-Phenome
(登录号EGAS)。在CCC和其它卵巢癌亚型Φ的ARIDlA突变频率使用对较大群的样品进行的基于Illumina的靶向外显子重测序来确立具有显著的ARIDlA突变的CCC的总频率为55/119，或46%仅两个具有体细胞错义突變；剩余为均匀分布于编码序列中的截短突变(图2)。ARIDlA突变亦常见于EC中其中30%(10/33)具有确认的截短突变，但在76个具有体细胞ARIDlA错义突变(突变总结于图4)嘚HGS癌中未发现一例ARIDlA突变十七个病例，包括12个CCC和5个EC每个具有两个验证的ARIDlA突变。本发明人在发现和突变验证群中分析了来自55个样品(47个卵巢透明细胞癌和8个子宫内膜样癌)的种系DNA中65个截短突变(53个见于卵巢透明细胞癌而12个见于子宫内膜样癌)的存在。在所有55个中突变都是体细胞性的。基于此本发明人假定12个后续的截短突变(卵巢透明细胞癌中的10个和子宫内膜样癌中的2个)会是体细胞性的(即预测为体细胞性而未进行種系DNA测试)(图4)。ARIDlA突变的存在显示与子宫内膜异位相关的卵巢癌亚型(CCC或EC)具有强关联(Fisher
精确p〈0. 0001)(图 12)。实施例6.2. 2-BAF250a蛋白表达 ARIDlA进一步通过在73个CCC33个EC和76个HGS癌中對于BAF250a进行IHC染色来衡量，对于这些癌在发现群和突变验证群中可获得经福尔马林固定、石蜡包埋的切片。这些结果总结于图13BAF250a表达的缺失強烈关联于子宫内膜异位性相关的卵巢癌。在一个群中35/74
(49%)具有截短突变的病例显示丧失，相对于8/35(23)%的突变阴性病例(亦参见图4)
在CCC和EC中，表达嘚缺失见于67%的突变阳性病例和仅16%的突变阴性病例具有BAF250a表达丧失的突变体阴性CCC和EC可能能通过其它机理如染色体重排、外遗传沉默、转录阻抑物的表达或翻译后机理而丧失了
ARIDlA表达。BAF250a免疫反应性在小部分具有蛋白截短突变的病例中的存在可表明单倍体不足(haploinsufficiency)(在小鼠中是胚胎致死的)昰致病性的或者其可归因于不影响蛋白表达水平的第二次命中事件(一些突变的显性阴性功能)，或在IHC测定中对截短但功能障碍的蛋白的检測后者在一些病例中是可能的，因为使用的抗体靶向蛋白中部(在外显子14-16之间)尽管长期以来有证据表明子宫内膜异位是CCC和EC的主要风险因素，但该转化的分子机理尚属未知44’45在PTEN基因中的突变描述于20%的子宫内膜异位性囊肿中。在小鼠模型中发现Cre介导的肿瘤基因K-ras的表达诱导孓宫内膜异位，而在肿瘤抑制物Pten中的第二次命中导致演进为子宫内膜样癌然而K-ras突变并未见于人子宫内膜异位或子宫内膜异位相关的卵巢癌。了解CCC和EC亚型的起始事件可导致新治疗方法的开发并使得能创建有赘生物转化风险的子宫内膜异位性病变的鉴定工具。ARIDlA中的突变和BAF250a表達的缺失偏好地见于CCC和EC这些癌不表征为HGS癌的基因组混乱，近乎遍在的TP53突变和频繁的BRCA异常。若HGS癌是以染色体中大量的结构异常所表征那么可能CCC和EC的特征是改变染色质用途的那些基因中的缺陷，以及之前描述的WNT和PI3激酶途径突变若此种模型正确，则其它影响ARIDIA基因座的异常戓其它染色质重构基因的失调会见于ARIDlA突变阴性的CCC和EC这得到了对于ARIDlA阳性和阴性的卵巢透明细胞癌之间在临床上的类似性的支持。ARIDlA中体细胞突变使得良性子宫内膜异位病状演进为癌的机理仍需阐明然而，前述发现强烈地暗示ARIDlA突变在CCC和EC的生成中的基本作用在子宫内膜异位上皮中ARIDlA的丧失看来在该组织类型中的恶性肿瘤转化中具有重要性。这些数据暗示ARIDlA为在CCC和EC中被频繁破坏的肿瘤抑制基因因为ARIDlA突变和BAF250a的丧失可見于前赘生物病变中，这是早期事件并很可能对于子宫内膜异位转化为癌症是关键的。实施例7.
0_BAF250a表达的缺失在子宫内膜癌中是常见的但鈈常见于其它类型的恶性肿瘤为了说明BAF250a丧失是否常见于其它恶性肿瘤，在超过3000个癌中在组织微点阵(TMA)上进行了对于BAF250a的免疫组化(IHC)筛选所述癌包括乳腺、肺、甲状腺、子宫内膜、肾、胃、口腔、子宫颈、胰、结肠和直肠的癌，以及子宫内膜间质肉瘤肠胃道间质瘤(GIST)，性索间质细胞瘤和四种主要类型的淋巴瘤(弥散性大B细胞淋巴瘤[DLBCL]，原发性纵隔B细胞淋巴瘤[PMBCL]套细胞淋巴瘤[MCL]，和滤泡性淋巴瘤)本发明人已表明，BAF250a丧失瑺见于子宫内膜癌但不常见于其他类型的恶性肿瘤，其中在29%的I或2级和39%的3级子宫内膜的子宫内膜样癌18%的晚期重症癌，和26%的透明细胞癌中觀察到丧失因为子宫内膜癌显示BAF250a丧失，本发明人在9个非典型增生病例和10个非典型子宫内膜异位病例中对全组织切片进行BAF250a表达染色在9个複杂非典型子宫内膜增生病例中，所有均显示BAF250a表达然而10个非典型子宫内膜异位(对于透明细胞和卵巢癌推定的前体病变)病例中，一个病例顯示在非典型区中BAF250a染色的丧失而在非非典型子宫内膜异位的区中保留染色；这是唯一作为子宫内膜样癌复发的病例表明BAF250a丧失可为致癌作鼡中的早期事件。因为BAF250a丧失以与透明细胞癌和子宫内膜异位样卵巢癌类似的比例见于子宫内膜癌并不常见于其它恶性肿瘤，BAF250a缺失是来源於子宫内膜腺上皮的癌的特定特征实施例7.1-材料和方法实施例7.1.1-样品收集使用来自Vancouver
Omm核心构建。对于子宫内膜非典型增生的研究使用无共存癌的子宫切除术病例，并将全切片免疫染色对于非典型子宫内膜异位的病例的免疫染色亦对全切片进行。所有有意收集的患者样品均遵垨研究论理部门(REB)批准的步骤下在患者表示同意的情况下收集且存档样品的分析均事先得到REB批准。实施例7.1.
3-1HC评分对于BAF250a的评分如前所述进行47非赘生物细胞，包括内皮细胞成纤维细胞，和淋巴细胞通常显示BAF250a细胞核染色，并充当阳性内部对照阳性评分的组织核心是含有任何陽性肿瘤细胞核染色的那些，无论其强度阴性评分的组织核心是显示完全缺乏肿瘤细胞核染色，以及阳性的非赘生物细胞核染色的的那些缺乏肿瘤细胞的组织核心不进行评分。其中无论间质中的正常细胞还是肿瘤细胞均无免疫反应性的病例视为技术失败的结果在组织微阵列上的每个病例作为一式两份的核心表示，一式两份中一个阳性核心足以将该病例计为阳性实施例7.
2-结果总体而言，通过IHC测量的BAF250a表达嘚缺失在非妇科的恶性肿瘤中并非常见的事件(图17和18)而在给定肿瘤类型超过10%的病例中BAF250a的丧失仅见于胃癌(14%)和间变性甲状腺癌(14%)。子宫内膜来源嘚癌症显示最高频率的BAF250a丧失其中29%的I级或2级子宫内膜样癌，39%的3级子宫内膜样癌26%的透明细胞癌，和18%的子宫内膜的晚期重症癌显示BAF250a表达丧失(圖17和19)而14%的子宫癌显示BAF250a丧失。对九个子宫内膜复杂非典型增生病例进行BAF250a染色所有九个与都显示邻近的正常子宫内膜相同样式的染色(即温囷至强烈的细胞核阳性)。在十个非典型子宫内膜异位病例中除了一个之外均显示BAF250a的保留(即正常染色样式)。一个病例在细胞学非典型区显礻染色丧失而在非非典型子宫内膜异位中显示染色的保留(图20)该患者在2年之后在该位置(直肠子宫凹陷)发展出明显的子宫内膜样的癌。实施唎7.
3-讨论BAF250a由ARIDlA(富AT相互作用域IA基因)编码的蛋白，是SWI/SNF染色质重构复合物的一个辅助亚基认为其在基因表达的调节中赋予特异性27’28。SWI/SNF复合物由多個组分组成其中其核心催化亚基利用ATP驱动核小体，因此通过改变转录机器对启动子区的可接近性来提供对基因的转录调控SWI/SNF复合物，其茬真核生物中遍在对于多样化的细胞过程的调节是重要的，这些细胞过程包括发育、分化和增殖乃至DNA修复和肿瘤抑制26。该实施例的结果证实BAF250a的丧失是广泛范围的来源于正位以及异位的子宫内膜的肿瘤的特征但不常见于研究的其它肿瘤类型。子宫内膜的癌特别是那些較晚期的，显示更加频繁的BAF250a丧失在显示BAF250a丧失的子宫内膜的癌中，ARIDlA基因的突变状态未知然而在卵巢的透明细胞癌和子宫内膜样癌中，ARIDlA的突变与BAF250a表达关联良好尽管并非绝对。因此本发明人提出下述假说在具有BAF250a丧失的子宫内膜的癌中，大部分会在ARIDlA基因中携带突变在不显礻BAF250a丧失的病例中，可能SWI/SNF染色质重构复合物的其它组分会显示功能丧失此外，因为在一个等位基因上的ARIDlA丧失导致小鼠中胚胎致死导致BAF250a表達部分丧失的ARIDlA突变可能在肿瘤中有生物作用，且ARIDlA的作用可能在通过IHC对于总BAF250a丧失进行筛选时过低估计48对部分丧失进行的测量会需要精细评汾的方法(nuanced
scoring)或使用多通路免疫荧光。在该研究中本发明人并未在九个非典型子宫内膜增生病例任一个中鉴定出BAF250a丧失。十个非典型子宫内膜異位病例之一具有BAF250a表达的缺失该患者两年之后在该非典型子宫内膜异位的位置发展出子宫内膜样癌。该发现可以有两种解释首先，BAF250a缺夨并因此ARIDlA突变是前体病变演进为癌中的晚期事件或者研究的该特定病变已经完全恶性，尽管根据形态学基础并未识别为此无论如何，該病例以及在症状明显的癌中BAF250a丧失的频率，在正常组织和前体病变中丧失的罕见性(或缺乏)表明BAF250a表达的缺失是高度指示恶性肿瘤的特征實施例8.
0-有希望的实施例实施例8.1-说明ARIDlA和其它SWI/SNF突变在卵巢癌亚型中的频率和临床重要性将在150个透明细胞癌和350个其它卵巢癌中，使用靶向的新一玳测序分析大约30个基因的突变包括所有15个SWI/SNF基因。当可获得时将分析前体病变以评估SWI/SNF突变是否致癌中的早期事件。预测具有SWI/SNF突变的肿瘤將不会含有影响已知驱动类型I卵巢癌的途径的突变因此亦分析样品中与这些途径相关的选定基因的突变。经靶向重新测序分析的400个病例鉯及另外1500个卵巢病例(具有临床结果数据)用免疫组化方法分析以鉴定具有BAF250a表达丧失的病例，并确定是否这与ARIDlA突变状态相关如上所述，本發明人已证实大约39%的CCC在ARIDlA基因中携带突变其它两个病例在其它SWI/SNF复合物基因中具有突变。扩大该观察的范围在较大的卵巢癌群C400个病例，包括该疾病的所有病病理亚型)中确定ARIDlA突变和其它15个编码SWI/SNF复合物蛋白的基因的突变26'49以确定该复合物在卵巢癌中如何被频繁扰乱。预测SWI/SNF复合物Φ的改变代表具有根本重要性的致癌机理其与之前在卵巢癌中鉴定出的分子途径不同。该预测将通过评估数种已知涉及卵巢癌的基因的突变状态来确认预期染色体稳定的I型卵巢癌能进一步归类为两个组(i)在已知致癌途径中具有突变的癌症和(ii)具有影响染色质重构的突变的癌症。用免疫组化以在400个测序病例以及1500个其它卵巢病例中评估BAF250a表达用代表所有亚型的400个冷冻卵巢肿瘤样品的DNA进行靶向重新测序。所有病例將具有相伴的种系DNA来源大约150个这些样品将是CCC，而剩余250个将包含其它卵巢癌亚型(50个子宫内膜样150个晚期重症,25个低级重症和重症边缘,和25个粘液样和粘液样边缘)。所有250个代表非CCC亚型的肿瘤加上35个CCC将从位于Vancouver
Anglesio博士使用155个CCC病例，将可以以8%或更少的误差界限(95%置信区间)确定CCC中的突变比例对于BAF250a蛋白表达的免疫组化分析，除了上述的400个样品之外将会检查另外1500个装配在组织微阵列中的卵巢癌样品。这些组织微阵列包括大约250個CCC其它病例代表其它卵巢癌亚型，并已经如前所述4’5°。此外，将分析50个推定的CCC前体病变即子宫内膜异位和非典型子宫内膜异位。将優先考虑如上所述用于靶向测序的肿瘤的病变其它病例将来自
BRCA1，和BRCA2进行测序总体而言，这些包括406个外显子和涵盖120kb的内含子外显子边界序列为了达成此，将使基因组DNA文库富含靶基因其将通过下一代测序进行分析。替代性的方法吸引力较低因为高通量Sanger测序昂贵且由于間质污染或肿瘤内杂合性而对于在少于15%的等位基因中发现的突变不那么敏感，多聚A+转录组的测序不会检测导致无义介导的mRNA衰变的突变而苴全外显子组(exome)测序将会过于昂贵。本发明人已从超过300个样品中提取DNA,且将使用QiagenMagAttract
试剂盒于Qiagen M48机器人上进行其它提取DNA的定量将使用Quant_iT dsDNA HS测定试剂盒和Qubit 熒光计(Invitrogen)在基于平板的文库构建之前进行。剪切的基因组片段的文库将在96孔板中使用Covaris E210声处理平台和Biomek FX液体处理器构建文库构建以I U g的DNA起始，将其自动地I)剪切至
,4)多聚A加尾,5)连接至有条码的接头,和6)用生成克隆簇所需的序列的特异性寡核苷酸进行PCR扩增一旦构建，将文库汇总(在单轮中多達94个样品)并通过固相或液相捕捉探针富集。祀富集的有效方法包括,用定制的Agilent和Nimblegen固相和溶液相捕捉平台然而，迄今为止这些平台并未針对多通路样品捕获得到验证，且我们需要在各个单独的捕获实验中检查这400个样品其成本过于昂贵。因此将使用由Febit开发的用于S0LiD
3. 5测序平囼的固相微流动捕获平台(分别为Febit Biomed Gmbh和AppliedBiosystems)。该基于FebitHybSelect 微点阵的捕获方法通过将DNA样品与微流动芯片(Geni0mTMBi0Chip)51上由光活化的原位合成生成的特异性寡核苷酸杂交来选择性地捕获复杂基因组文库的序列片段。每个Geniom
Biochip含有8个可单独寻址(addressable)的阵列每个包含>15，000个捕获探针，其根据不同的数量和大小的特征而区段化特征的数量、密度和探针长度可定制，高至最多800kb每阵列十二个有条码的SOLiD 测序文库汇总用于每个阵列(每个GenioM Biochip有96个文库)，并在Geniom emPCR)富集，和在S0LiD 3.
5平台上进行测序将对每个大量emPCR进行在SOLiD 平台上运行的工作流分析(WFA)以确保信噪比在规格之内。一旦批准将使用emPCR进行大规模的珠沉积，靶向每载玻片 5亿读取结果每次运行10亿读取结果。数据分析图像加工至颜色辨识将在装置上进行且所得的文件将与参照人基因组(NCBI build 36.1, hgl8)使用 Bioscope vl. 01
(AppliedBiosystems)比对。在所得比对中的变体将使用diBayes包(Applied Biosystems)检测杂合子或非参照纯合子存在的可能性将使用之前SNP为“错误颜色辨识”、“位置错误”或“探针错误”可能性进行衡量。此夕卜将独立于diBayes方法通过将所有在颜色空间中的读取使用Mosaik比对程序(http: //bioinformatics, be.
edu/marthlab/Mosaik)比对来分析数据。该算法对于竞争性方法具有多个优势其使用带式Smith-Waterman方法进行比对,其更可能检测出插入和缺失,其利用颜色空间读取的所有优势且可更加不易于发生错比对。而且Mosaik无瑕地转化回碱基空间，并因此允许我们利用本发明人已就SNF检测开发的癌特异性框架称作SNVMix
56，其用于发现卵巢中的颗粒细胞肿瘤\和在小葉乳腺癌中分析基因组范围突变演化25在比对之后，我们将预测SNV并针对已知SNP的数据库对所有非同义蛋白编码预测进行相互参照以丰富对於体细胞变体的结果25。下文中所有剩余的非同义SNV和蛋白编码插入和缺失将称作体细胞突变候选(SMV)。SMV将通过在肿瘤和正常DNA中在Illumina
GAllx机器上进行靶姠超深扩增子测序来验证25预期该方法产生等位基因频率信息，并足够敏感以确认SMC甚至存在于极少数细胞中的那些。将读取与人参照基洇组使用Maq
0.7.1比对并将使用二项式精确验证继以使用Benjamin1-Hochberg方法对多重比对进行校正来评估变体。所有变体在肿瘤中但非正常情况下统计学上显著哋存在的位置将视为经验证的体细胞突变一旦完成了测序，将使用所述数据以鉴定并定量所有突变潜在突变的验证将通过来自肿瘤来源的DNA的PCR扩增子的illumina测序来进行25。将对匹配的正常DNA就所有经验证的突变的存在进行评估以确定相比于种系状态的体细胞状态估计在已经测序嘚基因中每个病例会有五个潜在的突变(因此在400个病例中有2000个突变。本发明人对于已知癌基因已有工作引物组并估计需要另行开发200个引物組以验证SWI/SNF基因中的突变。将所有突变的扩增子置于两个集合中用每个生成文库以便在Illumina
Gllx分析仪的单泳道上运行。将来自正常和肿瘤DNA的扩增孓汇入分开的文库以消除条形码化的需要若在多个病例中发现完全相同的变化，则这些将通过Sanger测序来验证在其中发现ARIDlA突变的情况下，將使用FISH评估在第二等位基因处的LOH若HybSelect方法并不如上述概括那样运行，则将视需要使用替代性测序策略将使用对选择的扩增子进行的基于Illumina的測序或进行Sanger测序。若使用基于Sanger的测序则分析的病例数将减少至100，这是由于与该方法相关联的成本增加实施例8.
2-对卵巢癌中BAF250a表达的频率嘚验证如上所述，本发明人已阐明了 ARIDlA的突变状态与BAF250a表达相关联使用针对BAF250a(克隆3H2Abgent
Inc.)的ARID域的C端的111个氨基酸区(氨基酸)的小鼠单克隆抗体进行了上述實验。因为该抗体靶向蛋白质的中间区因此甚至当C端的无义突变导致蛋白的截短形式时仍可能存在阳性染色。因为数个本发明人鉴定出嘚突变落在C端内(图2)本发明人正在开发针对BAF250a的C端特异性抗体。所述C端特异性抗体将用于对所有病例重新进行免疫染色具有错义突变或框內缺失的病例将不会期待显示BAF250a表达的缺失(无论使用哪个抗体)。实施例8.
(由ARIDlB编码)的表达因为SWI/SNF复合物无法同时含有BAF250a和BAF250b，预期排除BAF250a会与BAF250b增加相关基于如上所述的RNA-seq数据，似乎ARIDlB表达水平不受ARIDlA中的突变影响并事实上当在所有癌症类型之间比较时是不变的。然而为了确保BAF250b蛋白表达不洇为BAF250a缺陷而增加，将所有BAF250a阴性病例就BAF250b的表达进行免疫染色因为SffI/SNF复合物无法同时含有BAF250a和BAF250b，这可能会导致BAF250a的缺乏对应于含BAF250b复合物的富集这會具有功能性后果，因为已显示BAF250a排除特异性抑制细胞周期停滞而BAF250b对细胞周期停滞无作用52。此外将会对所有组织微点阵进行BRM、BRG1和BAF47免疫组囮。将会对具有未解释的BAF250a、BRM,
实施例8. 4-统计学分析具有约150个CCC病例对于ARIDlA突变的速率的确定可评估至土 10%以内。对400个卵巢癌肿瘤的分析将会允许检測病例或分子定义的亚型之间在突变率方面的15%的差异(80%功能水平(power
level))将SWI/SNF基因中的突变频率使用Fisher精确检验在癌症亚型之间比较。将会通过与患者結果和肿瘤分期相关联来确定具有ARIDlA突变或表达丧失的CCC是否具有明显的临床表型将会使用对数秩检验和Kaplan Meier图来评估存活特征方面的差异45°。与临床和生物标志物数据之间的联系将用卡方检验和列联表来评估。实施例8.
6-确认ARIDlA中的突变是致癌中的早期事件在所有发现SWI/SNF基因内的突变的情況下将会通过对于BAF250a表达的免疫组化；对于基于染色体的LOH的FISH ;和激光捕捉显微解剖(LCM)接着进行克隆化PCR产物的Sanger测序以评估ARIDlA突变状态分析推定的前體病变(当存在时)。该方法已经用于上述讨论的病例CCC23实施例8.
6-在CCC衍生的细胞模型中确定ARIDlA突变的功能性后果在透明细胞癌细胞和异种移植小鼠模型中确定了
ARID1A(野生型，丧失和突变体)如何影响细胞生长和存活ARIDlA突变对于蛋白-蛋白相互作用的作用将会使用共免疫沉淀实验接着进行质谱來确定。为了确定ARIDlA突变是否影响至BAF250a靶的募集将会使用染色质免疫沉淀与新一代测序的组合(ChlP-seq)。将会使用基因组范围核酸酶可接近性测定来驗证在染色质免疫沉淀实验中鉴定出的SW1-SNF-染色质相互作用(图22)发明人开发了来自V0A867
ARIDlA (867CL-ARID1A-WT)。为 了 阻止由于BAF250a C端GFP融合而对BRGl结合的破坏将具有GFP的载体通过IRES位点(内部核糖体进入位点)表达，并使用BAF250a抗体验证表达将这些ARIDlA突变体和野生型构建物包装入pLVX-Puix)慢病毒表达载体，将会用该载体感染867CL细胞将會使用嘌呤霉素和/或就GFP进行流式分选(flow
软件将差异表达的基因匹配于途径。亦将会使用这些数据验证ChlP-seq结果实施例8. 7-ARID1A对细胞周期和生长的作用將会在体外就生长和细胞周期活性来分析这三种同基因和亲本867CL细胞。将会使用MTT (3-45- 二甲基噻唑-2-基)_2，5- 二苯基四唑溴化物3-(4，5-dmethyIthiazol-2-yl)-25-diphenyl tetrazolium
bromide)测定来衡量作为線粒体活性的函数的增殖状态53。作为第二种对细胞存活的测量将会使用细胞集落形成测定，其评估导致减少的集落形成的细胞周期停滞戓细胞死亡54因为ARIDlA的排除在细胞周期抑制中起作用52，将会通过测量组入DNA的[3H]胸腺嘧啶的DNA合成来评估细胞周期活性55为了进一步阐明ARIDlA体内的生粅功能，将亲本867CL细胞与三种衍生的同基因细胞一同使用异种移植物肾下胶囊技术(xenograft
time),这将会进一步支持ARIDlA在CCC中充当肿瘤抑制物如果异基因细胞系不能成功地从867CL细胞创建，选其它ARIDlA-裸细胞作为有效备选I)上述实施例中测序的丧失ARIDlA表达的9个CCC细胞系中任一个或2)IOSE (永生化卵巢表面上皮)或HCTl 16细胞，稳定表达慢病毒ARIDlA ShRNA0初步数据证明HCTl
8-SWI/SNF复合物的免疫沉淀发明人预测867CL和867-载体细胞将会在如上所述的细胞周期和生长测定中产生完全相同的结果若确实如此，则将会得出结论即载体不具有作用，并将仅会使用867CL细胞进行剩余实验对于蛋白组成(在MS实验中)和染色质结合(在ChlP-seq实验中)的评估，需要对SWI/SNF复合物进行免疫沉淀(IP)IP实验将会从无效(867CL)、突变体(867CL-ARID1A-AL2007)和野生型ARIDlA
A301-047A)获得，并将对其进行测试以选择产生最干净结果的抗体作为SWI/SNF复合物必须含有BAF250a、BAF250b或BAF180之一，ARIDlA丧失或突变可表现为野生型BAF250a复合物的急剧减少和含BAF250b或BAF180的复合物的增加。ARIDlA突变的第二种后果可为SWI/SNF复合物内蛋白组合的妀变这些突变的第三种后果可为对于SWI/SNF复合物的染色质靶的改变，其会影响基因调节这些将会使用如下所述的MS和ChlP-seq实验的组合进行调查。實施例8.
MRM)MS分析技术以在上述经IP的SWI/SNF复合物中对15种已知的SWI/SNF复合物的组分的指纹肽进行定量(图1)26MRM是定量的、高度敏感的、三重四极MS扫描技术，其用於定量从特定肽(来自感兴趣的蛋白)散发的MS/MS片段(称作跃迁)56对于15个待测量的蛋白质，将会涉及对于从 MS 谱数据库(http://www. peptideatlas. org/,
http://gpmdb. thegpm. org/)获得的胰蛋白酶肽的MS/MS谱涉及MRM测萣将会对于所有SWI/SNF蛋白选择一个肽。每个将会在人蛋白质组是独特的并具有鲁棒的(robust)MS/MS信号，除了在BAF250a的情况下将会选择三种肽(C端、中央和N端)從而使得将会检测到任何截短型式的BAF250a将会在ABI 4000QTrap
MS上收集MS数据，ABI4000QTrap MS可在单个多通路测定中使用每个肽三个跃迁来测量所有17个肽；对于每个肽的跃遷将会在MS分析中出现在同一张色层谱上将会使用MultiQuant
(ABI)计算色层谱中每个跃迁的信号容量。将对于每个肽的跃迁累加并用其计算样品之间SWI/SNF蛋皛的相对改变。数值将会针对起始细胞数归一化并将会进行三个独立的重复实验以允许进行统计学分析。867CL对867CL-ARID1A-WT或T0V-21G细胞的比较将会鉴定出与總体SWI/SNF复合物组成的改变和相关于CCC中ARIDlA丧失的BAF250b和BAF180复合物组成的改变相联系的变化预期
来验证。使用针对SWI/SNF核心蛋白的抗体对来自细胞核提取物嘚SWI/SNF复合物的IP和通过MS/MS的分析已成功地鉴定出了所有待监视的核心蛋白5758，因此更加敏感的MRM技术亦应会是成功的MRM分析技术重复的差异小于5%，洇此预期将会在SWI/SNF组分的总体汇集中能够检测出各SWI/SNF蛋白相对水平的较小变化(10-20%)所述实验将无法区分SWI/SNF复合物和不同组成，但应能检测出由于BAF250a的喪失所致的SWI/SNF复合物组成的主要调整若数据鉴定出强烈的变化，将会进行用于在BAF250a突变系中表征各个SWI/SNF复合物的实验使用生化大小分级层析囷MRM测定，将会确定各个SWI/SNF复合物及其组分的摩尔化学比例实施例8.
10-ARID1A与染色质的相互作用将会进行实验以确定ARIDlA中的突变是否导致明显的SWI/SNF-染色质楿互作用。ARIDlA突变对BAF250a介导的反式激活的作用将会使用萤光素酶报道基因构建体来测定将会使用ChlP-seq和核酸酶保护测定59来评估野生型和突变体BAF250a蛋皛如何差异地与染色质相互作用。ARIDlA突变对反式激活的影响将会获得在萤光素酶报道基因上游含有多个糖皮质激素受体响应元件的XG46TL质粒将其瞬时转染入四个细胞系(867CL，867CL-ARID1A-WT,
L2007T0V-21G)。将会用地塞米松处理细胞以刺激糖皮质激素其与SWI/SNF复合物协同作用激活转录；这可通过如前所述对萤光素酶进行定量来评估6°。使用该报道蛋白系统，可直接评估ARIDlA突变对反式激活的作用。ARIDlA突变对BAF250a与DNA相互作用的作用ARIDlA突变对SWI/SNF复合物结合于染色质嘚作用将会使用ChlP-seq评估，以鉴定出与SWI/SNF复合物在上述四个细胞系中相互作用的启动子将会如上所述一式两次进行IP。之前已经描述了
ChlP-seq及其相关汾析所需的工具61选择的覆盖(每文库飞Gbp)将会获得寻找高置信峰同时维持预算范围所需的冗余度。将会用甲醛处理细胞系以交联DNA及其相关蛋皛将会对澄清的细胞裂解液进行声处理以剪切染色质，然后将其与选定的SWI/SNF抗体温育接着进行过夜Protein
L2007，以及ARIDlA-无效(867CL)相同的序列将会从分析中詓除数据将会用MEME64分析以检测任何过度表现的(over-represented)基序,并用TRANSFAC分析以发现已知的转录因子结合位点。最后将会鉴定接近峰的基因和高度保守的基因间位点。预期在1000个峰的数量级会发现0. 05的假发现率(false discovery
rate)将基于其位置(即祀基因上游的启动子区)，可由这些区转录调节的基因的重要性和通过从靶向测序和MS实验获得的数据来将这些区域进行优先级排序(prioritize)。该方法会允许在初级数据组中鉴定出高置信DNA-蛋白相互作用并消除由于散发的或非特异性DNA-蛋白结合所致的信号。感兴趣的相互作用将用正交技术(orthogonaltechnique)包括BAF250a与萤光素酶报道基因上游选定的启动子的相互作用来进行验證为了确定是否来自ChlP-seq实验的发现受牵涉的基因的表达变化所支持，将从来自867CL、867CL-载体、867CL-ARIDIA-WT
Bioconductor统计学程序包就不同基因表达进行分析65简言之，edgeR模型根据负二项分布读取对于具体基因的计数数据使用过度散布的Poisson模型进行差异性基因表达分析，该模型能够说明技术差异和生物学差異二者所有显示差异性表达和在其启动子区显示伴随的差异ChlP-seq峰检测的基因将选为受ARIDlA突变影响的候选基因。ARIDlA突变对体内核体重构的作用无核体DNA对低浓度核酸酶的消化敏感ARIDlA突变可反映为核酸酶敏感性的变化。将会评估20个经ChlP-seq鉴定出的ARIDlA靶的核酸酶敏感性重点关注已知为药物靶嘚基因或癌基因，它们的ChlP-seq数据对应于经RNA-seq测出的基因表达中的变化简言之，将来自CCC细胞系的细胞核用低浓度的微球菌核酸酶或DNAaseI处理导致僅无核体区的DNA被降解。剩余的受保护的DNA用特异于每个靶的引物测序在有ARIDlA突变时未鉴定出SWI/SNF组成或DNA结合中的变化的情况下，额外评估是否这些突变导致组蛋白的遍在蛋白化的改变因为近来已证明，BAF250b(ARIDlB的基因产物)是组蛋白H2B在赖氨酸⑷120处的E3遍在蛋白连接酶66实施例8.
11-在具有ARIDlA突变的CCC中治疗性靶的鉴定将会使用SiRNA文库鉴定对于表达突变体ARIDlA的细胞的存活是必需的基因。任何鉴定出的基因将会是用于开发具有ARIDlA突变的透明细胞癌嘚治疗剂的潜在靶将会在ARIDlA突变体透明细胞癌的异种移植小鼠模型中筛选siRNA文库。一种在癌症中鉴定出治疗靶的确立的方法是检索“合成致迉”以称作条件遗传学(conditional
genetics)。合成致死的原型实例是BRCAl或BRCA2缺陷条件下的PARP抑制67’68为了限定将会在携带ARIDlA突变的肿瘤中普遍独特地有效的治疗靶，將会使用构建的siRNA/高内涵(high content)筛选方法进行合成致死(生活力)筛选完全整合的siRNA筛选设施配置有机器人、流体处理和INCELL
1100高内涵成像仪。本发明人将会使用公开的siRNA/高内涵多参数筛选方法69以测量七个相关于细胞生活力、增殖、细胞周期和相关检查点(checkpoint)的表型参数筛选的siRNA文库将会是Hannon/El ledge慢病毒-shRNA人攵库(大约66，000个构建体)和Dharmacon
siGenome汇集,代表大约22000个基因座。两个文库均内部地就96孔和384孔筛选格式化优选地，将会使用siRNA文库汇集进行在25nM的筛选若甴于任何原因发现siRNA转染是困难的，则将会使用shRNA文库将会使用867CL、867CL-ARID1A-AL2007和867CL-ARID1A-WT细胞。若发现使用这些细胞系进行的筛选是无法追踪的则将会使用HCT116细胞中的ARIDlA的同基因敲除作为第二选择(图8)。将细胞系在384孔板中逐对比较每个转染平板将会含有对于转染效率，转染毒性和siRNA有效性以及表型基线测量的对照。在初级筛选中将会使用所有22，000个siRNA汇集/66000个shRNA
(代表目前为止构建的全人基因互补物)该筛选将会在384孔平板中对三个同基因细胞系进行一式三次。将会使用对照平板(所有平板用相同的非革巴向siRNA转染)以线性混合作用模型(linear mixed effects
model)来校正位置作用将会用25nM的siRNA汇集或慢病毒颗粒視需要以3的MOI来进行转导。每个siRNA汇集或shRNA对细胞生活力、细胞形状和转导效率的作用将会在转染后4日进行测量将会使用来自每个筛选平板的對照孔(含有PLKl
siRNA)来衡量转导效率。所有条件将会一式三份进行评估以允许对于差异的充分评估在如上所述的图像区段化和定量之后，将会用線性混合作用模型7°分析数据以减少筛选矫作物如孔板边缘作用(wellplate edgeeffect),试剂分配器移液尖作用(reagentdispenser pipette tip
effect)等等将会使用Benjamin1-Hochberg方法对p值进行多重比较调整，并视需要将会使用经验性Bayes收缩(empirical Bayesshrinkage)对于作用估计进行多重比较调整71’72为了测量合成相互作用的程度，将会根据线性模型调整的值计算出相互作用指数(对于给定siRNAWt表型大小对突变体表型大小定标的比例(scaled
ratio)。将会对基于排序的合成作用大小和排序的P值最高5%的候选shRNA祀进行分拣(triage)以供随访验证在初级筛选和初始命中的选择之后，将会对其分别进行重新筛选(汇集解卷积)以供最大程度的区分重新验证的siRNA亦将会与qRT-PCR(定量逆转录PCR)
—同僦靶转录物进行测定以确定是否表型与转录物敲低的程度分离。在这些过滤之后仍留下的siRNA将会通过GO-条件和结构等级(GO-termsand structural
class)进行分组以供进一步隨访。尽管上文讨论了多种例示性方面和实施方案本领域技术人员将会知道其一些修饰、排列、添加和亚组合。因此意欲所附权利要求囷之后加入的权利要求不受本公开中列出的优选实施方案和实施例的限制但应给予其与本说明书整体相一致的最广泛解释。参考文献1. Shah SP, Kobel M, Senz J, Morin RD, Clarke BA, Wiegand
1.BAF250a表達的缺乏或ARIDlA作为生物标志物在确定子宫内膜异位进展为卵巢癌的风险中的用途
2.BAF250a表达的缺乏或ARIDlA作为生物标志物给遭受卵巢癌的受试者提供預后的用途。
3.BAF250a表达的缺乏或ARIDlA作为生物标志物在确定卵巢癌是否很可能响应标准的化疗剂中的用途
4.权利要求3中限定的用途，其中所述标准囮疗剂包括钼或紫杉烷治疗
5.权利要求1-4中任一项限定的用途，其中所述癌是卵巢的透明细胞癌子宫内膜样癌，或子宫癌
6.一种用于确定受试者的子宫内膜异位是否很可能进展为癌的方法，所述方法包括下述步骤 获得子宫内膜异位的组织样品；和 分析样品的BAF250a表达 其中BAF250a表达嘚缺乏表示所述子宫内膜异位有可能进展为癌。
7.一种用于确定癌症受试者的预后的方法所述方法包括下述步骤 获得所述癌的组织样品；囷 分析样品的BAF250a表达， 其中BAF250a表达的缺乏表示不良预后
8.一种用于确定在癌症治疗中标准的化疗剂是否很可能有效的方法，所述方法包括下述步骤 获得所述癌的组织样品；和 分析样品的BAF250a表达 其中BAF250a表达的缺乏表示标准的化疗剂不太可能有效。
9.权利要求6-8任一项限定的方法其中分析样品的BAF250a表达的步骤包括使用对BAF250a具特异性的抗体进行的免疫组化。
10.一种用于确定受试者的子宫内膜异位是否很可能进展为癌的方法所述方法包括下述步骤 获得子宫内膜异位的组织样品；和 分析样品中ARIDlA基因突变的存在， 其中ARIDlA基因中显著突变的存在表示所述子宫内膜异位有可能进展为癌
11.一种用于确定癌症受试者的预后的方法，所述方法包括下述步骤 获得所述癌的组织样品；和 分析样品中ARIDlA基因突变的存在 其ΦARIDlA基因中显著突变的存在表示不良预后。
12.一种用于确定在癌症治疗中标准的化疗剂是否很可能有效的方法所述方法包括下述步骤 获得所述癌的组织样品；和 分析样品中ARIDlA基因突变的存在， 其中ARIDlA基因中显著突变的存在表示标准的化疗剂不太可能有效
13.权利要求10-12中任一项限定的方法，其中分析样品中ARIDlA基因突变的存在的步骤包括对ARIDlA基因进行测序
14.权利要求13中限定的方法，其中对ARIDlA基因进行测序包括Sanger测序或对由ARIDlA基因产苼的mRNA进行测序
15.权利要求10-12中任一项限定的方法，其中分析样品中ARIDlA基因突变的存在的步骤包括使用突变检测方法
16.权利要求15中限定的方法，其中分析样品中ARIDlA基因突变的存在的步骤包括使用基于PCR的检测方法或荧光原位杂交
17.权利要求10-16中任一项限定的方法，其中ARIDlA基因中的突变包括無义突变或显著的错义突变
19.一种用于确定子宫内膜异位是否可能进展或转化为癌，用于确定癌症受试者的预后或用于确定在癌症治疗Φ标准的化疗剂是否很可能有效的方法，所述方法包括下述步骤 获得子宫内膜异位或癌的组织样品；和 分析样品中作为SWI/SNF复合物组分的蛋白質的表达；
其中作为SWI/SNF复合物组分的至少一种蛋白质的表达的缺乏表示子宫内膜异位有进展或转化为癌的风险预后不良，或标准的治疗剂鈈太可能有效地治疗该癌
21.权利要求19中限定的方法，其中作为SWI/SNF复合物组分的蛋白质包括下述一种或多种BRG1BAF180，或 BAF170
22.权利要求19-21中任一项限定的方法，其中分析样品中作为SWI/SNF复合物组分的蛋白质的表达的步骤包括免疫组化
23.一种用于确定子宫内膜异位是否可能进展或转化为癌，用于確定癌症受试者的预后或用于确定在癌症治疗中标准的化疗剂是否很可能有效的方法，所述方法包括下述步骤 获得子宫内膜异位或癌的組织样品；和 分析样品中一种或多种作为SWI/SNF复合物组分的蛋白质的编码基因中突变的存在；
其中至少一种所述基因中的显著突变表示子宫内膜异位有进展或转化为癌的风险预后不良，或标准治疗剂不太可能有效地治疗该癌
24.权利要求23中限定的方法，其中分析样品中突变的存茬的步骤包括对样品中的所述一个或多个基因进行测序
25.权利要求23中限定的方法，其中分析样品中突变的存在的步骤包括使用基于PCR的检测方法或荧光原位杂交
26.权利要求23-25中任一项限定的方法，其中所述一种或多种基因中的突变包括无义突变或显著错义突变
28.权利要求23-25中任一項限定的方法，其中所述一种或多种基因包括SMARCA4PBRM1，或 SMARCC2
30.权利要求6-29中任一项限定的方法，其中所述癌是卵巢的透明细胞癌子宫内膜样癌，戓子宫癌
31.权利要求8、12或23-30中任一项限定的方法，其中所述标准的化疗剂包括钼或紫杉烧治疗
32.一种用于筛选有ARIDlA基因的一个或多个突变的细胞存活所必需的基因的方法，所述方法包括下述步骤 提供具有ARIDlA基因突变的细胞系； 使用基因文库进行合成性致死筛选；和 鉴定有ARIDlA基因突变嘚细胞系的存活所必需的基因
36.一种用于筛选有作为SWI/SNF复合物组分的蛋白质的编码基因一个或多个突变的细胞的存活所必需的基因的方法，所述方法包括下述步骤 提供具有所述一个或多个基因的突变的细胞系； 使用基因文库进行合成性致死筛选；和 鉴定对于在所述一个或多个基因中具有突变的细胞系的存活所必需的基因
38.权利要求36中限定的方法，其中所述一种或多种基因包括SMARCA4PBRM1，或SMARCC2
42.—种开发可用于处理癌症嘚治疗剂的方法,其包括筛选对权利要求32-4之一的方法鉴定出的任何基因的表达进行抑制的试剂，或对权利要求32-41之一的方法鉴定出的任何基因所编码的蛋白产物的功能进行抑制的试剂
43.一种治疗癌症的方法，包括将治疗量的由权利要求42中限定的方法鉴定的试剂施用于患者
44.权利偠求43中限定的治疗癌症的方法，其中所述癌症包括卵巢的透明细胞癌、子宫内膜样癌、或子宫癌
公开了与卵巢癌，特别是透明细胞癌、孓宫内膜样癌和子宫癌相关的新颖的生物标志物和靶在构成SWI/SNF染色质重构蛋白复合物一部分的蛋白质的编码基因包括ARID1A中的突变，或此类蛋皛包括BAF250a的表达的缺失可用于衡量子宫内膜异位会进展或转化为癌症的可能性，对于患有癌症的患者提供预后评估常规治疗是否可能对於癌症有效，和/或在合成性致死筛选中鉴定用于治疗癌症的新颖的靶和治疗物
D.G.亨茨曼, M.马拉, K.威甘德, M.赫斯特, S.P.谢 申请人:不列颠哥伦比亚省癌症汾社
