骨髓间充质干细胞/骨髓间充质干细胞
&&& 骨髓间充质干细胞 Bone Mesenchymal Stem Cells& [B]
干细胞是一类未分化的细胞或原始祖细胞，其最显著的特征是具有慢周期性 和自我更新能力【‘一3]，在合适的条件下可以分化为机体内的许多不同细胞。根据细 胞的发育阶段，干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞，后者又可根据来源不同 分为造血干细胞、神经干细胞和间充质干细胞 (Mesenehymalstemcells，Mses)等。 其中，BMSCS由于其来源广泛，易于分离培养，并且具有较强的分化潜能和可自 体移植等优点，越来越受到学者们的青睐，被认为是不久即将被引入临床治疗的 最优干细胞[4]。 1、BMSCS的生物学特性(1)来源BMscS源于中胚层l5]，存在于全身结缔组织和器官间质中，其中 以骨髓中含量最为丰富[6]是骨髓中德非造血胞，由于其在早期分离培养时对 塑料培养材料的贴壁特性，过去被称为集落形成单位成纤维细胞或塑料贴壁细胞。 同时它也是骨髓中的造血结构性和功能性支持细胞，因此又被称为骨髓基质细胞。 BMscs在骨髓中含量极少，仅占骨髓细胞比例的0.01一1/万l7]，并随年龄的增加而 细胞数量逐渐减少。而且在生理条件20%为18一9]。BMscS外观呈梭形、 漩涡状生长，具有很强的自我复制和横向分化潜能，在体外特定的诱导条件下可 分化为骨、软骨、神经、脂肪、肌肉及肝等多种功能细胞，对间质组织如骨、软 骨、肌键、脂肪和骨髓基质的再生也有重要作用[l0一‘6]。由于BMscS相对缺少免疫 ，培养技术简便，体外增殖迅速，并可冷冻保存，因此己成为细胞及基因治 疗研究中的种子细胞，具有潜在的临床应用价值。 (2)表型特征通过相差显微镜观察发现95阶98%体外培养的BMSCs团呈扁 平的纺锤形，与成纤维细胞类似[l7一’9J。BMscs有造血及间质细胞 (CD166)/基质细胞(CD29、)抗原和细胞外基质受体的表达，对造血干细胞 有支持作用120]。同时，BMscs具有多种表面标志分子，可表达细胞因子(IL一6、 IL一7、IL一11、IL一8、IL一12、SCF、LIF、M一CSF等)及细胞因子受体(IL一IR、IL一3R、 IL一7R、G一CSFR、pD一GFR等);BMSCS抗原表型并不均一，具有间充质、肌肉和 内皮细胞的特点，即BMSCs可以表达多种豁附相关分子，如整合素亚基a3、a4、 p等。它对表面抗原sBlo、sHZ、SH3、sH4、eD29、eD7r、eDlo6[2‘]等均呈阳 性反应，对CD44更是呈现出高表达特征。而对于造血干细胞的CD34、抗 原均呈阴性反应122挂日目前为止，尚未发现公认的BMsCs特异性表面抗原。 (3)生理功能研究表明，BMscS有支持造血细胞和调节免疫的功能[23]它可 以与其他间充质干细胞构成结缔组织支架，同时分泌即细胞外基质蛋白， 调节造血细胞的增殖和归巢。在骨髓中，红细胞、白细胞、血小板等细胞的分化、 成熟都要依赖于与 BMSCS和细胞外基质及血管组成的微环境的接触，包括造血细 胞通过表附分子与其直接接触和其通过分泌多种细胞因子对造血细胞的分化 成熟进行调控。多项研究结果显示，BMSCs可能是造血微环境中的重要细胞成分。 对于它的调节免疫作用也有许多相关的实验，例如:94年Ishida等通过对自身免 疫小鼠的骨髓移植实验指出，BMSCS不仅可以防止免疫移植失败，而且可以在T、 B淋巴细胞的免疫调节中发挥重要作用。 2、BMSCS的分离培养对于BMSCS的体外分培养，目前无外乎有一下四种方法:贴壁法、密度梯度 离心法[24l、流式细胞术[25l和免疫磁株分选[26]。①.贴壁法也称全骨髓法，由 Fridenstein在 1987年建立。它主要是根据间充质干细胞贴壁生长而造血干细胞悬 浮生长的特性，抽取骨髓后直接加入L一培养液制成细胞悬液，以合适的细 胞浓度进行培养接种，随时间延长，不贴壁的造血等细胞液被清除，从而得 到较纯化的BMSCS。通过贴壁法分离得到的细胞分化潜能较好，缺点是所得的细 分复杂、细胞纯度不足，且培养成功率也很低。②.主要是根 据骨髓中细胞成分的比重不同，采用不同密度的percon液或淋巴细胞分离液提取 骨髓单个核细胞进行培养，得到纯化的BMSCS。此种方法简便易行，对细胞活力 影响较小，是目前最常应用的分离方法。③.流式细胞仪法主要是根据BMSCS细 胞体积较小、表面带有或相对缺少抗原成分进行正选或负选，从而获得相对纯化 的BMSCS。这种方法分离结果令人满意，但实验条件要求高，操作复杂，需要骨 髓量大，对细胞活性影响也很大。④免疫磁株法:即应用包被磁株。经单抗体程 序分选BMSCS。它的分选效率较高，但仍没筛选到其特有的标记分子，尤其是影 响细胞活性，甚至可以导致细胞完全失活3、BMSCS的体外诱导分化BMSCs的体外诱导分化方法主要有两种:一是用抗氧化剂作诱导剂，如:2- 琉基乙醇(2一ME)、2%二甲基亚矾(DMSO)、丁经茵醚(BHA)和;二是 用生长因子作诱导剂，如:血小板衍生生长因子(PDGF)，表皮生长因子 p(EGF一内， 肝细胞生长因子 (PGF)和胰导素样生长因子一1[29]。体外实验中，在地塞米松、维 生素C、甘油磷酸醋条件下或细胞因子BMP一2或转化生长因子p作用下，BMscs 可转化为骨、软骨和脂肪细胞。V八〕rster等发现，TGF一B可以明显增加BMSCS的 增殖速度。V此Ikitani等报道，5一氮胞普和两性霉素一B或两性霉素一B单独作用可以 诱导BMSCS分化为成肌细胞。 4、BMSCS的可塑性BMSCS可以多向分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、成纤维 细胞及肝细胞等间叶细胞和其他胚层细胞，即具有可塑性。又加上它容易获得、 体外扩增10”倍以上而不丢失其多向分化潜能、外源基因易于植入并可整合到间 充质干细胞的基因组中，稳定表达而不影响其干细胞特性，植入反应较弱等独特 优点，因此，在组织修复和基因治疗方面的临床应用潜能越来越受到关注[30l。 (l)向成骨细胞分化种子细胞的选择是骨组织工程最基本、最关键的环节 之一。它的理想种子细胞应具备:取材容易，对机体损伤小;体外培养时增殖能 力强，能稳定表达成骨细胞表型;植入体内可继续成骨等特点口‘]。据此，Jaiswal 化了成骨的诱导系统，在BMSCs中加入成骨细胞分化培养基(20%的胎牛血 清、Znmol/Lp一甘油磷酸钠、soug/ml维生素C、lonmol/L地塞米松的DMEM培 养基)，3一4天后梭形细胞比例减少，出现多角形甚至长方形细胞，细胞排列紧 密，部分细胞呈多层生长。21天细胞染色发现有钙盐沉积，而未加诱导药的 对照组未见此变化。尤其是检测的ALP水平，诱导组ALP活性明显增加，而对 照组ALP活性仍持续较低水平。这些事实证明BMSCs可分化为成骨细胞用于治 疗骨损伤疾病。 (2)向软骨细胞分化在体外环境下，加入特定的诱导因子和条件，BMSCs 可以分化为软骨细胞。其中转化生长因子一印是最主要的诱导因子，生物活性强， 对多种细胞都有生物学效应。在软骨转化过程中，它可以促进软骨细胞合成蛋白 聚糖和11型胶原，并可以保持软骨细胞表型稳定。此外，地塞米松、胰岛素和维 生素C也在软骨细胞的诱导过程中起着重要作用。除了加入外源性的诱导因子， 也可以通过基因转染的方法来实现向软骨细胞的分化。即通过载体把外源基因导 入到BMSCS中，使其在体内长期表达，从而促使其向软骨细胞的分化。 (3)向心肌细胞分化1999年Makino等首次体外给予3umol/L的5一aza诱导 MSCS定向分化为心肌细胞获得成功，开创了MSCS体外诱导分化心肌细胞研究 的先河[32]。应用BM一Mscs替代梗死的心肌细胞、治疗心肌疾病已是近年来研究的 新课题[33一34]。其分化为心肌细胞的方式有两种:一是经5一氮杂胞营或两性霉素B 诱导分化，经此诱导三周后形成肌管结构，心肌特异性Tn一1和肌凝蛋白重链阳性， 说明已分化为心;二是将BMSCs置于心肌内微环境中四周后发现经标记 的BMSCS分化成了心肌细胞，并与周围心肌细胞形成缝隙连接而同步收缩。 (4)向神经细胞分化神经细胞属于终末分化细胞，损伤后不能再生，因此 需要寻找一种可以替代的细胞用于神经系统的治疗。众多关于BMSCS在特定条件 下可分化为神经样细胞的报道表明，BMSCs可作为神经系统疾病治疗的候选种子 细胞135]。2001年，Lu等建立鼠栓塞性大脑中动脉闭塞模型，然后将BMscS注入 纹状体内，实验组的神经功能恢复明显好于对照组。由此可见，BMSCS自体移植 治疗神经系统疾病是可行的。 (5)向肝细胞分化近年来的体内外实验证实肝细胞来源于骨髓干细胞、造 细胞或多能干成体干细胞是其原始祖细胞。在肝细胞生长因子(HGF)或表皮 细胞生长因子(EGF)的诱导下，BMscS可分化为肝细胞[36]。 2000年，Oh等[37]将肝细胞生长因子加入到体外培养的大鼠BMscs中，3周 后显微镜下可观察到细胞形态系肝细胞样，而且用检测白蛋白、 CK一8、CK一18等肝细胞特异性标志物呈阳性反应。此实验说明在体外BMSCS可 以诱导分化为肝细胞。 2003年介rai等[38]将zx一05个经绿色荧光蛋白()标记的BMseS从尾静脉 注入CCL4诱导的小鼠肝硬化模型中，一天后发现BMSCs定植于肝小叶门脉周围， 四周后25%的细胞是BMSCS，并横向分化为能分泌白蛋白的成熟肝细胞，而对照 组无此表现。实验结果提示，在肝脏损伤的情况下，BMSCS可横向分化为肝细胞。 (6)BMSCs与糖尿病对于糖尿病，无论是胰岛素依赖性还是非依赖性，目 前都没有根治性的治疗办法，大多都是依赖于口服降糖药和胰岛素的注射。美国 糖尿病学会表明，对于I型糖尿病，现今根治的唯一办法就是胰腺移植。但是胰 腺来源有限，且分化的p细胞在体外不能有效的繁殖[39]最近关于胰岛素移植成功 的报道[40]使人们对胰岛素介导细胞移植产生了兴趣。人们试图利用干细胞在体外 诱导分化为胰腺细胞，现今关于啮齿类动物和人类起源的胚胎干细胞治疗糖尿病 已经获得可喜成绩。据Leehner报道:成体组织中提取的干细胞有治疗糖尿病的 潜能，胰岛、肝脏和骨髓中含有几种潜在成人的p细胞或胰岛的祖细胞[4l]已有实 验证实成体干细胞是产生胰岛素细胞的潜在来源细胞，BMSCS存在可能分化为胰 岛细胞的可能。一旦BMSCs体外诱导分化为胰岛素的p细胞用于治疗糖尿病得到 肯定，将会是糖尿病治疗方面的一个新的里程碑。 5、BMSCS的临床应用目前，BMSCS作为细胞替代之来哦和基因治疗的载体已应用于临床，用来治 疗中枢神经系统病变，如帕金森病、老年痴呆症等，以及心肌缺血、周围神经损 伤、退行性关节炎等。 (1)在中枢神经系统疾病中的应用帕金森病是一种以一纹状体系 统的多巴胺能，导致分泌多巴胺递质降低，引起四肢僵硬，静止震颤 等锥体外系症状的疾病。Park等将基质细胞来源的神经营养因子(GDNF)转入到 森病模型鼠体内，发现转入神经营养因子的BMSCS对黑质细胞有保护作用， 这表明BMscS在中枢神经系统退化疾病中有治疗作用[42].它可以通过细胞替代弥 补中枢神经疾病或损伤引起的神经功能缺损，同时能分泌多种白细胞介素和干细 胞因子、造血调节因子等帮助缺血脑组织的功能恢复。因此，BMSCS的应用为中 枢神经系统损伤修复提供了新的治疗方法[43]。 (2)在心肌缺血疾病中的治疗作用有研究者用BMSCs移植来增强血管的发 生和改善心脏的局部缺血。将BMSCS体外诱导成的心肌细胞移植到心肌缺血的动 物模型体内。两个月后，植入的BMSCS在梗死区内呈现血管内皮生长因子的高水 平表达并伴有血流量的改变。它使肥大的肌细胞减少和左心室的收缩性明显改善。 这表明，BMSCS可以用于临床治疗心肌缺血。 (3)对损伤神经的修复作用Dez~[44]等将体外培养的BMscS转染绿色荧 光蛋白，移植入体内神经缺损处，最终BMSCs分化为具有神经膜细胞功能和性质 的细胞，并可以诱导细胞再生。从而达到修复受损神经的作用。 (4)临床治疗退行性关节炎疾病有临床报道，将体外培养的BMSCS自体移 植入病人的关节腔中，能够重新形成关节面。[45]等将体外培养的兔自体 BMSCS与纤维蛋白复合在一起入关节软骨缺损区，实验发现第2、4周，软 骨再生情况非常理想，缺损区内充满软骨细胞，第12周，细胞分化为典 型的透明软骨样结构。临床证明，BMSCS可以用于治疗退行性关节炎。 当然，BMSCS在其他方面也有治疗作用。如对于椎间盘的再生牙周组织的修 复146]等也已取得肯定的疗效。 6、存在问题及应用前景虽然BMSCS在骨、心肌、神经系统的治疗等方面的研究已经取得了很大的进 展，但对于该领域的研究尚处于探索阶段，很多问题有待解决: (1)对BMSCs本身特性的研究和在组织工程方面的利用研究，都希望利用纯 的干细胞成分，但实验证明体外分离的BMSCS均为各种细胞的混杂。如何才能更 有效地获得纯化地BMSCs，有待于对其细胞学特点和分化各阶段细胞标志物的研 究。 (2)BMSCS的增殖和分化的控制需要合适的条件。如何能既控制增殖、避免 29 ，又能在适当的时候开始所需路径的分化，还有待进一步研究。 (3)BMSCsI’司的相互作用、其与造血干细胞间相互作用、BMSCS与不同成熟 阶段的细胞的相互作用直接对其生长、分化产生影响，但目前这些作用的机制还 不清楚。 (4)对BMSCS在各种动力学条件下的组织改变还知之甚少，而BMSCS在骨 髓中及用于骨组织工程显然要受到周围环境的力的作用。对这方面的研究将促进 对该细胞的全面理解和有效利用。 (5)植入心肌或神经组织后的远期效果尚未得到有效评估。 尽管如此，干细胞与其他的种子细胞相比，仍具有不可忽视的优点，例如: 取材方便，有强大的增殖分化潜能，不存在免疫排斥反应147]，能在体外较稳定的 扩增等。因此，随着我们对BMSCS研究的进一步深入，它的优点将被充分挖掘， 它将作为一种新型的基因治疗的靶细胞，广泛应用于心血管和神经系统疾病的治 疗，解决肝移植、肝细胞移植和人工肝等治疗肝源短缺的问题148]，成为人类疾病 临床治疗方面的又一巨大突破。
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